توجيه تجميع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين إلى هياكل فوق جزيئية محددة وتغليف البضائع في المختبر

في واجهة المذيبات العضوية والمائية ، تتجمع البروتينات الشبيهة بالإيلاستين المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية معقدة مثل الحويصلات والألياف والكواسيرفات التي تسببها المعلمات البيئية. تنتج بروتوكولات التجميع الموصوفة مقصورات تعتمد على الأغشية البروتينية (PMBCs) مع خصائص قابلة للسحب ، مما يتيح تغليف البضائع المختلفة.

لبنات بناء البروتين مصممة هي المرشحين تنوعا لتجميع الهياكل فوق الجزيئية مثل الخلايا الحد الأدنى، ومركبات تسليم الأدوية وسقالات الإنزيمات. نظرًا لتوافقها البيولوجي وقابليتها للتآلف على المستوى الوراثي ، تعد البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELP) لبنات بناء مثالية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية والطب الحيوي. ومع ذلك، فإن تجميع الهياكل فوق الجزيئية القائمة على البروتين مع خصائص physiochemical متميزة وإمكانات تغليف جيدة لا يزال تحديا.

هنا نقدم بروتوكولين فعالين للتجميع الذاتي الموجه من ELPs amphiphilic في بنيات البروتين فوق الجزيئيمثل coacervates الكروية والألياف والحويصل المستقرة. تقوم بروتوكولات التجميع المقدمة بإنشاء مقصورات قائمة على غشاء البروتين (PMBCs) استنادًا إلى ELPs ذات خصائص فيزيائية كيميائية قابلة للتكيف. PMBCs إظهار سلوك فصل المرحلة وتكشف عن طريقة الانصهار الغشاء تعتمد وقادرة على تغليف جزيئات البضائع الفلورية المتنوعة كيميائيا. تتمتع شركات PMBCs الناتجة عن ذلك بإمكانية تطبيق عالية كمنصة لصياغة الأدوية وتسليمها، والخلية الاصطناعية، ومساحة التفاعل المجزأة.

تجميع الهياكل فوق الجزيئية لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية أصبحت مهمة بشكل متزايد^{1،2،3،4،5.} لتجميع العمارات الوظيفية مثل الكوات، الحويصلات، والألياف مع الخصائص الفيزيائية الكيميائية المطلوبة من المهم فهم والسيطرة على الخصائص الفيزيائية الكيميائية والتوافق للمكونات. بسبب الدقة الجزيئية للجزيئات الموجودة في الطبيعة ، تعتمد كتل البناء للهياكل فوق الجزيئية بشكل متزايد على الدهون أو الأحماض النووية أو البروتينات. بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية، تسمح كتل البناء البروتينية بالتحكم الدقيق في الهياكل فوق الجزيئية الناشئة⁶ على المستوى الوراثي. يقوم تسلسل الأحماض الأمينية الأولية (aa) لكتل بناء البروتين الفردية بترميز المعلومات لإمكانات تجميعها من الجزيئية حتى المستوى العياني بالإضافة إلى الشكل ثلاثي الأبعاد والخصائص الفيزيائية للهيكل فوق الجزيئي النهائي⁷.

