Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

All'interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l'incapsulamento di vari carichi.

Gli elementi costituti recanti in modo proteico su misura sono candidati versatili per l'assemblaggio di strutture sopramolecolari come cellule minime, veicoli per la consegna di farmaci e scaffold enzimatici. A causa della loro biocompatibilità e sintonabilità a livello genetico, le proteine simili a Elastin (ELP) sono elementi costitutivi ideali per applicazioni biotecnologiche e biomediche. Tuttavia, l'assemblaggio di strutture sopramolecolari basate su proteine con proprietà fisiochimiche distinte e un buon potenziale di incapsulamento rimane impegnativo.

Qui forniamo due protocolli efficienti per l'autoassemblaggio guidato di ELP anfifile in architetture proteiche supramolecolari come coacervates sferiche, fibre e vescicole stabili. I protocolli di assemblaggio presentati generano compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) basati su ELP con proprietà fisico adattabili. I PMBC dimostrano il comportamento della separazione di fase e rivelano la fusione della membrana dipendente dal metodo e sono in grado di incapsulare molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse. I PNG risultanti hanno un alto potenziale applicativo come piattaforma di formulazione e somministrazione di farmaci, cellule artificiali e spazio di reazione compartimentato.

L'assemblaggio di strutture sovramolecolari per applicazioni biotecnologiche sta diventando sempre più importante^1,2,3,4,5. Per l'assemblaggio di architetture funzionali come coacervate, vescicoli e fibre con proprietà fisico desiderate è importante comprendere e controllare le proprietà fisicochimiche e conformazionali dei componenti. A causa della precisione molecolare delle molecole presenti in natura, i mattoni per le strutture sopramolecolari sono sempre più basati su lipidi, acidi nucleici o proteine. Rispetto ai polimeri sintetici, gli elementi costitutivi proteici consentono un controllo preciso sulle strutture sopramolecolari emergenti⁶ a livello genetico. La sequenza primaria di amminoacidi (aa) dei singoli blocchi di costruzione proteica codifica intrinsecamente le informazioni per il loro potenziale di assemblaggio dalla molecola fino al livello macroscopico, nonché la forma tridimensionale e le proprietà fisiche della struttura sopramolecolare finale⁷.

