Method Article
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Organik ve sulu çözücülerin arayüzünde, özel ampifilik elastin benzeri proteinler veziküller, lifler ve çevresel parametrelertarafından tetiklenen koaksivatlar gibi karmaşık supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Açıklanan montaj protokolleri, çeşitli kargoların kapsüllemesini sağlayan, tunable özelliklere sahip Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) verir.
Özel proteinaceous yapı taşları minimal hücreler, ilaç dağıtım araçları ve enzim iskeleleri gibi supramoleküler yapıların montajı için çok yönlü adaylardır. Genetik düzeyde ki biyouyumluluk ve ayarı nedeniyle, Elastin benzeri proteinler (ELP) biyoteknolojik ve biyomedikal uygulamalar için ideal yapı taşlarıdır. Bununla birlikte, farklı fizyokimyasal özellikleri ve iyi kapsülleme potansiyeli ile protein bazlı supramoleküler yapıların montajı zor olmaya devam etmektedir.
Burada küresel koaservatlar, lifler ve kararlı veziküller gibi supramoleküler protein mimarileri içine ampifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için iki etkili protokol salıyoruz. Sunulan montaj protokolleri, uyarlanabilir fizyokimyasal özelliklere sahip ELP'lere dayalı Protein Membran Tabanlı Bölmeler (PMBCs) oluşturur. PMBC'ler faz ayırma davranışını gösterir ler ve yönteme bağımlı membran füzyonlarını ortaya çıkarırlar ve kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini kapsülleyebilmektedirler. Ortaya çıkan PMBCs bir ilaç formülasyonu ve dağıtım platformu, yapay hücre ve bölümlü reaksiyon alanı olarak yüksek bir uygulama potansiyeline sahip.
Biyoteknolojik uygulamalar için supramoleküler yapıların montajı giderek daha önemli hale geliyor1,2,3,4,5. Koaservates, veziküller ve lifler gibi fonksiyonel mimarilerin istenilen fizikokimyasal özelliklere sahip bir araya toplanması için bileşenlerin fizikokimyasal ve konformasyonel özelliklerini anlamak ve kontrol etmek önemlidir. Doğada bulunan moleküllerin moleküler hassasiyeti nedeniyle, supramoleküler yapıların yapı taşları giderek lipidlere, nükleik asitlere veya proteinlere dayanmaktadır. Sentetik polimerlerle karşılaştırıldığında, proteinaceous yapı taşları genetik düzeyde acil supramoleküler yapılar6 üzerinde hassas kontrol sağlar. Bireysel protein yapı taşlarının birincil amino asit (aa) dizisi, molekülerden makroskopik düzeye kadar olan montaj potansiyeline yönelik bilgileri ve son supramoleküler yapının üç boyutlu şekli ve fiziksel özelliklerini özünde kodlar7.