الطرق المبلغ عنها لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المختلفة غالبا ما تنطوي على البروتينات الأمفيلية مثل البروتينات الحساسة لدرجة الحرارة الإيلاستين (ELP)^5,8,9، المؤتلف oleosin¹⁰والبروتين الاصطناعي الأمفيلي¹¹. وقد أدت أساليب درجة الحرارة التي أطلقت إلى تجميع micelles^4,10,12الالياف¹³اوراق¹⁴والحويصلات^9,15,16. تم تطبيق طرق تتضمن المذيبات العضوية لتشكيل الحويصلات الديناميكية القائمة على البروتين^8,11,14. حتى الآن ، والبروتوكولات المطبقة لتشكيل الحويصلات غالبا ما تفتقر إلى السيطرة على التجميعات micrometer الحجم^16,17أو يكون لها عائد تجميع محدود⁵. بالإضافة إلى ذلك ، فإن بعض الحويصلات القائمة على ELP المبلغ عنها قد أضعفت إمكانات التغليف¹²أو استقرار محدود مع مرور الوقت⁹. معالجة هذه العيوب، والبروتوكولات المقدمة تمكين التجميع الذاتي للميكرومتر والصغرى الفرعية الحجم الهياكل فوق الجزيئية مع خصائص physiochemical متميزة، وإمكانات تغليف جيدة والاستقرار لفترة طويلة. تجمع ELPs الأمفيلية المصممة خصيصًا في هياكل فوق جزيئية ، تمتد عبر النطاق من الكوات كروية وحزم الألياف الملتوية عالية الطلب إلى الحويصلات unilamellar اعتمادًا على البروتوكول المطبق والظروف البيئية المرتبطة به. تكشف المقصورات الكبيرة المستندة إلى غشاء البروتين البطيني (PMBC) عن جميع الأنماط الظاهرية الرئيسية مثل دمج الأغشية وسلوك فصل المرحلة المشابه للدهون. تقوم شركات PMBCs بتغليف جزيئات الشحن الفلورية المتنوعة كيميائياً والتي يمكن رصدها باستخدام المجهر البسيط للكشف عن الفلورسينس. تعد نطاقات ELP المتكررة المستخدمة في هذه الدراسة لبنات بناء جذابة للبنيات فوق الجزيئية القائمة على البروتين¹⁸. ومن المعروف أن وحدة تكرار الببتيدات ELP (VPGVG) تتسامح مع aa مختلفة إلى جانب proline في المركز الرابع (valine, V)، مع الحفاظ على خصائصها الهيكلية والوظيفية¹⁹. تم تحقيق تصميم ELPs الأمفيلية التي تحتوي على مجالات مائية ومائية مميزة عن طريق إدراج بقايا ضيف Aa (X) في VPGXG يكرر مع الهيدروكوبية المتميزة والقطبية والشحن²⁰. نطاقات AMPhiphilic ELP حيث مجهزة فينيل ألانين (F) أو isoleucine (I) في حين أن المجال الهيدروفيلي يحتوي على حمض الغلوتاميك المشحون (E) أو أرجينين (R) كمخلفات ضيف. يمكن العثور على قائمة ببنيات ELP الأمفيفيلية المؤهلة وتسلسل aa المقابل لها في المعلومات والمراجع التكميلية^8,21. جميع اللبنات حيث مجهزة إما مع الأصباغ الفلورية الصغيرة أو البروتينات الفلورية للتصور عن طريق المجهر الفلوري. mEGFP وغيرها من البروتينات الفلورية كانت ن تنصهر ميؤوس منها إلى المجالات المائية من amphiphiles ELP . وقد تترافق الأصباغ العضوية عبر سلالة خالية من النحاس تعزيز الكين-الأزيد cycloaddition (SPAAC) إلى حمض أميني غير طبيعي تم عرضه مترجماً للمشترك (UAA). المشاركة في الترجمة لـ UAApara-azidophenylalanine (pAzF)²²يسمح تعديل N-المحطة الطرفية للمجال ELP المائية. وبهذه الطريقة صبغ الفلورسنت الأخضر BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) أو أي جزيء الفلورسنت الصغيرة مع سيكلووكتاين المتوترة يمكن استخدامها كمسبار الفلورسنت. يمكن بسهولة تأكيد النجاح في دمج pAzF UAA وcycloaddition من الصبغة عبر SPAAC عن طريق LC-MS / MS بسبب التهيئة الفعالة للببتيدات التربكية المقابلة⁸. تم تطبيق هذه الصبغة العضوية الصغيرة لتوسيع نطاق اختيار المذيبات لبروتوكولات التجميع ، نظرًا لأن البروتينات الفلورية لا تتوافق مع معظم المذيبات العضوية. يتم وصف بروتوكولي التجميع الأكثر كفاءة للهياكل فوق الجزيئية التي تم تطويرها في مختبرنا أدناه. طريقة تورم THF متوافقة فقط مع الصبغة العضوية المعدلة AMPhiphilic ELP. في المقابل ، فإن طريقة قذف 1-butanol (BuOH) متوافقة مع العديد من البروتينات مثل مسبار الفلورسنت على سبيل المثال mEGFP ، لأن الطريقة الموصوفة تحافظ بشكل كامل على فلورسسينس من هذه البروتينات الاندماجية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تغليف الجزيئات الصغيرة وسلوك الانصهار الفيزلي يعمل بشكل أفضل من خلال استخدام طريقة البثق BuOH.

1. تصميم واستنساخ البروتينات الشبيهة بالإيلاستين (ELPs)

1. استنساخ وتصميم الهياكل كما هو موضح في مكان آخر^8،20. وتتوفر البلازميدات عند الطلب.