I metodi segnalati per l'assemblaggio di diverse strutture sopramolecolari spesso coinvolgono proteine anfifile come le proteine di elastina sensibili alla temperatura (ELP)^5,8,9, oleosina ricombinante¹⁰e proteine artificiali anfifili¹¹. I metodi innescati dalla temperatura hanno portato all'assemblaggio di micelle^4,10,12Fibre¹³Fogli¹⁴e vesciche^9,15,16. Sono stati applicati metodi che coinvolgono solventi organici per la formazione di vesciche dinamiche a base di proteine^8,11,14. Finora, i protocolli applicati per la formazione delle vesciche spesso non hanno il controllo dell'assemblaggio su assiemi di dimensioni micrometriche^16,17o hanno un rendimento di assemblaggio limitato⁵. Inoltre, alcune vesciche a base di ELP segnalate hanno compromesso il potenziale di incapsulamento¹²stabilità limitata nel tempo⁹. Affrontando questi inconvenienti, i protocolli presentati consentono l'autoassemblaggio di strutture sovramolecolari di dimensioni micrometriche e sub micrometriche con proprietà fisiologiche distinte, buon potenziale di incapsulamento e stabilità a lungo termine. Gli ELP anfifile su misura si assemblano in strutture supramolecolari, spaziando dalla gamma di coacervates sferiche e fasci di fibre contorte altamente ordinati alle vescicole unilamellar a seconda del protocollo applicato e delle condizioni ambientali associate. Grandi compartimenti vescicolari a base di membrana (PMBC) rivelano tutti i principali fenotipi come la fusione della membrana e il comportamento di separazione di fase analogo ai liposomi. I PMCC incapsulano in modo efficiente molecole di carico fluorescenti chimicamente diverse che possono essere monitorate utilizzando una semplice microscopia a epifluorescenza. I domini ELP ripetitivi utilizzati in questo studio sono interessanti elementi costitutivi per architetture sovramolecolari basate su proteine¹⁸. L'unità di ripetizione pentapeptide ELP (VPGVG) è nota per tollerare diverse aa oltre alla prolina alla quarta posizione (valine, V), pur conservando le sue proprietà strutturali e funzionali¹⁹. Il design di ELP anfifili contenenti domini idrofili e idrofobici distintivi è stato realizzato inserendo residui di aa guest (X) nella ripetizione VPGXG con distinta idifobicità, polarità e carica²⁰. I domini anfifili di ELP in cui sono dotati di fenilalanina idrofobica (F) o isoleuina (I) mentre il dominio idrofilo conteneva acido glutamico caricato (E) o arginina (R) come residui ospiti. Un elenco di costrutti ELP anfilici idonei e sequenze aa corrispondenti può essere trovato nelle informazioni supplementari e nei riferimenti^8,21. Tutti i mattoni dove dotati di piccoli coloranti fluorescenti o proteine fluorescenti per la visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza. mEGFP e altre proteine fluorescenti sono state fuse N-terminalemente ai domini idrofili degli anfifili ELP . I coloranti organici sono stati coniugati attraverso ceppo privo di rame promosso cicloaddition alkyne-azide (SPAAC) a un aminoacido innaturale introdotto in modo co-traduzionale (UAA). L'incorporazione co-traduzionale dell'UAApara-azidophenylalanine (pAzF)²²permette la modifica n-terminale del dominio eLP idrofilo. In questo modo il coloranti verde fluorescente BDP-FL-PEG₄-DBCO (BDP) o qualsiasi piccola molecola fluorescente con un ciclooctyne teso può essere utilizzato come sonda fluorescente. L'incorporazione di successo dell'UAA pAzF e la cicloaddition del colorante tramite SPAAC possono essere facilmente confermate tramite LC-MS/MS a causa di un'efficiente ionizzazione dei corrispondenti peptidi triptici⁸. Questo piccolo tincolo organico è stato applicato per ampliare la scelta del solvente per i protocolli di assemblaggio, poiché le proteine fluorescenti sono incompatibili con la maggior parte dei solventi organici. I due protocolli di assemblaggio più efficienti per le strutture sopramolecolari sviluppati nel nostro laboratorio sono descritti di seguito. Il metodo di gonfiore THF è compatibile solo con il tinri organico modificato ELP anfilico. Al contrario, il metodo di estrusione 1-butanol (BuOH) è compatibile con molte proteine come sonda fluorescente ad esempio mEGFP, poiché il metodo descritto conserva completamente la fluorescenza di queste proteine di fusione. Inoltre, l'incapsulamento di piccole molecole e il comportamento di fusione vescicolare funzionano meglio impiegando il metodo di estrusione BuOH.