Farklı supramoleküler yapıların biraraya toplanması için bildirilen yöntemler genellikle ısıya duyarlı elastin benzeri proteinler (ELP) gibi amfilik proteinleri içerir.5,8,9, rekombinant oleosin10ve yapay protein amphiphiles11. Sıcaklık tetiklenen yöntemler misellerin montajına yol açmıştır4,10,12Lif13Yaprak14ve veziküller9,15,16. Dinamik protein bazlı veziküllerin oluşumu için organik çözücüler içeren yöntemler uygulanmıştır.8,11,14. Şimdiye kadar, vezikül oluşumu için uygulanan protokoller genellikle mikrometre büyüklüğündeki montajlar üzerinde montaj kontrolü eksikliği16,17veya sınırlı montaj verime sahip5. Buna ek olarak, rapor edilen bazı ELP bazlı veziküller kapsülleme potansiyelini bozmuş12veya zaman içinde sınırlı stabilite9. Sunulan protokoller, bu sakıncaları ele alarak, farklı fizyokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme potansiyeline ve uzun süreli stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıların kendi kendine biraraya getirilmesini sağlar. Özel ampifilik ELP'ler, uygulanan protokol ve ilgili çevre koşullarına bağlı olarak küresel koaservatlar ve yüksek derecede sıralanmış bükümlü lif demetlerinden unilamellar veziküllere kadar geniş bir yelpazeyi kapsayan supramoleküler yapılarda bir araya getirilir. Büyük vesiküler Protein Membran Esaslı Bölmeler (PMBC) membran füzyonu ve faz ayırma davranışı gibi tüm ana fenotipleri lipozomlara benzer olarak ortaya koymaktadır. PMBC'ler, basit epifloresan mikroskobu kullanılarak izlenebilen kimyasal olarak çeşitli floresan kargo moleküllerini etkin bir şekilde kapsüllerler. Bu çalışmada kullanılan tekrarlayan ELP alanları protein bazlı supramoleküler mimariler için çekici yapı taşlarıdır.18. ELP pentapeptid tekrar ünitesi (VPGVG) yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korurken, dördüncü pozisyonda proline (valine, V) dışında farklı aa tolere bilinmektedir19. Farklı hidrofilik ve hidrofobik etki alanları içeren amfilik ELP'lerin tasarımı, VPGXG'ye farklı hidrofobiklik, polarite ve şarj ile aa konuk kalıntıları (X) yerleştirilerek gerçekleştirildi.20. Hidrofilik etki alanı misafir kalıntısı olarak yüklü glutamik asit (E) veya arginin (R) içererken, hidrofobik fenilalanin (F) veya izolösin (I) ile donatılmış amfilik ELP etki alanları. Uygun amfilik ELP yapıları ve ilgili aa dizileri listesi ek bilgi ve referanslar bulunabilir8,21. Floresan mikroskopisi ile görselleştirme için küçük floresan boyalar veya floresan proteinler ile donatılmış tüm yapı taşları. mEGFP ve diğer floresan proteinler N-terminalel ELP amphiphiles hidrofilik etki alanlarında erimiş edildi. Organik boyalar bakıriçermeyen suşu ile alkine-azid sikloaddition (SPAAC) ile eş-çeviriile doğal olmayan amino asit (UAA) ile konjuge edildi. UAA'nın ortak çevirisipara-azidophenylalanine (pAzF)22hidrofilik ELP etki alanının N-terminal modifikasyonuna izin verir. Bu şekilde yeşil floresan boya BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) veya süzme siklotine sahip herhangi bir küçük floresan molekül floresan prob olarak kullanılabilir. UAA pAzF'in başarılı bir şekilde eklenmesi ve boyanın SPAAC ile sikloeklenmesi, ilgili triptik peptidlerin verimli iyonizasyonu nedeniyle LC-MS/MS ile kolayca doğrulanabilir.8. Floresan proteinler çoğu organik çözücüile uyumsuz olduğundan, bu küçük organik boya montaj protokolleri için çözücü seçimini genişletmek için uygulanmıştır. Laboratuarımızda geliştirilen supramoleküler yapılar için en verimli iki montaj protokolü aşağıda açıklanmıştır. THF şişme yöntemi sadece organik boya modifiye amfilik ELP ile uyumludur. Buna karşılık, 1-butanol (BuOH) ekstrüzyon yöntemi floresan prob gibi birçok protein ile uyumludur, örneğin mEGFP, açıklanan yöntem bu füzyon proteinlerinin floresansını tamamen koruduğundan. Buna ek olarak, küçük moleküllerin kapsülleme ve vesiküler füzyon davranışı En iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi istihdam çalışır.