2. البروتين التعبير والتنقية والإعداد

1. التعبير عن F20E20-mEGFP و F20E20-mCherry
   1. تطعيم ثقافة التعبير الرئيسية من بين عشية وضحاها قبل الثقافة إلى OD₆₀₀ من 0.3. احتضان في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في معقم 400 مل LB المتوسطة تستكمل مع المضادات الحيوية المخصصة في قارورة 2 L.
   2. إعداد حل الأسهم IPTG (1 M) لتحريض ثقافة التعبير في المياه فائقة النقاء.
   3. عند الوصول إلى OD₆₀₀ 0.5-0.8، أضف IPTG إلى ثقافة التعبير إلى تركيز نهائي قدره 1 متر مربع وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية. السماح للتعبير عند 20 درجة مئوية لحوالي 20 ساعة في 200 دورة في الدقيقة.
2. التعبير عن ELP amphiphilic التي تحتوي على UAA pAzF
   1. Inoculate ثقافة التعبير الرئيسية من بين عشية وضحاها E. القولونية قبل الثقافة التي تحتوي على اثنين plasmids pEVOL pAzF وعلى سبيل المثال pET28-NMBL-(TAG)R40F20-له إلى OD₆₀₀ من 0.3 (انظر المعلومات التكميلية لتسلسل الأحماض الأمينية). احتضان في 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة في معقم 400 مل LB المتوسطة تكملها كاناماشين والكلورامفينيكول في قارورة 2 L.
   2. إعداد 100 mM pAzF محلول الأوراق المالية في المياه فائقة النقاء. ل10 مل من محلول الأسهم pAzF, تزن 206.2 ملغ pAzF وإعادة تعليقه في 8 مل من الماء الترافين. لإذابة pAzF رفع درجة الحموضة من الحل مع 3 M NaOH وتخلط بقوة. عندما يذوب pAzF، خفض درجة الحموضة بعناية إلى 10.5 وإضافة المياه فائقة النقاء إلى حجم النهائي من 10 مل. استخدام مرشح معقم (0.22 ميكرون) وaliquotعلى الحل في 2 أنابيب رد الفعل مل.
   3. إعداد 1 M حل الأسهم IPTG في المياه فائقة النقاء و 20٪ حل الأسهم arabinose في المياه فائقة النقاء.
   4. عند الوصول إلى OD₆₀₀ 0.5-0.8، أضف pAzF إلى ثقافة التعبير إلى تركيز نهائي قدره 2 mM. الثقافة المحتضنة لمدة 10 دقيقة، 37 درجة مئوية، 200 دورة في الدقيقة للسماح للحصول على pAzF.
   5. حث التعبير عن البروتين المستهدف والتعبير عن tRNA اللازمة / ر - RNA synthetase عن طريق إضافة متزامنة من IPTG (1 mM) وarabinose (2 ٪ ) وخفض درجة حرارة الحضانة إلى 20 درجة مئوية.
   6. السماح للتعبير عند 20 درجة مئوية لحوالي 20 ساعة في 200 دورة في الدقيقة. حصاد ثقافة التعبير عن طريق الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، 4000 × ز،40 دقيقة.
3. الخلايا المنزلية وتنقية البروتين
   1. إعادة تعليق بيليه الإشريكية القولونية في المخزن المؤقت للليسي (10 مل لكل لتر من الثقافة؛ 50 مل تريس-HCl pH 8، 500 mM NaCl، 4 M urea، 0.25٪ تريتون X-100) التي تحتوي على ليسوزيمي (0.1 ملغ /مل) وPMSF (0.1 mM). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد وتجميد وذوبان مرتين بعد ذلك عن طريق غمر العينة في النيتروجين السائل.
   2. Sonicate التعليق (30٪، 15 مرات، 30 s: 10 ق كسر) ومسح lysate عن طريق الطرد المركزي (4 درجة مئوية، 10،000 × ز لمدة 40 دقيقة).
   3. تنقية البروتين باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب (على سبيل المثال على عمود النيكل 1 مل باستخدام نظام FPLC متصل ة جامع كسر؛ انظر جدول المواد). يلط البروتين مع العازلة elution (50 mM Tris-HCl، 500 mM NaCl، 4 M اليوريا، 250-500 mM imidazole) وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
   4. تحليل كفاءة التنقية عبر SDS-PAGE.

3. صبغ تعديل ELPs عبر SPAAC

1. تقدير تقريبا تركيز حل ELP.  امتصاص₂₈₀ لتقييم التركيز ليست قيمة منذ تسلسل pAzF-R40F20 تفتقر إلى الأحماض الأمينية التي تمتص في نطاق الأشعة فوق البنفسجية. لذلك، يمكن استخدام amphiphile ELP lyophilized سابقاً والمرجح كمرجع لمقارنة نطاق SDS PAGE. من خلال مقارنة القيمة الرمادية التلخيصية من نطاقات صفحة SDS من حلول ELP مع تركيزات معروفة والعينة الخاصة بك يمكن تقدير التركيز الخام من العينة الخاصة بك.
2. أضف 1 ميكرولتر من صبغة الفلورسنت BDP-FL-PEG4-DBCO (محلول مخزون 10 mM؛ تركيز نهائي 20 ميكرومتر) إلى 500 ميكرولتر من محلول ELP (~ 20 ميكرومتر). احتضان رد الفعل لحوالي 10 ساعة في 15 درجة مئوية، في حين تهتز ومحمية من الضوء.
3. لمزيد من الاستخدام، dialyze رد الفعل لإزالة BDP المفرطة.
   1. توازن غشاء غسيل الكلى (على سبيل المثال 12 كيلو دا قطع) في المياه فائقة النقاء لمدة 10 دقيقة. قطع غشاء غسيل الكلى في الحجم الصحيح لوضعها على رأس فتح أنبوب رد فعل يحتوي على محلول ELP النقر. لإصلاح غشاء غسيل الكلى في الفتحة ، ضع غطاء أنبوب رد الفعل مع النواة اللكمة على الفتحة ، وبالتالي إغلاق الأنبوب.
   2. ضع أنبوب التفاعل رأسًا على عقب في المخزن المؤقت المختار. تبادل المخزن المؤقت (2-5 L) مرتين بعد غسيل الكلى لمدة 3 ساعة على الأقل في كل مرة. إزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين بين غشاء غسيل الكلى والمخزن المؤقت لضمان غسيل الكلى الناجح.