1. Progettazione e clonazione di proteine anficani che assomigliano all'elastina (ELP)

1. Clonare e progettare i costrutti come descritto altrove^8,20. Plasmidi sono disponibili su richiesta.

2. Espressione proteica, purificazione e preparazione

1. Espressione di F20E20-mEGFP e F20E20-mCherry
   1. Inoculare la cultura dell'espressione principale dalla pre-cultura notturna a un OD₆₀₀ di 0,3. Incubare a 37 oC, 200 giri/m in sterile mezzo LB 400 mL integrato con antibiotici appropriati in una fiaschetta 2 L.
   2. Preparare la soluzione stock IPTG (1 M) per l'induzione della coltura dell'espressione in acqua ultrapura.
   3. Quando si raggiunge OD₆₀₀ 0,5–0,8, aggiungere IPTG alla coltura dell'espressione a una concentrazione finale di 1 mM e ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi centigradi. Lasciare l'espressione a 20 gradi centigradi per circa 20 h a 200 rpm.
2. Espressione di ELP anfifile contenente UAA pAzF
   1. Inoculare la cultura dell'espressione principale dalla pre-coltura egli coli durante la notte contenente i due plasmidi pEVOL pAzF e ad esempio pET28-NMBL-(TAG)R40F20-his a un OD₆₀₀ di 0,3 (vedere informazioni supplementari per le sequenze di amminoacidi). Incubare a 37 , 200 rpm in sterile 400 mL medio LB integrato con kanamicina e cloramramhenicol in un flacone 2 L.
   2. Preparare una soluzione di riserva da 100 mM pAzF in acqua ultrapura. Per 10 mL di soluzione di magazzino pAzF, pesare 206,2 mg pAzF e respenderlo in 8 mL di acqua ultrapura. Per sciogliere il pAzF sollevare il pH della soluzione con 3 M NaOH e mescolare vigorosamente. Quando pAzF è sciolto, abbassare con attenzione il pH a 10,5 e aggiungere acqua ultrapura ad un volume finale di 10 mL. Utilizzare un filtro sterile (0,22 m) e l'aliquota della soluzione in tubi di reazione da 2 mL.
   3. Preparare 1 M soluzione di stock IPTG in acqua ultrapura e 20% soluzione di stock arabinose in acqua ultrapura.
   4. Quando si raggiunge OD₆₀₀ 0,5–0,8, aggiungere pAzF alla cultura dell'espressione a una concentrazione finale di 2 mM. Incubare la coltura per 10 min, 37 c, 200 rpm per consentire l'assorbimento di pAzF.
   5. Indurre l'espressione della proteina bersaglio e l'espressione della necessaria sintetasi tRNA/t-RNA t attraverso l'aggiunta simultanea di IPTG (1 mM) e arabinose (2%) e ridurre la temperatura di incubazione a 20 gradi centigradi.
   6. Lasciare l'espressione a 20 gradi centigradi per circa 20 h a 200 rpm. Cultura dell'espressione di raccolta per centrifugazione a 4 gradi centigradi, 4000 x g,40 min.
3. Lisi cellulare e purificazione delle proteine
   1. Risospendere il pellet E. coli nel buffer di lisi (10 mL per litro di coltura; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0.25% Triton X-100) contenente lysozyme (0,1 mg/mL) e PMSF (0,1 mM). Incubare per 30 min sul ghiaccio e congelare e scongelare due volte successivamente immergendo il campione in azoto liquido.
   2. Sonicare la sospensione (30%, 15 volte, 30 s: 10 s pausa) e cancellare il lisato tramite centrifugazione (4 , 10,000 x g per 40 min).
   3. Purificare la proteina utilizzando la cromatografia di affinità (ad esempio su una colonna di nichel da 1 mL utilizzando un sistema FPLC collegato a un collettore frazionario; vedi Tabella dei materiali). Elusore la proteina con tampone di eluizione (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M di urea, 250-500 mM di imidazolo) e conservare a 4 mM fino a un'ulteriore elaborazione.
   4. Analizzare l'efficienza di purificazione tramite SDS-PAGE.

3. Modifica delle tinri degli ELP tramite SPAAC

1. Stimare approssimativamente la concentrazione della soluzione ELP.  Un_{assorbimento di 280} per la valutazione della concentrazione non è utile poiché la sequenza pAzF-R40F20 è priva di amminoacidi che assorbono nella gamma UV. Pertanto, un anfifilo ELP precedentemente lofilfato e ponderato può essere utilizzato come riferimento per il confronto delle bande SDS PAGE. Confrontando l'intesità del valore grigio sommato delle bande SDS PAGE da soluzioni ELP con concentrazioni note e il campione può essere stimato la concentrazione approssimativa del campione.
2. Aggiungere 1 -L l di colorante fluorescente BDP-FL-PEG4-DBCO (soluzione di 10 mM di stock; 20 M di concentrazione finale) a 500 -L della soluzione ELP (20 M). Incubare la reazione per circa 10 h a 15 , scuotendo e protetto dalla luce.
3. Per un ulteriore uso, dialze la reazione per rimuovere eccessivo BDP.
   1. E' una membrana di dialisi equilibrate (ad esempio 12 kDa cutoff) in acqua ultrapura per 10 min. Per fissare la membrana di dialisi nell'apertura, posizionare un coperchio del tubo di reazione con nucleo perforato sull'apertura, chiudendo così il tubo.
   2. Posizionare il tubo di reazione a testa in giù nel buffer scelto. Scambiare il buffer (2-5 L) due volte dopo la dialisi per almeno 3 h ogni volta. Rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate tra la membrana di dialisi e il tampone per garantire il successo della dialisi.