1. Amfilik elastin benzeri proteinlerin (ELP) tasarımı ve klonlanması
2. Protein ekspresyonu, arınma ve hazırlama
3. SPAAC ile ELP'lerin boya-modifikasyonu
4. THF şişme protokolü
5. BuOH ekstrüzyon protokolü
6. BuOH ekstrüzyon protokolü ile boyama kapsülleme
7. Floresan mikroskopi ile supramoleküler yapıların analizi
Vezikül üretimi için protokol geliştirme
Şekil 1 iki farklı vezikül hazırlama yöntemleri özetliyor. Sol taraftaki THF şişme yöntemi art arda üç adımdan oluşur ve sıcaklığa bağlı olarak ELP'nin farklı supramoleküler montajları ile sonuçlanır. Şekil 1A epifloresan mikroskopi görüntülerinde BDP-R20F20'den birleştirilmiş veziküller ve BDP-R40F20'den monte edilen fibrillary yapılar gösterilmektedir. Sağ tarafta gösterilen BuOH yöntemi, thf şişme yöntemine göre yaklaşık iki büyüklük daha fazla vezikül ler veren, ELP veziküloluşumuna yol açar. Şematik illüstrasyon BuOH veziküllerin hazırlık sürecini göstermektedir. Şekil 1B BDP-R40F20'de vezikül preparatı için %10-15 (v/v) BuOH ile karıştırıldı ve veziküller karışımın ekstrüzyonu ile hazırlandı.
Supramoleküler öz-montajı farklı yapılara yönlendirme
Şekil 2, THF şişme protokolü ile BDP-R40F20'den biraraya getirilen farklı supramoleküler yapıların şematik bir illüstrasyon ve epifloresans görüntülerini göstermektedir. Bu durumda farklı montaj protokolleri için lyophilized BDP-R40F20 kullanılmıştır. Tamponun pH'ı ve montaj işleminin sıcaklığı koaservatlar, fibriller veya veziküller oluşturacak şekilde ayarlandı. Şekil 2A'da gösterilen koaservatlar 1-2 μm çapındadır ve BDP-R40F20'den 20 °C ve pH 13'te monte edilmiştir. Montaj sıcaklığının 90 °C'ye ayarı, BDP-R40F20 ile test edilen pH 4-13'te nanofiber demetlerinin(Şekil 2B)oluşmasına neden olur. Kararlı veziküller ELP'den 50 °C ve pH 7(Şekil 2C)sıcaklıkta monte edilebilir. Montaj protokolündeki önemli adımlardan birinde yapılan küçük hatalar Şekil 2D'degösterilen agregaların oluşmasına yol açabilir.
Farklı kargo kapsülleme
Şekil 3, BuOH ekstrüzyon yöntemi ile F20R20-mEGFP'den monte edilen veziküllerin veziküllü lülesine farklı kargonun kapsülasyonunu göstermektedir. Şekil 3A'dapozitif yüklü boya Atto Rho13'ün kapsülletasyonu için boya, karışıma (%15 v/v) BuOH ve şırınga eklenmeden önce sulu ELP çözeltisi ile karıştırıldı. Konfokal mikroskopi görüntüleri yeşil kanalda F20R20-mEGFP'den oluşan vezikülleri, kırmızı kanaldaki kırmızı boya AttoRho13'ü ve ortaya çıkan birleştirilmiş kanalda vezikül lümeni içinde başarılı kapsülleme gösterir.
Polisakkarit Dextran Red 3000 yukarıda açıklandığı gibi BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak başarılı bir şekilde kapsüllendi. Yeşil kanalda kaydedilen görüntüler F20R20-mEGFP'den oluşan vezikülleri gösterirken, kırmızı kanal polisakkarit yükünü gösterir. Şekil 3B'de birleştirilmiş yeşil ve kırmızı görüntü, vezikül lülesine yapılan başarılı Dextran Red 3000 kapsüllemesi doğrular.