4. THF بروتوكول تورم

1. Dialyze حل ELP متجانسة ضد الفوسفات أو تريس المخزن المؤقت (10 mM) مع درجة الحموضة مستقرة 7.5 لإزالة الأملاح والمركبات المتبقية من تنقية له العلامة.
2. إعداد lyophilizer وتهدئة وصولا الى درجة حرارة البدء لتجميد التجفيف.
3. Aliquot محلول البروتين dialyzed في أنابيب رد الفعل 1.5 مل (50-500 ميكرولتر لكل أنبوب) وتجميد الصدمة في النيتروجين السائل. لتجنب خلط غير المرغوب فيها من حلول البروتين المختلفة أثناء التجفيف التجميد، يمكن وضع قبعات مع ثقب صغير على رأس أنبوب رد الفعل لختم ذلك جزئيا.
4. تأخذ عينات البروتين المجمدة من النيتروجين السائل ووضعها على الفور في الليوفيلي لبدء تجميد التجفيف. يتم الانتهاء من التجفيف بالتجميد عندما تكون العينة جافة تمامًا (حوالي 24-48 ساعة). في وقت لاحق، تهوية ELPs amphiphilized lyophilized مع الجافة N_2،ثم إغلاق على الفور أغطية أنبوب رد الفعل لتجنب الاتصال مع رطوبة الهواء.
5. أضف THF نقية إلى العينات lyophilized (ELP، 5-10 μM) ووضع الحل في حمام مائي سونيكاتور يحتوي على الماء المثلج لمدة 15 دقيقة للسماح لتورم ELP في THF.
6. سخني دراجة حرارية إلى 30-60 درجة مئوية لتشكيل الحويصلات أو ما يصل إلى 90 درجة مئوية لتشكيل الألياف وإعداد أنابيب تفاعل جديدة تحتوي إما على الماء الفائق النقاء أو المخزن المؤقت (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄، 50 mM NaCl ، pH 5-13). يتجمع الكوسيرفات الكروي في الغالب عند 20 درجة مئوية داخل درجة الحموضة 9-13. ويفضل تشكيل الحويصلات في 50-60 درجة مئوية بين درجة الحموضة 7 و 9. تشكيل الألياف هو predominently المستحثة فوق 60 درجة مئوية بين درجة الحموضة 5 و 12.
7. بعد خطوة سونيكيشن، ضع حل ELP/THF وكذلك الماء فائق النقاء أو محلول العازلة المعدة في thermocycler وتسخين ما يصل إلى درجة الحرارة المطلوبة لمدة 5 دقائق. عندما يتم الوصول إلى درجة الحرارة ينبغي أن يكون حل ELP / THF محمّد بعناية على رأس الماء فائق النقاء مدفأ أو محلول عازلة. وينبغي أن يكون الفصل الواضح بين المرحلتين مع واجهة متميزة مرئياً.
8. وضع الخليط في thermocycler مرة أخرى واحتضان لمدة 20 دقيقة للسماح لتشكيل الحويصلات أو الألياف في واجهة. بعد ذلك، دع العينات تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق قبل التحليل عن طريق المجهر الفلوري أو غسيل الكلى.
9. حل Dialyze يحتوي على الهياكل فوق الجزيئية ضد الماء الفائق النقاء أو المخزن المؤقت (50 mM NaH₂PO₄/ Na₂HPO₄، 50 mM NaCl ، pH 7-10).

5. بروتوكول البثق BuOH

1. إعداد 1-50 ميكرومتر ELP الحل في المياه فائقة النقاء أو عازلة (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, قد تحتوي على ما يصل إلى 4 M اليوريا). يمكن تحديد تركيز حل الـ ELP F20R20-mEGFP وF20R20-mCherry باستخدام معاملات الانقراض الضر (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 M^-1 سم^-1 وF20R20-mCherry A₂₈₀ = 34380 M^-1 سم^-1)(انظر المعلومات التكميلية للتسلسلات aa).
2. إضافة 10٪ -20٪ (v/v) 1-butanol وتخلط على الفور الحل عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا أو رسم عنه من خلال حقنة عدة مرات. يمكن تطبيق ماصة مشتركة 100 ميكرولتر أو حقنة هاملتون مجهزة بإبرة 0.25 × 25 مم. يجب أن يزيد تعكر الحل أثناء الاختلاط ، مما يشير إلى تكوين الحويصلات. 1-أوكتانول 5٪-15٪ (v/v) يمكن أن تستخدم أيضا لقذف الحويصلات بدلا من 1-butanol.
3. من أجل تحقيق توزيع حجم ضيق ، مقذوف الحويصلات باستخدام طارد صغير من خلال غشاء بحجم مسام قدره 1 ميكرومتر في درجة حرارة الغرفة. حجم الغشاء المستخدم للقذف يحدد قطع الحجم العلوي للحوائط.
4. Dialyze الحويصلات كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.3) لإزالة المتبقية 1-butanol.

6. تغليف صبغ مع بروتوكول البثق BuOH

1. مزيج ما يقرب من 40 ميكرونيل ELP الحل في 10 mM Tris-HCl، درجة الحموضة 8 مع 1 μL Dextran تكساس الأحمر (0.0025 ملغم / مل التركيز النهائي).
2. أضف 10 ميكرولتر من BuOH إلى المحلول واقذف 5-10 مرات من خلال حقنة مجهزة بإبرة 0.25 × 25 مم.

7. تحليل الهياكل فوق الجزيئية باستخدام المجهر الفلوري

1. ضع حلقة تعزيز على شريحة زجاجية واضغط بقوة على الجانب اللاصق إلى الزجاج.
2. إضافة 5 ميكرولتر من العينة إلى داخل حلقة التعزيز ووضع زلة غطاء على القمة.
3. ختم العينة مع طلاء الأظافر على حواف زلة الغطاء لتجنب تبخر العينة أثناء التحليل.
4. إجراء المجهر الفلوري كما سبق وصفه⁸.