4. Protocollo di gonfiore THF

1. Diallyze soluzione ELP omogenea contro fosfato o tris buffer (10 mM) con pH stabile 7.5 per rimuovere sali e composti rimanenti dalla purificazione del suo tag.
2. Preparare il liofilizzatore e raffreddare fino alla temperatura di partenza per l'essiccazione.
3. La soluzione proteica dialzata in tubi di reazione da 1,5 mL (50-500 l per tubo) e il congelamento degli urti in azoto liquido. Per evitare la miscelazione indesiderata di diverse soluzioni proteiche durante l'essiccazione, i tappi con un piccolo foro possono essere messi sopra il tubo di reazione per sigillarlo parzialmente.
4. Togliere i campioni di proteine congelate dall'azoto liquido e metterli immediatamente nel liofilizzatore per iniziare l'essiccazione congelata. L'essiccazione del congelamento è terminata quando il campione è completamente asciutto (circa 24-48 h). Successivamente, ventilare gli ELP anfifili liofilizzati con N₂secco , quindi chiudere immediatamente i coperchi del tubo di reazione per evitare il contatto con l'umidità dell'aria.
5. Aggiungere la THF pura ai campioni di lofilde (ELP, 5-10 M) e posizionare la soluzione in un sonicatore del bagno d'acqua contenente acqua ghiacciata per 15 min per consentire il gonfiore dell'ELP in THF.
6. Preriscaldare un termociclore a 30-60 gradi centigradi per la formazione di vescicolari o fino a 90 gradi centigradi per la formazione di fibre e preparare nuovi tubi di reazione contenenti acqua ultrapura o tampone (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 5–13). I coacervates sferici si assemblano prevalentemente a 20 gradi centigradi entro il pH 9–13. La formazione delle vesciche è favorita a 50-60 gradi centigradi tra il pH 7 e il 9. La formazione di fibre è predominentemente indotta al di sopra dei 60 gradi centigradi tra pH 5 e 12.
7. Dopo la fase di sonicazione, posizionare la soluzione ELP/THF, nonché la soluzione di acqua o tampone ultrapura preparata nel termociclore e riscaldare fino alla temperatura desiderata per 5 minuti. Quando si raggiunge la temperatura, la soluzione ELP/THF preriscaldata deve essere accuratamente stratificata in cima all'acqua ultrapura preriscaldata o alla soluzione tampone. Dovrebbe essere visibile una netta separazione delle due fasi con un'interfaccia distinta.
8. Mettere nuovamente la miscela nel termociclore e incubare per 20 min per consentire la formazione di vescicle o fibre all'interfaccia. Successivamente, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per 10 min prima dell'analisi tramite microscopia a fluorescenza o dialisi.
9. Soluzione di dialyze contenente le strutture sopramolecolari contro acqua ultrapura o tampone (50 mM NaH₂PO₄/Na₂HPO₄, 50 mM NaCl, pH 7–10).

5. Protocollo di estrusione BuOH

1. Preparare una soluzione ELP da 1 a 50 m in acqua ultrapura o tampone (50 mM PB pH 7.5, 100 mM NaCl, può contenere fino a 4 M di urea). La concentrazione della soluzione anficana ELP F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry può essere determinata utilizzando i coefficienti di estinzione molare (F20R20-mEG FPA₂₈₀ - 22015 M^-1 cm^-1 e F20R20-mCherry A₂₈₀ x 34380 M^-1 cm^-1) (vedere informazioni supplementari per le sequenze aa).
2. Aggiungere 10%–20% (v/v) 1 butanol e mescolare immediatamente la soluzione pipetting su e giù o disegnando attraverso una siringa più volte. Può essere applicata una pipetta da 100 - o una siringa Hamilton dotata di ago da 0,25 x 25 mm. La torbidità della soluzione durante la miscelazione dovrebbe aumentare, indicando la formazione di vescicoli. 1-octanol 5%–15% (v/v) può essere utilizzato anche per l'estrusione vescica invece di 1-butanol.
3. Al fine di ottenere una distribuzione di dimensioni ridotte, estrudere vesciche utilizzando un mini estrusore attraverso una membrana con una dimensione del poro di 1 m a temperatura ambiente. La dimensione della membrana utilizzata per l'estrusione determina il taglio di dimensioni superiori delle vesciche.
4. Diallyze le vesciche come descritto sopra (passaggio 3.3) per rimuovere i residui 1-butanol.

6. Incapsulamento della tinrizione con il protocollo di estrusione BuOH

1. Mescolare circa 40 soluzione ELP in 10 mM Tris-HCl, pH 8 con 1 Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL concentrazione finale).
2. Aggiungere 10 l'l di BuOH alla soluzione ed estrudere 5-10 volte attraverso una siringa dotata di un ago da 0,25 x 25 mm.

7. Analisi delle strutture sovramolecolari mediante microscopia a fluorescenza

1. Posizionare un anello di rinforzo su uno scivolo di vetro e premere saldamente il lato adesivo al vetro.
2. Aggiungere 5 ll l del campione all'interno dell'anello di rinforzo e posizionare uno slittadio di copertura sulla parte superiore.
3. Sigillare il campione con smalto ai bordi dello slittamento di copertura per evitare l'evaporazione del campione durante l'analisi.
4. Eseguire la microscopia a fluorescenza come descritto in precedenza⁸.