Membran komponent uyumluluğu ve ekstrüzyon öncesi/sonrası karışık BuOH veziküllerin faz ayrıştırMa
Şekil 4, tek pmbc yapı taşlarının monte edilmiş PMBC popülasyonları ile karıştırılması üzerine ELP amhipilelerinin faz ayrıştırma ve füzyon davranışını göstermektedir. PMBC montajı ndan önce amfilik ELP yapı taşlarını (F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry) karıştırmak, monte edilmiş PMBC membranı içinde homojen olarak dağılmış moleküllere yol açar. Florofororların ve ilişkili ELP amhiphilelerinin homojen dağılımı, ilgili floresan görüntülerinin kırmızı ve yeşil kanalını birleştirerek belirgindir. F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry'den toplanan vezikül popülasyonlarının karıştırılmasıyla kırmızı veya yeşil floresan yamaları karıştırmadan hemen sonra belirgindir. Bu, farklı etiketli PMBC füzyon olaylarının meydana geldiğini ve bu eritme membranlarının ve bileşenlerinin fazı en az 20 dakika boyunca ayrı kaldığını gösterir. Benzer bir faz davranışı lipid sallar bilinmektedir, lipid membranlar içinde23.
Şekil 1: THF şişme yönteminin ve vezikül ler veya lifler gibi supramoleküler yapılara amfifilik ELP'lerin güdümlü kendi kendine montajı için BuOH ekstrüzyon yönteminin çizimi. (A) ThF şişme yöntemi ile BDP-R20F20 ve BDP-R40F20'nin şematik iş akışı ve temsili epifloresans görüntüleri, sıcaklık ve pH'ya bağlı olarak farklı supramoleküler yapılarla sonuçlanır ve (B) BuOH ekstrüzyon yöntemi sadece BDP-R40F20'den (ölçek çubuğu 2 μm) vezikül ler verir. Bu rakam Schreiber ve ark. 20198'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: THF şişme yöntemi BDP-R40F20 uygulanarak farklı supramoleküler yapılara kendi kendine monte edilir. Montaj protokolü sırasında uygulanan çevre koşulları (örn. sıcaklık veya pH) oluşan baskın supramoleküler yapıyı belirler. Montaj sırasında ilgili koşullarda temsili supramoleküler yapılar epifloresan mikroskobu ile izlendi ve (A) koaservatlar ve (B) fibrillerden (C) stabil veziküllere kadar değişmekteydi. (D) THF şişme protokolü sırasında tanımlanan yapıların biraraya gelirken meydana gelen başarısızlık, spesifik olmayan agregaların oluşmasına yol açar (ölçek çubuğu 2 μm). Bu rakam8'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak ELP vezikülleri içinde farklı kargolar kapsüllenebilir. (A) kapsüllü pozitif yüklü boya AttoRho13 ve (B)polisakkarit dextran kırmızı kapsülleme (ölçek çubuğu 5 μm) ile F20R20-mEGFP veziküllerin temsili konfokal görüntüleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: BuOH ekstrüzyon yöntemi ile F20R20'den monte edilen vezikül membranlarının membran komponent uyumluluğu ve füzyon davranışı. (A) F20R20-mEGFP ve F20R20-mCherry protein solüsyonunun şırınga ekstrüzyondan önce karıştırılması, yeşil kanalda (sol görüntü), kırmızı kanal (orta görüntü) ve birleştirilmiş kanalda (sağ görüntü) homojen olarak dağılmış amfilik proteinlerile PMBC membranlarına yol açar. (B) PMBC'ler F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry'den monte edilir ve daha sonra şırınga ekstrüzyonu ile karıştırılarak PMBC membranları içinde ayrılmış ELP amphiphile yamalara yol açar. Membran içinde ayrılmış ELP amphiphiles yeşil kanal (sol görüntü), kırmızı kanal (orta görüntü) ve birleştirilmiş kanal (sağ görüntü) en az 20 dakika PMBC füzyon sonra görülebilir. Ölçek çubukları 5 μm'ye karşılık gelir. Bu rakam Schreiber ve ark. 20198'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tanımlanan supramoleküler yapıların montajı için açıklanan protokolleri takip eden bir hata, esas olarak spesifik olmayan agregaların(Şekil 2, IV) oluşumuna ya da homojen olarak dağıtılan ELP-amphipilelerin oluşumuna yol açar. Protokolün kritik adımları aşağıda ele alınmıştır:
Amfilik ELP'nin yüksek ekspresyon verimi için 20°C'lik nispeten düşük bir sıcaklık en uygun uyruktur. Amfilik ELP'nin başarılı afinite dayalı saflaşması için lysis tamponundaki 4 M'lik üre konsantrasyonunun amfifilik ELP'yi en iyi şekilde çözündeğin ve çözünür elüsyon fraksiyonundaki protein verimini artırıldığı kanıtlanmıştır. Lysis tamponunda daha düşük üre konsantrasyonları isteniyorsa, bireysel yapılar için yakınlık arınması test edilmelidir. 2 M üre bazı yapılar için de çalıştı, özellikle his-tag hidrofilik etki alanına erimiş ve bu nedenle hala rezorin bağlamak mümkün olanlar için. Boyut dışlama kromatografisi ile His-tag arınma sonra ek bir arıtma adımı da vezikül verimi artırabilir.
THF-şişme protokolünün uygulanması durumunda, amfifilik ELP'nin görselleştirme için floresan organik boya ile etiketlenmesi gerekir. Önemli olan, AMPifilik ELP'nin BDP etiketinde (UAA pAzF içeren amino asit dizileri için ek bilgilere bakınız) SPAAC aracılığıyla Tüm saflaştırma tamponlarında TCEP, DTT veya β-mercaptoethanol gibi herhangi bir redüktürün bulunmamasıdır. Bu SPAAC reaksiyonu 24önce pAzF amin azaltma iyi rapor azide önlemek için gereklidir.
Epifloresan skokoperlik mikroskopi ile basit vezikül görüntüleme için her BIR ELP molekülünün etiketlenmesi gerekli olmadığından boyanın ampifilik ELP'ye (örn. pAzF-R40F20) tam reaksiyonu çok önemli değildir. Bu nedenle, bir referans SDS jel bandı ve karşılık gelen ağırlıklı lyophilized örnek korelasyon sadece bir kez her protein yapısı için gereklidir. Ancak % 100'e yakın etiketleme verimi isteniyorsa ELP moleküllerine 1:1 eşdeğerboya oranı yeterlidir. Çok benzer amfifilik ELP'ler laboratuarımızda bdp'nin equimolar ilavesinde tam olarak etiketlenmesi için analiz edildi (veriler henüz yayınlanmadı).
THF şişme yöntemini kullanarak vezikül hazırlığı için en kritik adımlar liyofilize ampifilik ELP'nin şişmesi ve bu çözeltinin sulu tampon fazın üzerine daha sonra tabakalaşmasıdır. Bu nedenle, taze lyophilized amfifilik ELP mümkün olduğunca susuz olmalıdır, kuru azot gazı ile liyofilizatör havalandırma ve reaksiyon tüp kapakları hemen kapatılması ile elde edilebilir. Varsa, septum mühürlü kuru THF vezikül verimini artırmak için kullanılmalıdır, ancak THF p.a. (>99.5%) septum olmadan da çalışır. Kuru THF ampifofilik ELP şişme üzerine tabakalaşma adım çok dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. Sıcaklık kontrollü iki çözeltinin başarılı tabakalaşması, organik ve sulu faz arasında açıkça görülebilen bir faz sınırına yol açar. Yüksek sıcaklıklar bu evrelerin Termal kaynaklı karışmasına yol açsa da ilk tabakalaşma adımı yavaş yavaş yapılmalıdır. Çözeltinin acil bulanıklığı, oluşan veziküllerin, liflerin veya koaservatların ışık saçılımından kaynaklanmaktadır. Proteinden yoksun kontrol örneklerinde, THF su arabirimi25için küçük boyutlu yapılar (200 nm'ye kadar) rapor edilse de bulanıklık görünmez. THF tabakalaşma adımı şişme protokolünün en kritik ve başarısızlığa yatkın adımıdır. Kuluçka adımından sonra supramoleküler yapılar tampon veya ultra saf suya karşı diyalize salınabilir. Tercihen aynı sulu çözelti ozmularite korumak ve monte veziküllerin şişmesini veya küçülmesini önlemek için ilk montaj için uygulanan kullanılmalıdır. Diyaliz den sonra veziküller, lifler ve koaservatlar genellikle en az bir hafta stabildir. MONTAJ sırasında çevresel parametrelere bağlı olarak genellikle ana yapının yanı sıra diğer supramoleküler yapıların küçük bir kısmı THF şişme yöntemiuygulandığında8 . Açıklanan THF yöntemi vezikül montaj verimini bir büyüklük sırasına göre artırırken, BuOH ekstrüzyonu daha önce yayınlanmış in vitro yöntemimize göre verimi üç sıra kadir artırMaktadır5.