تطوير بروتوكول لإنتاج الحويصلات
يوضح الشكل 1 طريقتي إعداد الحويصلات المختلفة. تتكون طريقة تورم THF على الجانب الأيسر من ثلاث خطوات متتالية ونتائج في تجمعات فوق جزيئية مختلفة من ELP اعتمادًا على درجة الحرارة. في الشكل 1A صور المجهر epifluorescence تظهر الحويصلات التي تم تجميعها من BDP-R20F20 والهياكل الرجفانية التي تم تجميعها من BDP-R40F20. طريقة BuOH ، الموضحة على الجانب الأيمن تؤدي حصريًا إلى تشكيل الحويصلات ELP ، مما ينتج حوالي أمرين من حجم الحويصلات أكثر مقارنة بطريقة تورم THF. يوضح الرسم التخطيطي عملية إعداد الحويصلات بووه. لإعداد الحويصلات في الشكل 1B BDP-R40F20 تم خلطها مع 10-15٪ (v/v) تم إعداد BuOH والحويصلات عن طريق قذف الخليط.

توجيه التجميع الذاتي فوق الجزيئي إلى هياكل مختلفة
يُظهر الشكل 2 رسمًا توضيحيًا تخطيطيًا وصورًا لepifluorescence لهياكل فوق جزيئية مختلفة تم تجميعها من BDP-R40F20 عبر بروتوكول تورم THF. في هذه الحالة تم استخدام BDP-R40F20 lyophilized لبروتوكولات التجميع المختلفة. تم تعديل درجة الحموضة للحاجز ودرجة حرارة عملية التجميع لتشكيل إما الكوات أو الفيبريل أو الحويصلات. يبلغ قطر الكوسيرارفاتات الموضحة في الشكل 2A 1-2 ميكرومتر وتم تجميعها من BDP-R40F20 عند 20 درجة مئوية والرقم الهيدروجيني 13. يؤدي تعديل درجة حرارة التجميع إلى 90 درجة مئوية إلى تشكيل حزم الألياف النانوية(الشكل 2B)عند درجة الحموضة 4-13 التي تم اختبارها باستخدام BDP-R40F20. يمكن تجميع الحويصلات المستقرة من ELP عند درجة حرارة 50 درجة مئوية ودرجة الحموضة 7(الشكل 2C). يمكن أن تؤدي الأخطاء الصغيرة في إحدى الخطوات الحاسمة في بروتوكول التجميع إلى تكوين المجاميع الموضحة في الشكل 2D.

تغليف البضائع المختلفة
ويبين الشكل 3 تغليف البضائع المختلفة في تجويف الحويصلات الحويصلات التي تم تجميعها من F20R20-mEGFP عبر طريقة البثق BuOH. لتغليف الصبغة المشحونة بشكل إيجابي أتو Rho13 في الشكل 3A، تم خلط الصبغة مع محلول ELP المائية قبل إضافة (15٪ v /v) BuOH وقذف الحقنة للخليط. تظهر صور المجهر المحوري الحويصلات التي تشكلت من F20R20-mEGFP في القناة الخضراء ، والصبغة الحمراء AttoRho13 في القناة الحمراء والقناة المدمجة الناتجة تظهر التغليف الناجح داخل تجويف الحويصلات.

تم تغليف polysaccharide Dextran Red 3000 بنجاح باستخدام طريقة البثق BuOH كما هو موضح أعلاه. تصور الصور المسجلة في القناة الخضراء الحويصلات التي تشكلت من F20R20-mEGFP بينما تعرض القناة الحمراء شحنة البوليستراميد. الصورة الخضراء والأحمر المدمجة في الشكل 3B تؤكد التغليف Dextran Red 3000 الناجح في إلى تجويف الحويصلات.

توافق مكون الغشاء وفصل المرحلة من الحويصلات المختلطة BuOH قبل / بعد البثق
ويبين الشكل 4 فصل المرحلة وسلوك الانصهار من amphiphiles ELP عند خلط كتل بناء PMBC واحدة مقابل مجموعات PMBC المجمعة. خلط كتل بناء ELP amphiphilic (F20R20-mEGFP و F20R20-mCherry) قبل تجميع PMBC يؤدي إلى جزيئات موزعة بشكل متجانس داخل غشاء PMBC المجمعة. يتضح التوزيع المتجانس للفلوروبورورس والأمفيليات ELP المرتبطة بها عند دمج القناة الحمراء والخضراء للصور الفلورية المعنية. عن طريق خلط مجموعات الحويصلات التي تم تجميعها من إما F20R20-mEGFP أو F20R20-mCherry واضحة للعيان بقع غشاء من الفلورسال الأحمر أو الأخضر واضحة مباشرة بعد الاختلاط. وهذا يشير إلى أن أحداث الانصهار PMBC من PMBCs المسمى بشكل مختلف تحدث وأن هذه الأغشية الصمامات ومكوناتها تبقى مرحلة منفصلة لمدة 20 دقيقة على الأقل. ومن المعروف سلوك مرحلة مماثلة من الطوافات الدهنية، داخل الأغشية الدهنية^23.