Sviluppo di protocolli per la produzione di vescicoli
Figura 1 delinea i due diversi metodi di preparazione vescicano. Il metodo di gonfiore THF sul lato sinistro è composto da tre fasi successive e si traduce in diversi assemblaggi sopramolecolari dell'ELP a seconda della temperatura. Nella figura 1A le immagini di microscopia epifluorescenza mostrano vescicoli assemblati da BDP-R20F20 e strutture fibrillari assemblate da BDP-R40F20. Il metodo BuOH, illustrato sul lato destro, porta esclusivamente alla formazione di vescicoli ELP, producendo circa due ordini di grandezza più vesciche rispetto al metodo di gonfiore THF. L'illustrazione schematica mostra il processo di preparazione delle vesciche BuOH. Per la preparazione delle vesciche nella figura 1B BDP-R40F20 è stato mescolato con 10-15% (v/v) BuOH e vescicoli sono stati preparati tramite estrusione della miscela.

Guidare l'auto-assemblaggio supramolecolare in diverse strutture
La figura 2 mostra un'illustrazione schematica e immagini dell'epiorescenzae di diverse strutture sopramolecolari assemblate da BDP-R40F20 tramite il protocollo di gonfiore THF. In questo caso il BDP-R40F20 lyophilizzato è stato utilizzato per i diversi protocolli di assemblaggio. Il pH del buffer e la temperatura del processo di assemblaggio sono stati regolati per formare coacervates, fibrilles o vescicoli. I coacervates illustrati nella Figura 2A hanno un diametro compreso tra 1 e 2 m e sono stati assemblati da BDP-R40F20 a 20 e pH 13. La regolazione della temperatura di montaggio a 90 gradi determina la formazione di fasci di nanofibra (Figura 2B) a pH 4–13 testati con BDP-R40F20. Le vesciche stabili potevano essere assemblate a partire dall'ELP ad una temperatura di 50 e pH 7 (Figura 2C). Piccoli errori in uno dei passaggi cruciali del protocollo di assemblaggio possono portare alla formazione di aggregati illustrati nella Figura 2D.

Incapsulamento di carichi diversi
La figura 3 mostra l'incapsulamento di merci diverse nel lume vescicolo delle vescicoli assemblato da F20R20-mEGFP tramite il metodo di estrusione BuOH. Per l'incapsulamento del tintura caricato positivamente Atto Rho13 in Figura 3A, il tintura è stato mescolato con l'acquisiva soluzione ELP prima dell'aggiunta di (15% v/v) BuOH e l'estrusione della siringa della miscela. Le immagini di microscopia confocale mostrano le vesciche formate da F20R20-mEGFP nel canale verde, il colorno rosso AttoRho13 nel canale rosso e il canale fuso risultante mostra l'incapsulamento riuscito all'interno del lume vesicle.

Il polisasaccharide Dextran Red 3000 è stato incapsulato con successo utilizzando il metodo di estrusione BuOH come descritto sopra. Le immagini registrate in canale verde raffigurano le vesciche formate da F20R20-mEGFP mentre il canale rosso mostra il carico di polisacharide. Immagine verde e rossa unita in Figura 3B confermare il successo Dextran Rosso 3000 in lumen vescicolo.

Compatibilità dei componenti a membrana e separazione di fase delle vesciche buOH miste prima/dopo l'estrusione
La figura 4 mostra il comportamento di separazione di fase e fusione degli anfifili ELP durante la miscelazione di singoli elementi costitutivi PMBC rispetto alle popolazioni PMBC assemblate. La miscelazione di blocchi costitutivi eLP anfipianificazione (F20R20-mEGFP e F20R20-mCherry) prima dell'assemblaggio PMBC porta a molecole distribuite omogeneamente all'interno della membrana PMBC assemblata. La distribuzione omogenea dei fluorofori e degli anfifili ELP associati è evidente dalla fusione del canale rosso e verde delle rispettive immagini di fluorescenza. Mescolando popolazioni di vescicolo assemblate da F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry macchie di membrana chiaramente visibili di fluorescenza rossa o verde sono evidenti immediatamente dopo la miscelazione. Ciò indica che si verificano eventi di fusione PMBC di PCMC etichettati in modo diverso e che queste membrane di fusione e i loro costituenti rimangono fase separata per almeno 20 min. Un comportamento di fase simile è noto dalle zattere lipidiche, all'interno delle membrane lipidiche²³.