BuOH ekstrüzyon yöntemi, yüksek tekrarlanabilirlik, lifler ve küresel koaservatlar atlatmak ile sadece istikrarlı vezniküler yapılar elde etmek için uygulanır. Bu yöntem daha az hata yatkındır ve floresan proteinler ile uyumludur. Bu nedenle F20R20-mEGFP veya F20R20-mCherry yanı sıra BDP-R40F20 veya BDP-E20F20 uygulanabilir. Tek kritik adım% 10-20 v / v BuOH eklenmesinden sonra sulu protein çözeltisi hızlı karıştırma olduğunu. F20R20-mEGFP veya F20R20-mKiraz konsantrasyonu 1-15 μM civarında olmalıdır. BuOH ekstrüzyon yöntemi uygulanarak veziküller 5 M NaCl veya 4 M üre ve pH içeren ultra saf su veya tampon da monte edilebilir 5 ila 8 arasında değişen. %20 v/v BuOH'taki ekstrüde PMBC'ler 4°C'de en az 6 ay saklanabilir ve vesiküler yapılarını koruyabilirler. Vezikül boyutu dağılımını daraltmak için, 0,2-1 m gözenek boyutunda bir membran dan mini ekstruder kullanılarak ekstrüzyon edilebilir. Bu gözenek ekstrüzyonu ampifilik ELP'ye BuOH ilavesi sonrası veya vezikül montajından sonra doğrudan yapılabilir. PMBC'ler görüntüleme için fazla yoğunlaşmışsa, BuOH'da monte edilmiş veziküller %10-%20 v/v BuOH içeren sulu tampon kullanılarak hızlı karıştırma yoluyla seyreltilebilir.
BuOH ekstrüzyon yönteminin en önemli sınırlaması, sulu tamponlar karşı PMBC diyaliz genellikle kötü vezikül verimi ile sonuçlanır. Ayrıca, basit yağ asitleri PMBC membran21içine dahil başardık beri membran alanı içinde artık BuOH varlığı dışlanamaz. Bu nedenle, PMBC membranlar bir ölçüde protein ve alkanol moieties oluşan olabilir.
Kimyasal olarak çeşitli kargo moleküllerinin kapsülletme en iyi BuOH ekstrüzyon yöntemi kullanılarak çalışır. Ayrıca, boyanın stok çözeltisi için çözücü olarak DMSO'nun yakalanması boya kapsülleme verimliliğini artırır. Hassas kargo kapsüllenmiş olması için, 5% -10% v/v 1-okanol PMBC montaj için kullanılabilir ve daha uyumlu olduğu kanıtlanmıştır, BuOH ile karşılaştırıldığında, DNA-ligaz veya TEV proteaz21gibi fonksiyonel kapsüllü enzimler ile,26. Ancak, n-butanol kısa zincir uzunluğu nedeniyle uygulanan diyaliz membran nüfuz etmek mümkün değildir 1-oktanol aksine sulu tampon karşı diyalize olabilir. Bir diğer yöntem sınırlaması da istenilen suprastructure oluşumunu kontrol etmek için gereken uygulanan sıcaklıkların ve pH değerlerinin enzim aktivitesini etkileyebilmesidir. Gelecekteki çalışmalarda, vezikül membran bütünlüğünü bozmadan kapsüllenmeyen ve kapsüllü molekülleri ayırmak için yakınlık saflaştırma veya boyut dışlama saflaştırması kurulmalıdır.