الشكل 1: توضيح لطريقة تورم THF وطريقة قذف BuOH للتجميع الذاتي الموجه لـ ELPs الأمفيلية في الهياكل فوق الجزيئية مثل الحويصلات أو الألياف. سير العمل التخطيطي وصور epifluorescence التمثيلية من (A) طريقة تورم THF مع BDP-R20F20 و BDP-R40F20 مما أدى إلى هياكل فوق جزيئية مختلفة اعتمادًا على درجة الحرارة ودرجة الحموضة و (B)طريقة البثق BuOH التي تنتج حصرا ً الحويصلات من BDP-R40F20 (شريط المقياس 2 ميكرومتر). تم تعديل هذا الرقم من شرايبر وآخرون 2019⁸. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: من خلال تطبيق طريقة تورم THF BDP-R40F20 التجميع الذاتي في هياكل فوق جزيئية مختلفة. تحدد الشروط البيئية المطبقة أثناء بروتوكول التجميع (مثل درجة الحرارة أو درجة الحموضة) التركيب فوق الجزيئي السائد الذي تم تشكيله. تم رصد الهياكل فوق الجزيئية التمثيلية في الظروف المعنية أثناء التجميع عبر المجهر البيفلورسينسوئيل وتتراوح من (A) الكوسيرافات والفيبريل (B) إلى الحويصلات المستقرة (C). (د) الفشل في تجميع الهياكل المحددة أثناء بروتوكول تورم THF يؤدي إلى تشكيل مجاميع غير محددة (مقياس شريط 2 ميكرون). تم تعديل هذا الرقم من⁸. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: يمكن تغليف الشحنات المختلفة داخل الحويصلات ELP باستخدام طريقة البثق BuOH. (A)يظهر الصور تمثيلية confocal من الحويصلات F20R20-mEGFP مع مغلفة صبغ ة مشحونة بشكل إيجابي AttoRho13 و (B) تغليف الحمراء dextran polysaccharide (شريط مقياس 5 ميكرومتر). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: توافق مكون الغشاء وسلوك الانصهار من الأغشية الحويصلات التي تم تجميعها من F20R20 عبر طريقة البثق BuOH. (أ)خلط الفلورسنت F20R20-mEGFP وF20R20-mCherry حل البروتين قبل الحقنة البثق يؤدي إلى أغشية PMBC مع البروتينات الأمفيلية الموزعة بشكل متجانس مرئية في قناة خضراء (صورة يسرى)، قناة حمراء (صورة الأوسط)، وقناة مدمجة (الصورة اليمنى). (ب)PMBCs تجميعها إما من F20R20-mEGFP أو F20R20-mCherry ومختلطة في وقت لاحق عن طريق قذف حقنة يؤدي إلى بقع أمفيفيل ELP منفصلة داخل أغشية PMBC. الأمبيرات ELP منفصلة داخل الغشاء مرئية بعد الانصهار PMBC لمدة لا تقل عن 20 دقيقة في القناة الخضراء (الصورة اليسرى)، والقناة الحمراء (الصورة الوسطى)، والقناة المدمجة (الصورة اليمنى). تتوافق أشرطة المقياس مع 5 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من شرايبر وآخرون 2019⁸. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

خطأ أثناء اتباع البروتوكولات الموصوفة لتجميع الهياكل فوق الجزيئية المحددة يؤدي بشكل رئيسي إما إلى تشكيل مجاميع غير محددة(الشكل 2، IV) أو إلى AMPhiphiles ELP-amphiphiles الموزعة بشكل متجانس. وترد أدناه مناقشة الخطوات الحاسمة للبروتوكول:

لعائد التعبير العالي من ELP amphiphilic، درجة حرارة منخفضة نسبيا من 20 درجة مئوية هو الأمثل. لتنقية تقارب ناجحة من ELP amphiphilic تركيز اليوريا من 4 M في المخزن المؤقت حلس ثبت أن أفضل solubilize ELP amphiphilic وزيادة غلة البروتين في كسر اللاوطي القابلة للذوبان. إذا كان من المرغوب فيه تركيزات أقل من اليوريا في المخزن المؤقت للزل، يجب اختبار تنقية التقارب للبنيات الفردية. 2 M اليوريا عملت كذلك لبعض البنى، وخاصة بالنسبة لتلك التي تم دمجها له العلامة إلى المجال المائية، وبالتالي لا تزال قادرة على ربط الراتنج.  خطوة تنقية إضافية بعد تنقية له علامة عبر حجم اللوني الاستبعاد يمكن أن تزيد من العائد الحويصلات كذلك.

في حالة تطبيق بروتوكول تورم THF ، يجب تسمية ELP الأمفيلي بصبغة عضوية فلورية للتصور. الأهم من ذلك بالنسبة لBDP وضع العلامات من ELP amphiphilic (انظر المعلومات التكميلية لتسلسل الأحماض الأمينية التي تحتوي على UAA pAzF) عبر SPAAC هو عدم وجود أي اختزال مثل TCEP، DTT ولا α-mercaptoethanol في جميع المخازن المؤقتة تنقية. هذا ضروري لتجنب عزيد المبلغ عنها بشكل جيد للحد من الأمين pAzF قبل رد فعل SPAAC²⁴.