Figura 1: Illustrazione del metodo di gonfiore THF e del metodo di estrusione BuOH per l'autoassemblaggio guidato di ELP anfilici in strutture supramolecolari come vescicoli o fibre. Flusso di lavoro schematico e immagini di epifluorescenza rappresentative di (A) il metodo di gonfiore THF con BDP-R20F20 e BDP-R40F20 con conseguente diverse strutture sopramolecolari a seconda della temperatura e del pH e (B) il metodo di estrusione BuOH che produce esclusivamente vesciche da BDP-R40F20 (scala bar 2 sr). Questa cifra è stata modificata da Schreiber et al. 2019⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Applicando il metodo di gonfiore THF BDP-R40F20 si auto-assembla in diverse strutture supramolecolari. Le condizioni ambientali applicate durante il protocollo di assemblaggio (ad esempio temperatura o pH) determinano la struttura sopramolecolare predominante formata. Le strutture sovramolecolari rappresentative alle rispettive condizioni durante l'assemblaggio sono state monitorate tramite microscopia epifluorescenza e vanno da (A) coacervates e (B) fibrille a (C) vesciche stabili. (D) Il guasto nell'assemblaggio di strutture definite durante il protocollo di gonfiore THF porta alla formazione di aggregati non specifici (scala barra di 2 m). Questa cifra è stata modificata da⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Carichi diversi possono essere incapsulati all'interno di vesciche ELP utilizzando il metodo di estrusione BuOH. (A) mostra immagini confocali rappresentative delle vesciche F20R20-mEGFP con colorante incapsulato caricato positivamente AttoRho13 e (B) l'incapsulamento del polisaccharide dextran rosso (scala bar 5 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Compatibilità dei componenti a membrana e comportamento di fusione delle membrane vescicane assemblate da F20R20 tramite il metodo di estrusione BuOH. (A) La miscelazione di soluzioni proteiche fluorescenti F20R20 e F20R20-mCherry prima dell'estrusione della siringa porta alle membrane PMBC con proteine anfifianciche distribuite oomogeneamente visibili nel canale verde (immagine sinistra), nel canale rosso (immagine centrale) e nel canale unito (immagine a destra). (B) I PMBC assemblati da F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry e mescolati successivamente tramite estrusione della siringa portano a cerotti anfifili ELP separati all'interno delle membrane PMBC. Gli anfifili ELP separati all'interno della membrana sono visibili dopo la fusione PMBC per almeno 20 minuti in canale verde (immagine a sinistra), canale rosso (immagine centrale) e canale unito (immagine a destra). Le barre della scala corrispondono a 5 m. Questa cifra è stata modificata da Schreiber et al. 2019⁸. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un difetto mentre seguii i protocolli descritti per l'assemblaggio di strutture sopramolecolari definite porta principalmente alla formazione di aggregati non specifici (Figura 2, IV) o ad anfifili ELP distribuiti omogeneamente. I passaggi critici del protocollo sono descritti di seguito:

Per l'alta resa dell'alta espressione dell'ELP anfipotico, una temperatura relativamente bassa di 20 gradi centigradi è ottimale. Per una purificazione basata sull'affinità di successo dell'ELP anfihiphilico, è stato dimostrato che una concentrazione di urea di 4 M nel tampone di lisi è risultato soluficare al meglio l'ELP anficano e aumentare la resa proteica nella frazione di eluizione solubile. Se si desidera ridurre le concentrazioni di urea nel buffer di lisi, la purificazione dell'affinità deve essere testata per i singoli costrutti. 2 M urea ha funzionato anche per alcuni costrutti, specialmente per quelli in cui il Suo tag è stato fuso al dominio idrofilo e quindi ancora in grado di legare la resina.  Un ulteriore passaggio di purificazione dopo la purificazione dei His-tag tramite la cromatografia di esclusione delle dimensioni può aumentare anche la resa della vescica.

In caso di applicazione del protocollo di gonfiore THF, l'ELP anficano deve essere etichettato con un colorante organico fluorescente per la visualizzazione. È importante sottolineare che per l'etichettatura BDP dell'ELP anfilico (vedere le informazioni supplementari per le sequenze di amminoacidi contenenti UAA pAzF) tramite SPAAC è l'assenza di qualsiasi reduttore come TCEP, DTT o z-mercaptoethanolo in tutti i buffer di purificazione. Ciò è necessario per evitare la riduzione ben segnalata dell'azoto alla riduzione di pAzF prima della reazione SPAAC²⁴.

La stoichiometria di reazione esatta del colorante per l'ELP anfifile (ad esempio pAzF-R40F20) non è fondamentale in quanto non è necessario etichettare ogni singola molecola ELP per una semplice visualizzazione vescicolata tramite la microscopia dell'epiorescenza. Pertanto, la correlazione di una banda gel SDS di riferimento e del corrispondente campione di liofilità ponderato è necessaria solo una volta per ogni costrutto proteico. Tuttavia, se si desidera un rapporto tra il rendimento da tintura equivalente 1:1 e le molecole ELP è sufficiente. ELP anfifile molto simili sono stati analizzati nel nostro laboratorio per essere completamente etichettati in un'aggiunta equimolare di BDP (dati non ancora pubblicati).

Per la preparazione della vescicola utilizzando il metodo di gonfiore THF, i passaggi più critici sono il gonfiore dell'ELP anfilico lofilfato leofilizzato e la successiva stratificazione di questa soluzione in cima alla fase di tampone acquosa. Pertanto, l'ELP anfifilo appena lofilizzato dovrebbe essere il più anidroso possibile, che può essere raggiunto dalla ventilazione del loofilfatore con gas di azoto secco e la chiusura immediata dei coperchi del tubo di reazione. Se disponibile, il setto sigillato THF secco deve essere utilizzato per aumentare la resa della vescicola, ma THF p.a. (>99,5%) senza setto funziona pure. Il passo di stratificazione al momento del gonfiore dell'ELP anfipotico in THF secco deve essere eseguito con molta attenzione. Il successo della stratificazione delle due soluzioni a temperatura controllata porta ad un confine di fase chiaramente visibile tra fase organica e fase acquosa. La fase iniziale di stratificazione dovrebbe essere condotta lentamente anche se temperature elevate portano alla miscelazione indotta termica di queste fasi. La torbidità emergente della soluzione è dovuta alla diffusione della luce di vescicle, fibre o coacervates formati. Nei campioni di controllo privi di proteina, non appare alcuna torbidità attraverso strutture di piccole dimensioni (fino a 200 nm) per l'interfaccia ad acqua THF²⁵. La fase di stratificazione THF è la fase più critica e soggetta a guasti del protocollo di gonfiore. Dopo la fase di incubazione le strutture sopramolecolari possono essere dialuse contro il tampone o l'acqua ultrapura. Preferibilmente la stessa soluzione acquosa che è stata applicata per l'assemblaggio iniziale al fine di mantenere l'osmolarità e prevenire gonfiore o restringimento delle vesciche assemblate. Dopo la dialisi, le vesciche, le fibre e i coacervate sono di solito stabili per almeno una settimana. A seconda dei parametri ambientali durante l'assemblaggio spesso una piccola parte di altre strutture sopramolecolari oltre alla struttura principale sono presenti se viene applicato il metodo di gonfiore THF⁸. Il metodo THF descritto aumenta il rendimento dell'assemblaggio vescicolo di un ordine di grandezza, mentre l'estrusione BuOH migliora la resa di tre ordini di grandezza rispetto al nostro metodo in vitro pubblicato in precedenza⁵.

Il metodo di estrusione BuOH viene applicato per ottenere strutture vescicolari esclusivamente stabili con alta riproducibilità, elusione delle fibre e coacervates sferiche. Questo metodo è meno soggetto a errori e compatibile con le proteine fluorescenti. Pertanto F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry può essere applicato così come BDP-R40F20 o BDP-E20F20. L'unico passo critico è la rapida miscelazione della soluzione proteica acquosa dopo l'aggiunta del 10%–20% v/v BuOH. La concentrazione di F20R20-mEGFP o F20R20-mCherry dovrebbe essere di circa 1-15 M. Applicando le vesciche del metodo di estrusione BuOH possono essere assemblate in acqua ultrapura o tampone contenenti fino a 5 M NaCl o 4 M di urea e pH che vanno da 5 a 8. I PMBC estrusi in 20% v/v BuOH possono essere conservati per almeno 6 mesi a 4 o C, preservando la loro struttura vescicolare. Per restringere la distribuzione delle dimensioni della vescica, possono essere estruso utilizzando un mini estrusore attraverso una membrana di dimensioni pori di 0,2-1 m. Questa estrusione dei pori può essere eseguita direttamente dopo l'aggiunta di BuOH all'ELP anfihiphilico o dopo l'assemblaggio vescicolo. Se i PMBC sono troppo concentrati per l'imaging, le vesciche assemblate in BuOH possono essere diluite attraverso una rapida miscelazione utilizzando un buffer acquoso contenente 10%–20% v/v BuOH.

La limitazione principale del metodo di estrusione BuOH è che la dialisi PMBC contro i buffer acquosi spesso si traduce in scarsa resa vescicante. Inoltre, la presenza di BuOH residuo all'interno dello spazio della membrana non può essere esclusa poiché semplici acidi grassi sono stati in grado di incorporare nella membrana PMBC²¹. Pertanto, le membrane PMBC potrebbero essere in una certa misura composte da proteine e alcanole moieties.

L'incapsulamento di molecole di carico chimicamente diverse funziona meglio utilizzando il metodo di estrusione BuOH. Inoltre, il DMSO come solvente per la soluzione di riserva del tinrio da catturare aumenta l'efficienza di incapsulamento del tinri. Per il carico delicato da incapsulare, 5%–10% v/v 1-octanol può essere utilizzato per l'assemblaggio PMBC ed è stato dimostrato di essere meglio compatibile, rispetto a BuOH, con enzimi funzionali incapsulati come DNA-ligase o TEV protease^21,26. Tuttavia, a causa della lunghezza più corta della catena di n-butanol può essere dialyzed contro tampone acquoso in contrasto con 1-octanol, che non è in grado di permeare la dialisi-membrana applicata. Un'altra limitazione del metodo è che le temperature applicate e i valori di pH necessari per controllare la formazione desiderata di sovrastruttura possono influenzare l'attività degli enzimi. Nel lavoro futuro, la purificazione dell'affinità o la purificazione dell'esclusione delle dimensioni dovrebbero essere stabilite per separare le molecole non incapsulate da quelle incapsulate senza deteriorare l'integrità della membrana vescicante.

A differenza dei metodi di reidratazione delle pellicole^16,17 i protocolli descritti qui descritto consentono l'assemblaggio di vesciboli di dimensioni superiori a 600 nm. Ciò consente il monitoraggio degli eventi di fusione in tempo reale attraverso la semplice microscopia epifluorescenza e l'osservazione della separazione della fase della membrana⁸. Rispetto alla temperatura innescata assemblaggio vescicolare di ELP² anfipotico, i protocolli qui descritti producono PMBC con una stabilità temporale lunga fino a 6 mesi. Tuttavia, lo svantaggio principale è la necessità di solvente organico per la formazione della struttura. Anche se BuOH conserva pienamente l'integrità e la funzione delle proteine fluorescenti²⁷ (dati non mostrati), l'attività degli enzimi incapsulati potrebbe essere limitata da solvente organico residuo e deve essere testata individualmente. Tuttavia, le reazioni catalitiche che coinvolgono DNA-ligase, TEV-proteasi e lipase sono state condotte con successo all'interno dello spazio luminare delle vesciche, assemblate da 1-ottanolo o buOH estrusoria^26,21. Inoltre, anche se la dialisi THF dopo l'assemblaggio è molto improblematicata e l'integrità della vescica viene preservata, la rimozione del BuOH spesso comporta una perdita di integrità vescicante a causa di motivi sconosciuti.

I protocolli descritti consentono ai ricercatori di assemblare strutture sovramolecolari di dimensioni micrometriche e sub micrometriche con proprietà fisico distinte, buone proprietà di incapsulamento e stabilità temporale prolungata. Queste strutture sopramolecolari possono essere applicate per la progettazione di cellule minime²⁶ o ricerca cellulare artificiale²¹, incapsulamento enzimatico, o formulazione di droga. I PMBC funzionali presentati sono ulteriori candidati promettenti per la somministrazione di farmaci, dal momento che i loro elementi costitutivi non sono immunogenici²⁸, mostrano un comportamento di fusione dinamica e consentono un diverso incapsulamento del carico.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.

Gli autori ringraziano il BMBF per il sostegno finanziario e il Center for Biological Systems Analysis per aver fornito la struttura di ricerca. Siamo grati a P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, California, Stati Uniti per aver fornito il pEVOL-pAzF plasmide. Ringraziamo lo staff del Life Imaging Center (LIC) del Center for Biological Systems Analysis (BSA) dell'Albert-Ludwigs-University Friburgo per l'aiuto con le loro risorse di microscopia confocale, e l'eccellente supporto nella registrazione delle immagini.