Film rehidrasyon yöntemleri nin aksine16,17 Burada açıklanan protokoller veziküllerin 600 nm'den büyük boyutlarda montajını sağlar. Bu basit epifloresan mikroskopi ve membran faz ayırma gözlem ihradı ile gerçek zamanlı füzyon olaylarının izlenmesine olanak sağlar8. Ampifilik ELP9'un sıcaklık tetikli veziküler montajı ile karşılaştırıldığında, burada açıklanan protokoller PMBC'yi 6 aya kadar uzun bir süre stabilitesi ile verir. Ancak, ana dezavantajı yapı oluşumu için organik çözücü ihtiyacıdır. BuOH floresanproteinlerin 27'nin bütünlüğünü ve işlevini tam olarak korusa da (veriler gösterilmez), kapsüllü enzimlerin aktivitesi artık organik çözücü ile sınırlandırılabilir ve ayrı ayrı test edilmelidir. Ancak, DNA-ligaz içeren katalitik reaksiyonlar- TEV-proteaz ve lipaz başarıyla veziküllerin luminal boşluk içinde yapılmıştır, tarafından monte 1-okanol veya BuOH ekstrüzyon26,21. Ayrıca, montaj sonrası THF diyalizi çok sorunsuz ve vezikül bütünlüğü korunmuş olsa da, BuOH kaldırma sık sık bilinmeyen nedenlerle vezikül bütünlüğünün kaybına neden olur.
Açıklanan protokoller, araştırmacıların farklı fizikokimyasal özelliklere, iyi kapsülleme özelliklerine ve uzun süre stabiliteye sahip mikrometre ve alt mikrometre boyutunda supramoleküler yapıları biraraya getirmelerine olanak tanır. Bu supramoleküler yapılar minimal hücrelerin tasarımı için uygulanabilir26 veya yapay hücre araştırma21, enzim kapsülleme, veya ilaç formülasyonu. Sunulan fonksiyonel PMCs ilaç teslimatı için daha umut verici adaylar, onların yapı taşları immünojenik olmadığından28, dinamik füzyon davranışı sergi, ve çeşitli kargo kapsülleme için izin.
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları beyan.