رد الفعل الدقيق stoichiometry من الصبغة إلى ELP amphiphilic (على سبيل المثال pAzF-R40F20) ليست حاسمة لأنه ليس من الضروري تسمية كل جزيء ELP واحد لتصور الحويصلات البسيطة عبر المجهر epifluorsence. ولذلك، فإن ارتباط نطاق هلام SDS المرجعي والعينة ذات الوزن المناوعي المقابلة ضروري ًا مرة واحدة فقط لكل بناء بروتين. ومع ذلك، إذا كان ما يقرب من 100٪ بطاقة الغلة هو المطلوب نسبة 1:1 ما يعادل صبغ ة إلى جزيئات ELP كافية. تم تحليل ELPs الأمفيلية مشابهة جدا في مختبرنا لتكون وصفت تماما في إضافة equimolar من BDP (البيانات التي لم تنشر بعد).

لإعداد الحويصلات باستخدام طريقة تورم THF ، فإن الخطوات الأكثر أهمية هي تورم ELP الأمفيلي والتقسيم الطبقي اللاحق لهذا الحل على رأس مرحلة العازلة المائية. لذلك ، يجب أن يكون ELP الأمفيلي الطازج غير مائي قدر الإمكان ، والذي يمكن تحقيقه عن طريق تهوية الليوفيليمع بغاز النيتروجين الجاف والإغلاق الفوري لأغطية أنبوب التفاعل. إذا كان متوفراً، يجب استخدام الحاجز مختومة THF الجافة لزيادة العائد الحويصلات، ولكن THF p.a. (>99.5٪) دون septum يعمل كذلك. يجب تنفيذ خطوة التقسيم الطبقي عند تورم ELP الأمفيلي في THF الجاف بعناية فائقة. يؤدي التقسيم الطبقي الناجح للمحلولين اللذين يتم التحكم في هما في درجة الحرارة إلى حدود مرحلة واضحة للعيان بين المرحلة العضوية والمائية. وينبغي إجراء خطوة التقسيم الطبقي الأوليببطء على الرغم من ارتفاع درجات الحرارة يؤدي إلى خلط الحراري المستحث من هذه المراحل. العكر الناشئ ة من الحل يرجع إلى نثر الضوء من الحويصلات شكلت، والألياف أو coacervates. في عينات التحكم التي تفتقر إلى البروتين ، لا يظهر أي تعكر على الرغم من الهياكل الصغيرة الحجم (تصل إلى 200 نانومتر) يتم الإبلاغ عنها لواجهة المياه THF²⁵. خطوة التقسيم الطبقي THF هي الخطوة الأكثر حرجًا وعرضة للفشل في بروتوكول التورم. بعد خطوة الحضانة يمكن أن تكون الهياكل فوق الجزيئية dialyzed ضد المياه العازلة أو فائقة النقاء. بشكل تفضيلي ينبغي استخدام نفس الحل المائية التي تم تطبيقها للتجميع الأولي من أجل الحفاظ على الأوسمولاتي ومنع تورم أو تقلص الحويصلات المجمعة. بعد غسيل الكلى، عادة ما تكون الحويصلات والألياف والكوات مستقرة لمدة أسبوع واحد على الأقل. اعتمادا على المعلمات البيئية أثناء التجميع في كثير من الأحيان نسبة صغيرة من الهياكل فوق الجزيئية الأخرى إلى جانب الهيكل الرئيسي موجودة إذا تم تطبيق طريقة تورم THF⁸. طريقة THF الموصوفة يزيد من العائد الجمعية الحويصلات من قبل ترتيب واحد من حجم في حين أن البثق BuOH يحسن العائد من قبل ثلاثة أوامر من حجم مقارنة لدينا نشرت سابقا في طريقة المختبر⁵.

يتم تطبيق طريقة البثق BuOH للحصول على هياكل الطراد مستقرة حصرا مع قابلية استنساخ عالية، والتحايل على الألياف وcoacervates كروية. هذه الطريقة هي أقل عرضة للخطأ ومتوافقة مع البروتينات الفلورية. لذلك يمكن تطبيق F20R20-mEGFP أو F20R20-mCherry بالإضافة إلى BDP-R40F20 أو BDP-E20F20. الخطوة الحاسمة الوحيدة هي الخلط السريع لمحلول البروتين المائية بعد إضافة 10٪ -20٪ v/v BuOH. يجب أن يكون تركيز F20R20-mEGFP أو F20R20-mCherry حوالي 1-15 ميكرومتر. من خلال تطبيق الحويصلات طريقة البثق BuOH يمكن تجميعها في المياه فائقة النقاء أو عازلة تحتوي على ما يصل إلى 5 M NaCl أو 4 M اليوريا والحموضة تتراوح بين 5 إلى 8. يمكن تخزين PMBCs مقذوف في 20٪ v / v BuOH لمدة 6 أشهر على الأقل عند 4 درجات مئوية مع الحفاظ على هيكل هامدة. لتضييق توزيع حجم الحويصلات ، يمكن مقذوفها باستخدام طارد صغير من خلال غشاء بحجم مسام 0.2-1 ميكرومتر. ويمكن القيام بهذا البثق المسام مباشرة بعد BuOH بالإضافة إلى ELP amphiphilic أو بعد الجمعية الحويصلات. إذا كانت PMBCs مركزة جداً للتصوير، يمكن تخفيف الحويصلات المجمعة في BuOH من خلال الخلط السريع باستخدام عازلة مائي يحتوي على 10٪-20٪ v/v BuOH.

القيد الرئيسي لطريقة البثق BuOH هو أن غسيل الكلى PMBC ضد المخازن المؤقتة المائية غالباً ما يؤدي إلى ضعف العائد الحويصلات. علاوة على ذلك ، لا يمكن استبعاد وجود BuOH المتبقية داخل مساحة الغشاء لأن الأحماض الدهنية البسيطة كانت قادرة على الاندماج في غشاء PMBC^21. لذلك ، قد تكون أغشية PMBC إلى حد ما تتكون من البروتين وmoieties alkanol.

تغليف جزيئات البضائع المتنوعة كيميائيا يعمل بشكل أفضل باستخدام طريقة البثق BuOH. وعلاوة على ذلك، DMSO كمذيب لمحل المخزون من الصبغة التي سيتم التقاطها يزيد من كفاءة تغليف الصبغة. للبضائع الحساسة ليتم تغليفها، 5٪-10٪ v/v 1-octanol يمكن استخدامها لتجميع PMBC وقد ثبت أن تكون أكثر توافقا، بالمقارنة مع BuOH، مع الإنزيمات المغلفة وظيفية مثل الحمض النووي-ligase أو TEV بروتياز^21،,26. ومع ذلك، نظرا لأقصر طول سلسلة من ن-البوتانول يمكن أن يكون dialyzed ضد عازلة مائي على النقيض من 1-أوكتانول، والتي ليست قادرة على تغلغل في غشاء غسيل الكلى المطبقة. تقييد طريقة أخرى هي أن درجات الحرارة المطبقة وقيم درجة الحموضة اللازمة للسيطرة على تكوين الهيكل العلوي المطلوب يمكن أن تؤثر على نشاط الإنزيم. في العمل المستقبلي ، يجب إنشاء تنقية تقارب أو تنقية استبعاد الحجم لفصل الجزيئات غير المغلفة مقابل الجزيئات المغلفة دون تدهور سلامة الغشاء الحويصلات.

على النقيض من طرق الإماهة الفيلم^16,17 البروتوكولات الموصوفة هنا تمكين تجميع أحجام الحويصلات أكبر من 600 نانومتر. وهذا يسمح برصد أحداث الانصهار في الوقت الحقيقي من خلال المجهر بسيط epifluorescence ومراقبة فصل مرحلة الغشاء^8. بالمقارنة مع درجة الحرارة التي أثارت الجمعية السفيد من ELP amphiphilic⁹ البروتوكولات الموصوفة هنا تسفر PMBC مع استقرار طويل الأمد يصل إلى 6 أشهر. ومع ذلك ، فإن العيب الرئيسي هو الحاجة إلى المذيبات العضوية لتشكيل الهيكل. على الرغم من أن BuOH يحافظ بشكل كامل على سلامة ووظيفة البروتينات الفلورية²⁷ (البيانات غير مبينة) ، فإن نشاط الإنزيمات المغلفة قد يكون مقيدًا بالمذيبات العضوية المتبقية ويجب اختباره بشكل فردي. ومع ذلك ، تم إجراء ردود الفعل الحفازة التي تنطوي على الحمض النووي - ligase ، TEV - بروتياز وليباز بنجاح داخل الفضاء المضيئ للحويصل ، التي تم تجميعها بواسطة 1 -octanol أو البثق BuOH^26،21. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن غسيل الكلى THF بعد التجميع غير إشكالية للغاية ويتم الحفاظ على سلامة الحويصلات، فإن إزالة BuOH غالباً ما تؤدي إلى فقدان سلامة الحويصلات لأسباب غير معروفة.

تمكن البروتوكولات الموصوفة الباحثين من تجميع الهياكل فوق الجزيئية بحجم ميكرومتر والميكرومتر الفرعي مع خصائص فيزيائية فيزيائية متميزة ، وخصائص تغليف جيدة ، واستقرار طويل الأمد. يمكن تطبيق هذه الهياكل فوق الجزيئية لتصميم الخلايا الدنيا²⁶ أو أبحاث الخلايا الاصطناعية²¹، تغليف الإنزيم ، أو صياغة الدواء. وPMBCs الوظيفية المقدمة هي المزيد من المرشحين واعدة لتسليم المخدرات، منذ لبنات البناء ليست المناعية^28،والمعارض سلوك الانصهار الديناميكي، والسماح لتغليف البضائع المتنوعة.

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.

يشكر المؤلفون بنك دبي للموارد المالية على الدعم المالي ومركز تحليل النظم البيولوجية (ZBSA) لتوفيره مرفق البحث. ونحن ممتنون لP. G. شولتز، TSRI، لا جولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية لتوفير pEVOL-pAzF plasmid. نشكر موظفي مركز تصوير الحياة (LIC) في مركز تحليل الأنظمة البيولوجية (ZBSA) التابع لجامعة ألبرت لودفيغز-فريبورغ على المساعدة في مواردهم من الفحص المجهري المحوري، والدعم الممتاز في تسجيل الصور.