Yazarlar mali destek için BMBF ve Biyolojik Sistemler Analizi Merkezi (ZBSA) araştırma tesisi sağlamak için teşekkür ederiz. Biz Plazmid pEVOL-pAzF sağlamak için P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, ABD müteşekkiriz. Albert-Ludwigs-University Freiburg Biyolojik Sistem Analizi Merkezi'ndeki (ZBSA) Yaşam Görüntüleme Merkezi (LIC) personeline konfokal mikroskopi kaynakları ve görüntü kaydındaki mükemmel destek için teşekkür ederiz.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 µm and 0.2 µm Steril Filter | VWR | ||
1,4-Dithiothreitol | Merck | ||
1-butanol. >99.5% p.a. | Roth | ||
2log DNA ladder | NEB | ||
2-Mercaptoethanol | Roth | ||
50 mL Falcon tubes | VWR | ||
79249 Alkyne Mega Stokes dye | Sigma Aldrich | ||
Acetic acid glacial | VWR | ||
Acetonitrile, anhydrous, 99.8% | Sigma-Aldrich | ||
Ampicillin sodium-salt, 99% | Roth | ||
BDP-FL-PEG4-DBCO | Jena Bioscience | ||
Biofuge | Heraeus | ||
Bottle Top Filter with PES membrane (45 µm, 22 µm) | Thermo Scientific | ||
Brillant Blue G250 (Coomassie) | Roth | ||
BspQI | NEB | ||
Camera DS Qi1 | Nikon | ||
Centrifuge 5417r | Eppendorf | ||
Centrifuge 5810r | Eppendorf | ||
CF-400-Cu square mesh copper grid | EMS | ||
Chloramphenicol | Roth | ||
CompactStar CS 4 | VWR | ||
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutral | Life Technologies | ||
Digital sonifier | Branson | ||
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Applichem | ||
Dnase I | Applichem | ||
EarI | NEB | ||
EcoRI-HF | NEB | ||
Environmental shaker incubator ES-20 | Biosan | ||
Ethanol absolute | Roth | ||
Ethidium bromide solution | Roth | ||
Filter supports | Avanti | ||
Glass plates | Bio-Rad | ||
Glycerol Proteomics Grade | Amresco | ||
Glycin | Applichem | ||
H4-Azido-Phe-OH | Bachhem | ||
Heat plate MR HeiTec | Heidolph | ||
HindIII | NEB | ||
HisTrap FF crude column | GE Life Sciences | Nickel column | |
Hydrochloride acid fuming, 37%, p.a. | Merck | ||
Illuminator ix 20 | INTAS | ||
Illuminator LAS-4000 | Fujifilm | ||
Imidazole | Merck | ||
Immersions oil for microscopy | Merck | ||
Incubators shakers Unimax 1010 | Heidolph | ||
Inkubator 1000 | Heidolph | ||
IPTG, >99% | Roth | ||
Kanamycinsulfate | Roth | ||
L(+)-Arabinose | Roth | ||
Laboratory scales Extend ed2202s/224s-OCE | Sartorius | ||
LB-Medium | Roth | ||
Lyophilizer Alpha 2-4 LSC | Christ | ||
Lysozyme, 20000 U/mg | Roth | ||
Microscope CM 100 | Philips | ||
Microscope Eclipse TS 100 | Nikon | ||
Microscopy cover glasses (15 x 15 mm) | VWR | ||
Microscopy slides | VWR | ||
Microwave | Studio | ||
Mini-Extruder Set | Avanti Polar Lipids | ||
NaCl, >99.5%, p.a. | Roth | ||
Natriumhydroxid pellets | Roth | ||
Ni-NTA Agarose, PerfectPro | 5 Prime | ||
Nucleopore Track-Etch Membrane | Avanti | ||
PH meter 766 calimatic | Knick | ||
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) | Roth | ||
Polypropylene Columns (1 mL) | Qiagen | ||
PowerPac basic | BioRad | ||
Propanol-2-ol | Emplura | ||
Protein ladder 10-250 kDa | NEB | ||
Recirculating cooler F12 | Julabo | ||
Reinforcement rings | Herma | ||
SacI HF | NEB | ||
SDS Pellets | Roth | ||
Sodiumdihydrogen phosphate dihydrate, NaH2PO4 | VWR | ||
Sterile syringe filter 0.2 mm Cellulose Acetate | VWR | ||
T4 DNA Ligase | NEB | ||
TEMED | Roth | ||
TexasRed Dextran-Conjugate | MolecularProbes | ||
Thermomix comfort | Eppendorf | ||
THF, >99.5% p.a. | Acros | ||
Triton X 100 | Roth | ||
Trypton/Pepton from Casein | Roth | ||
Ultrasonic cleaner | VWR | ||
Urea p.a. | Roth | ||
Vacuum pump 2.5 | Vacuubrand | ||
XbaI | NEB | ||
XhoI | NEB | ||
ZelluTrans regenerated cellulose tubular membrane (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V) | Roth |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır