בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

אבני בניין מותאמות פרוטטינואאוס הם מועמדים מגוונים עבור הרכבה של מבנים supraמולקולריים כגון תאים מינימליים, כלי רכב של משלוחי סמים והאנזים פיגומים. עקב תאימות תאימות שלהם על הרמה הגנטית, החלבונים כמו אלסטין (למשל) הם אבני בניין אידיאלי עבור יישומים ביו טכנולוגיים ביו-רפואיים. אף על פי כן, ההרכבה של מבנים supraמולקולריים מבוססי חלבון עם תכונות פיזיוכימיות ברורים ופוטנציאל מעטפת טוב נשאר מאתגר.

כאן אנו מספקים שני פרוטוקולים יעילים עבור הרכבה עצמית מודרך של elps אמפיפילי לתוך ארכיטקטורות חלבון סופרא מולקולרית כגון כדורי כדורית, סיבים ושלפוחיות יציבה. פרוטוקולי ההרכבה שהוצגו ליצור תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) מבוסס על ELPs עם תכונות הסתגלות פיסיוכימיקלים. PMBCs להפגין התנהגות הפרדת הפאזה וחשיפת שיטת היתוך ממברנה תלוי ומסוגלים לכמסים מגוון כימית מולקולות מטענים פלורסנט. PMBCs וכתוצאה מכך יש פוטנציאל יישום גבוה כמו ניסוח התרופה ופלטפורמת המסירה, תא מלאכותי, וחלל התגובה מידור.

הרכבת של מבנים supraמולקולריים ליישומים ביוטכנולוגיים הופכת להיות חשובה יותר ויותר^1,2,3,4,5. עבור ההרכבה של ארכיטקטורות פונקציונלי כגון מאכאוטים, ושלפוחיות, וסיבים עם תכונות פיסיוכימיקלים הרצוי חשוב להבין ולשלוט על המאפיינים הפיזיקליים והקונפורמציה של הרכיבים. בשל הדיוק המולקולרי של מולקולות שנמצאו בטבע, אבני בניין עבור מבנים supraמולקולריים מבוססים יותר ויותר על שומנים, חומצות גרעין או חלבונים. לעומת פולימרים סינתטיים, אבני הבניין פרוטטינואאוס לאפשר שליטה מדויקת על מבנה סופרא מולקולרית מתהווה⁶ ברמה הגנטית. החומצה האמינית העיקרית (aa) הרצף של אבני בניין חלבון בודדים מקודד את המידע עבור פוטנציאל ההרכבה שלהם מן המולקולרי עד רמת מאקרוסקופי, כמו גם את הצורה תלת מימדי ותכונות פיזיות של מבנה סופרא מולקולרית הסופי⁷.

שיטות מדווחות להרכבת מבנים מולקולריים שונים מעורבות לעתים קרובות בחלבונים מסוג שונות, כגון אלסטין עם חלבונים רגישים בטמפרטורה.^{מיכל 5,8,9}, רקומביננטי oleosin¹⁰ומטבעוניים של חלבון מלאכותי¹¹. הטמפרטורות שגרמו לשיטות הובילו להרכבת מיקרולים^4,10,12, סיבים¹³, סדינים¹⁴ושלפוחיות^9,15,16. שיטות הכוללות ממיסים אורגניים הוחלו על היווצרות חלבון דינאמי מבוסס שלפוחיות^8,11,14. עד כה, פרוטוקולים שהוחלו עבור היווצרות שלפוחית לעיתים קרובות חסרים בקרת הרכבה על הרכבות בגודל מיקרומטר^16,17או שיהיה ברשותך תפוקת הרכבה מוגבלת^{מיכל 5}. בנוסף, יש המדווחים על מספר שלפוחיות של המבוסס על היכולת לפגום בפוטנציאל¹²או יציבות מוגבלת לאורך זמן⁹. הטיפול בחסרונות אלה, הפרוטוקולים המוצגים מאפשרים הרכבה עצמית של מבני מיקרומטר ומיקרומטר מולקולרי בגודל תת-מיקרומטר עם תכונות פיזיוכימיות ברורים, פוטנציאל מעטיפת טוב ויציבות זמן רב. מותאם במיוחד להרכיב מבנים מולקולריים, המשתרעים על-ידי מגוון כדורי וחבילות סיבים מעוותים לunilamellar שלפוחיות בהתאם לפרוטוקול המוחל ולתנאי הסביבה הקשורים. חלבון וממברנה גדול מבוססי קרום התאים (PMBC) לחשוף את כל פנוטיפים הראשי כגון פיוז'ן ממברנה התנהגות הפרדת פאזה אנלוגית ליפוזומים. PMBCs מכמס ביעילות מולקולות מטענים פלורסנט מגוונת אשר ניתן לפקח באמצעות מיקרוסקופ epiפלואורסצנטי פשוט. הדומיינים החוזרים ונשנים בשימוש במחקר זה הם אבני בניין אטרקטיבי עבור ארכיטקטורות מבוססות חלבון סופרא מולקולרית¹⁸. יחידת החזרה הפנטדית של סיוע (vpgvg) ידועה לסבול aa שונה מלבד פרולין בעמדה הרביעית (valine, V), תוך שמירה על מאפיינים מבניים ופונקציונלי¹⁹. העיצוב של ELPs אמפיפילי המכיל תחומים הידרופיפילית והידרופובי ייחודיים התממשו על ידי החדרת שאריות האורחים aa (X) ב VPGXG חזרה עם הידרופוטטי ברורים, קוטביות, טעינה²⁰. בתחומים שונים של הידרופובי (F) או איזולאוצין (I) בעוד התחום ההידרופילי הכיל גלוטמית חומצה (E) או ארגינין (R) כפסולת אורחים. ניתן למצוא רשימה של בנייה מתאימה של מבנים למען הילד ורצפי ה-aa במידע המשלים והפניות^8,21. כל אבני הבניין שבו מצוידים או עם צבעי פלורסנט קטנים או חלבונים פלורסנט עבור ויזואליזציה באמצעות מיקרוסקופ ניאון. מגה-בוקס וחלבונים פלורסנט אחרים היו N-סופני התמזגו לתחומים הידרופילי של האמפיפינרס. הצבעים האורגניים היו מצוענים באמצעות מאמץ לקדם את הנחושת, לאחר שהוא הציג את חומצת האמינו הטבעית (UAA). התאגדות השיתוף המשותף של ה-UAApara-azidophenאלצין²²מתיר את השינוי של מסוף N. של התחום ההידרופילי בדרך זו צבע פלורסנט ירוק BDP-FL-יתד₄-DBCO (BDP) או כל מולקולה פלורסנט קטנה עם cyclooctyne מתוח יכול לשמש לווין פלורסנט. התאגדות מוצלחת של ה-UAA פזגז ו ציקלותוספת של הצבע באמצעות ספאץ ניתן לאשר בקלות באמצעות LC-MS/MS בשל אינון יעיל של פפטידים טריפטיים המקביל⁸. צבע אורגני קטן זה הוחל כדי להרחיב את בחירת הממס עבור פרוטוקולי ההרכבה, מאז חלבונים פלורסנט אינם תואמים את רוב המיסים האורגניים. שני פרוטוקולי ההרכבה היעילים ביותר עבור מבנים מולקולריים שפותחו במעבדה שלנו מתוארים להלן. שיטת הנפיחות THF תואם רק עם צבע אורגני שונה למען הטוב ביותר. לעומת זאת, 1-butanol (BuOH) שיטת ההבלטה תואמת חלבונים רבים כמו בדיקה פלורסנט לדוגמה mEGFP, מאז השיטה המתוארת משמר באופן מלא את הזריחה של אלה חלבונים היתוך. בנוסף, כימוס של מולקולות קטנות התנהגות היתוך vesicular עובד הטוב ביותר על ידי שימוש בשיטת BuOH שחול.

1. עיצוב ושיבוט של לאלסטין שונים, כמו חלבונים (ELPs)

1. לשכפל ולעצב את המבנים כמתואר במקום אחר^8,20. המלון מציע שירותי פלמידים על פי בקשה.

2. ביטוי חלבון, טיהור והכנה

1. ביטוי של F20E20-מגלית וF20E20-מדובדבן
   1. החזר תרבות הביטוי העיקרי מן הלילה טרום תרבות עד OD₆₀₀ של 0.3. מודטה ב 37 ° c, 200 סל"ד ב סטרילי 400 mL ליברות בינונית בתוספת של אנטיביוטיקה מופקעים 2 L בקבוקון.
   2. הכינו פתרון מניות IPTG (1 מ ') עבור אינדוקציה של תרבות הביטוי במים באולטרטהורים.
   3. כאשר ה-OD₆₀₀ 0.5-0.8, הוסיפו לתרבות הביטוי iptg לריכוז סופי של 1 מ"מ והפחת את טמפרטורת הדגירה ל-20 ° c. אפשר ביטוי ב -20 ° c עבור כ 20 h ב 200 סל ד.
2. התבטאות בעלי משפט ומשפט המכיל את ה-UAA פזף
   1. ביטוי התרבות העיקרית של הביטוי הראשי של E. coli לפני התרבות המכילה את שני הפלמידים Pevol pET28 ו למשל-NMBL-(תג) R40F20-שלו כדי OD₆₀₀ של 0.3 (ראה מידע משלים עבור רצפי חומצות אמינו). מודטה ב 37 ° c, 200 סל"ד ב סטרילי 400 mL ליברות בינונית בתוספת עם kanamycin ו כלוראמאנקול בבקבוקון 2 L.
   2. הכינו מניות 100 מ"מ לפתרון מלאי של פזגז במים באולטרטהורים. עבור 10 מ ל של פתרון מניות של פזגז, שוקלים 206.2 מ"ג פזגז ולהשעות אותו ב 8 מ ל של מים אולטרה טהורים. כדי לפזר את פזגז להעלות את ה-pH של הפתרון עם 3 M NaOH ומערבבים במרץ. כאשר פזגז מומס, הנמך בזהירות את ה-pH כדי 10.5 ולהוסיף מים באולטרטהורים לנפח הסופי של 10 מ"ל. השתמש במסנן סטרילי (0.22 μm) ו-סדרת מחלקים הפתרון ב 2 שפופרות תגובה mL.
   3. להכין פתרון מלאי iptg 1 M במים באולטרטהור ו 20% אראבינוז מניות פתרון ב-אלקטרופורזה מים.
   4. כאשר מגיעים OD₆₀₀ 0.5-0.8, הוסיפו את התרבות הבהבעה לריכוז הסופי של 2 מ"מ. התרבות הדגירה עבור 10 דקות, 37 ° c, 200 rpm כדי לאפשר ספיגה של פזף.
   5. לגרום לביטוי של חלבון מטרה וביטוי של trna/t-RNA הצורך הדרוש באמצעות תוספת בו של iptg (1 מ"מ) ו אראבינוז (2%) ומפחיתים את טמפרטורת הדגירה ל-20 ° c.
   6. אפשר ביטוי ב -20 ° c עבור כ 20 h ב 200 סל ד. ביטוי הקציר תרבות על ידי צנטריפוגה ב 4 ° צ', 4000 x g, 40 דקות.
3. פירוק תאים וטיהור חלבונים
   1. השהה מחדש את גלולה ה-coli במאגר הליזה (10 מ ל לליטר התרבות; 50 mm טריס-HCl pH 8, 500 מ"מ הנאל, 4 מ שתנן, 0.25% טריטון X-100) המכיל ליזוזים (0.1 mg/mL) ו pmsf (0.1 mM). דגירה של 30 דקות על הקרח להקפיא ולהפשיר פעמיים לאחר מכן על ידי מיזוג המדגם בחנקן נוזלי.
   2. Sonicate ההשעיה (30%, 15 פעמים, 30 s: 10 s לשבור) ולנקות את הליפוסט דרך צנטריפוגה (4 ° צ', 10,000 x g עבור 40 דקות).
   3. טיהור חלבונים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה (למשל על עמודת ניקל בגובה 1 מ ל באמצעות מערכת FPLC המחוברת לאספן שברים; ראו טבלת חומרים). אליוט חלבון עם מאגר להתחמק (50 mM טריס-HCl, 500 מ"מ הנאל, 4 מ אוריאה, 250 – 500 מ"מ הסרפיזציה) ולחנות ב 4 ° צ' עד לעיבוד נוסף.
   4. לנתח את יעילות הטיהור באמצעות SDS-PAGE.

3. צבען-שינוי של ELPs באמצעות ספאץ

1. מעריכים בערך את הריכוז. של פתרון המענה העצמי  ₂₈₀ הקליטה להערכת הריכוז אינה חשובה מאז הרצף של פזגז-R40F20 הוא חסר חומצות אמינו קליטת בטווח UV. לכן, ניתן להשתמש באפשרות זו בתור התייחסות להשוואת הלהקה של SDS PAGE. באמצעות השוואה בין שווי הערך האפור הסוכם של להקות העמודים של SDS באמצעות ריכוזים ידועים והדגימה שלך, ניתן להעריך את הריכוז הגולמי של המדגם.
2. להוסיף 1 μL של צבע פלורסנט BDP-FL-PEG4-DBCO (10 מ"מ פתרון במניה; 20 הריכוז הסופי μM) עד 500 μL של פתרון לתמיסת הסקה (~ 20 μM). מודגנת את התגובה על 10 h ב 15 ° c, תוך טלטול ומוגן מפני אור.
3. לשימוש נוסף, dialyze התגובה להסרת BDP מוגזם.
   1. מקלדת קרום דיאליזה (כגון הפסקת כמות של 12 מטרים) במים אולטרה טהורים במשך 10 דקות. חותכים את קרום הדיאליזה לגודל הנכון כדי להיות ממוקם על גבי הפתיחה של צינור התגובה המכיל את הפתרון בקליק. כדי לתקן את קרום דיאליזה בפתח, מניחים מכסה צינור התגובה עם אגרוף ליבה על הפתח, ובכך לסגור את הצינור.
   2. מניחים את צינור התגובה הפוך במאגר שנבחר. להחליף את המאגר (2 – 5 L) פעמיים אחרי דיאליזה עבור לפחות 3 h בכל פעם. הסר את בועות האוויר לכוד בין קרום הדיאליזה לחיץ כדי להבטיח דיאליזה מוצלחת.

4. פרוטוקול נפיחות של THF

1. Dialyze פתרון הומוגנית לתמיסת מלח נגד פוספט או טריס מאגר (10 מ"מ) עם 7.5 יציב pH כדי להסיר מלחים והשאר תרכובות מתוך טיהור תג שלו.
2. הכן את הליאופליזר והקר את הטמפרטורה כדי להתחיל בייבוש.
3. מחלקים את תמיסת החלבון דיאליזה בצינורות התגובה 1.5 mL (50 – 500 μl לצינור) והקפאת זעזועים בחנקן נוזלי. כדי למנוע ערבוב לא רצויים של פתרונות חלבון שונים במהלך הקפאת לייבוש, כובעים עם חור קטן ניתן לשים על גבי צינור התגובה כדי לאטום אותו באופן חלקי.
4. קחו את דגימות החלבון הקפוא מתוך החנקן הנוזלי ומיד מניחים אותם בליאופליזר כדי להתחיל בייבוש. ייבוש ההקפאה הוא סיים כאשר המדגם יבש לחלוטין (כ 24 – 48 h). לאחר מכן, באופן מיידי לסגור את שפופרת התגובה היבשה עם N₂יבש, ולאחר מכן סגרו מיד את עפעפיו של הריאקציה כדי למנוע מגע עם לחות האוויר.
5. הוסיפו THF טהורה לדגימות הלינולים (לדוגמה, 5 – 10 μM) ומניחים את הפתרון באמבט מים sonicator המכיל מי קרח במשך 15 דקות כדי לאפשר נפיחות של הטוב ביותר ב THF.
6. מחממים את הציקלל1 עד 30 – 60 ° צ' עבור היווצרות שלפוחית המים או עד 90 ° c עבור היווצרות סיבים ולהכין צינורות תגובה חדשה המכילה או בדקה אלקטרופורזה או מאגר (50 mm ארנה₂פו₄/Na₂hpo₄, 50 מ"מ הנאקל, pH 5 – 13). הרכב כדורי התאספו בעיקר ב -20 ° c בתוך pH 9-13. היווצרות שלפוחית הוא המועדף על 50-60 ° צ' בין pH 7 ו -9. היווצרות סיבים המושרה בעיקר מעל 60 ° צ' בין ה-pH 5 ו 12.
7. לאחר השלב הsonication, מניחים את התמיסה לשתיה/THF, כמו גם את הפתרון המוכן במיוחד למים או לאגירה בתוך הציקלהטרטרנר ומחממים עד לטמפרטורה הרצויה במשך 5 דקות. כאשר הטמפ ' מגיעה לפתרון של מחמם המים החמים והמחוממים, יש למלא את התמיסה הגבוהה ביותר באמצעות מיים או מאגר. הפרדה ברורה של שני השלבים עם ממשק ייחודי צריכה להיות גלויה.
8. מניחים את התערובת בתוך הציקלייט שוב ו-דגירה עבור 20 דקות כדי לאפשר שלפוחית או היווצרות סיבים בממשק. לאחר מכן, תנו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני הניתוח באמצעות מיקרוסקופ קרינה או דיאליזה.
9. הפתרון dialyze המכיל את המבנים supraמולקולריים נגד מים באולטרסאונד או מאגר (50 mM ארנה₂פו₄/Na₂Hpo₄, 50 מ"מ הנאל, pH 7 – 10).

5. פרוטוקול BuOH שחול

1. להכין 1 – 50 μM פתרון לתמיסת מיים במים או במאגר (50 mM PB pH 7.5, 100 mM הנאקל, עשוי להכיל עד 4 M אוריאה). הריכוז של הפתרון האמפיבי F20R20-mEGFP ו F20R20-mCherry ניתן לקבוע באמצעות מקדמים מהכחדה מולרי (F20R20-mEGFP A₂₈₀ = 22015 m^- 1^{ס"מ-1 ו F20R20} -Mcherry a₂₈₀ = 34380 m^-1 ס"מ^-1) (ראה מידע משלים עבור רצפי aa).
2. הוסף 10% – 20% (v/v) 1-butanol ומיד לערבב את הפתרון על ידי ליטוף למעלה ולמטה או לצייר אותו באמצעות מזרק מספר פעמים. 100 משותף μL הפיפטה או מזרק המילטון מצויד המחט 0.25 x 25 מ"מ ניתן להחיל. העכירות של הפתרון במהלך ערבוב צריך להגדיל, המציין היווצרות שלפוחית. 1-octanol 5% – 15% (v/v) ניתן להשתמש גם עבור שחול ושלפוחית במקום 1-butanol.
3. על מנת להשיג התפלגות בגודל צר, הבלטת שלפוחיות באמצעות משטח הבלטת ממד דרך קרום עם גודל נקבובית של 1 יקרומטר בטמפרטורת החדר. גודל הממברנה המשמש להבלטה קובע את החיתוך בגודל העליון של השלפוחיות.
4. Dialyze השלפוחית כפי שתוארה לעיל (שלב 3.3) כדי להסיר שיורית 1-butanol.

6. עטיפת צבע עם פרוטוקול BuOH ההבלטה

1. מערבבים כ 40 μL פתרון בערך 10 מ"מ טריס-HCl, pH 8 עם 1 μL Dextran טקסס אדום (0.0025 mg/mL הריכוז הסופי).
2. הוסף 10 μL של BuOH לפתרון ואת הבלטת 5 – 10 פעמים דרך מזרק מצויד במחט 0.25 x 25 מ"מ.

7. ניתוח מבנים מולקולריים באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

1. מניחים טבעת חיזוק על שקופית זכוכית ולחץ בחוזקה על הצד הדביק לזכוכית.
2. הוסף 5 μL של המדגם לתוך החלק הפנימי של טבעת חיזוק ולמקם שובר כיסוי על גבי.
3. חותם את המדגם עם לק ציפורניים בקצות שובר הכיסוי כדי למנוע אידוי של המדגם במהלך הניתוח.
4. לבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטית כמתואר בעבר⁸.

פיתוח פרוטוקולים לייצור ושלפוחית
איור 1 מתווה את שתי שיטות ההכנה השונות של שלפוחית הדעת. שיטת הנפיחות THF בצד שמאל מורכב משלושה שלבים רצופים ותוצאות הרכבות supraמולקולריים שונים של הטוב ביותר בהתאם לטמפרטורה. באיור 1A תמונות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית להראות שלפוחיות התאספו מ BDP-R20F20 ו fibrillary מבנים התאספו מ BDP-R40F20. השיטה BuOH, מומחש בצד ימין באופן בלעדי מוביל היווצרות של שלפוחית המזל, מניב על שתי הזמנות של בהירות יותר ושלפוחיות לעומת שיטת הנפיחות THF. האיור הסכמטי מציג את תהליך ההכנה של בוהו ושלפוחיות. להכנת שלפוחית באיור 1B bdp-R40F20 היה מעורב עם 10-15% (v/v) buoh ו שלפוחיות היו מוכנים דרך שחול של התערובת.

הנחיית הרכבה עצמית מולקולרית למבנים שונים
איור 2 מציג איור סכמטית ותמונות אפיסטיות של מבנים supraמולקולריים שונים התאספו מ-BDP-R40F20 באמצעות פרוטוקול הנפיחות thf. במקרה זה, השתמשו בR40F20 באמצעות פרוטוקול ההרכבה השונים. ה-pH של המאגר והטמפרטורה של תהליך ההרכבה הותאמו ליצירת מדבקות, פיברילס או שלפוחיות. המאכורטים מתוארים באיור 2A 1 – 2 יקרומטר בקוטר והם התאספו מ bdp-R40F20 ב 20 ° c ו-pH 13. התאמת טמפרטורת ההרכבה ל 90 ° c תוצאות היווצרות של צרורות ננו סיבים (איור 2ב) ב-pH 4 – 13 נבדק עם bdp-R40F20. שלפוחית יציבה יכולה להיות מורכב מן האוכל בטמפרטורה של 50 ° c ו-pH 7 (איור 2ג). טעויות קטנות באחד מהצעדים הקריטיים בפרוטוקול ההרכבה יכולות להוביל להיווצרות אגרגטים המתוארים באיור 2ד.

כימוס של מטענים שונים
איור 3 מראה את האנקפסולציה של מטענים שונים לתוך שלפוחית הומן של ושלפוחיות התאספו מ F20R20-megfp באמצעות שיטת buoh ההבלטה. עבור האנקפסולציה של הצבע טעונה חיובי Atto Rho13 באיור 3A, הצבע היה מעורבב עם הפתרון המים המימית לפני תוספת של (15% v/v) buoh ו מזרק שחול של התערובת. התמונות המיקרוסקופיה הקונסקטיות מציגות את השלפוחיות הנוצרות מ-F20R20-mEGFP בערוץ הירוק, הצבע האדום AttoRho13 בערוץ האדום והערוץ הממוזג שנוצר מראה את האנקפסולציה המוצלחת בתוך לומן השלפוחית.

רב-הסוכר Dextran אדום 3000 בוצע בהצלחה באמצעות שיטת BuOH ההבלטה כמתואר לעיל. תמונות שנרשמו בערוץ הירוק מתארות את השלפוחיות שנוצרו מ-F20R20-mEGFP בזמן שערוץ אדום מראה את מטען רב-סוכר. תמונה ירוקה ואדומה ממוזג באיור 3B לאשר את מוצלחת dextran אדום 3000 כימול לומן ושלפוחית.

תאימות רכיב ממברנה הפרדת הפאזה של BuOH ושלפוחיות מעורבת לפני/אחרי שחול
איור 4 מראה את הפרדת הפאזה והתנהגות היתוך של מטבעונים של האמפיפילנים על ערבוב של אבני בניין pmbc יחיד לעומת אוכלוסיות pmbc מורכבים. ערבוב בלוקים של הבניין לפני הייצור (F20R20-mEGFP ו F20R20-mCherry) לפני הרכבת PMBC מוביל מולקולות מבוזרות באופן ברור בתוך קרום PMBC התאספו. התפלגות הומוגנית של fluorophores ו משויך האמפיפיליים הקשורים הוא ברור על מיזוג הערוץ האדום והירוק של תמונות פלואורסצנטית בהתאמה. על ידי ערבוב אוכלוסיות שלפוחית לפוחית התאספו בין או F20R20-megfp או F20R20-mcherry בבירור טלאים ממברנה גלויים של אדום או ירוק ברור מיד לאחר ערבוב. הדבר מעיד על כך שאירועי היתוך PMBC בעלי תווית שונה של Pmbc מתרחשים וכי הקרומים הללו והמרכיבים שלהם להישאר מופרדים לפחות 20 דקות. התנהגות בפאזה דומה ידועה הרפסודות ליפיד, בתוך ממברנות ליפידים²³.

איור 1: איור של שיטת הנפיחות THF ואת שיטת BuOH ההבלטה עבור ההרכבה העצמית המודרכת של מבני ELPs אמפיפילי לתוך מבנים מולקולריים כגון שלפוחיות או סיבים. תהליך סכימטי ותמונות מייצגת של (א) שיטת הנפיחות thf עם BDP-R20F20 ו BDP-R40F20 וכתוצאה מכך מבנים supraמולקולריים שונים בהתאם לטמפרטורה ו-pH ו (ב) שיטת buoh ההבלטה בלעדית מניב ושלפוחיות מ bdp-R40F20 (סרגל בקנה מידה 2 μm). דמות זו שונתה משרייבר ואח ' 2019⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: על ידי יישום שיטת הנפיחות THF BDP-R40F20 עצמית מרכיב לתוך מבנים supraמולקולריים שונים. תנאי הסביבה החלים במהלך פרוטוקול ההרכבה (למשל טמפרטורה או pH) קובעים את המבנה הטרום-מולקולרי הנשלט. נציג מבנים מולקולריים מייצגים בתנאים המתאימים במהלך ההרכבה היו במעקב באמצעות מיקרוסקופ אפיטוליטי וטווח מתוך (א) מוקאכטים ו (ב) סיבים כדי (ג) יציבה שלפוחיות. (ד) כשל בהרכבה של מבנים מוגדרים במהלך פרוטוקול הנפיחות THF מוביל להיווצרות אגרגטים לא ספציפיים (סרגל בקנה מידה 2 μm). דמות זו השתנתה מ-⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מכוניות שונות ניתן לעטוף בתוך שלפוחיות ושלפוחית באמצעות שיטת BuOH ההבלטה. (א) מציג אתהדמויותהקונמטיות של הנציגה של F20R20-megfp עם שלפוחיות עם מחויב לצבוע AttoRho13 ו (ב) עטיפת הצבע האדום (בקנה מידה 5 μm). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תאימות רכיבים ממברנה התנהגות היתוך של ממברנות veשעית התאספו מ F20R20 באמצעות שיטת BuOH שחול. (A) ערבוב של פלורסנט F20R20-mEGFP ו F20R20-mCherry פתרון חלבון לפני מזרק-שחול מוביל ממברנות PMBC עם מופץ באופן מוחשי החלבונים בתוך העין בערוץ ירוק (התמונה השמאלית), ערוץ אדום (התמונההאמצעית), וערוץ ממוזג (התמונה הימנית). (ב) pmbcs התאספו בין או F20R20-megfp או F20R20-mcherry מעורב ולאחר מכן באמצעות שחול מזרק להוביל להפריד את הטלאים של ומופרדים בתוך ממברנות pmbcs. בתוך הקרום ניתן לראות לאחר היתוך PMBC לפחות 20 דקות בערוץ ירוק (תמונה שמאלית), ערוץ אדום (התמונה האמצעית) והערוץ הממוזג (תמונה מימין). סרגלי קנה מידה מקבילים ל-5 μm. דמות זו שונתה משרייבר ואח ' 2019⁸. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

תקלה בזמן השימוש בפרוטוקולים המתוארים להרכבת מבנים מולקולריים מוגדרים, מובילה בעיקר להיווצרות אגרגטים לא ספציפיים (איור 2, IV) או להפצת הומוגנרים. שלבים קריטיים של הפרוטוקול נדונים להלן:

בעבור התשואה הגבוהה של המידע האמפיבי, טמפרטורה נמוכה יחסית של 20 ° c היא אופטימלית. לטיהור מבוסס אהדה מוצלחת של האמפיפיל האמפיבי ריכוז אוריאה של 4 מ ' במאגר הליזה הוכח לפתרון הטוב ביותר האמפיפיל האמפיבי ולהגדיל את תפוקת החלבון בשבר להתחמק מסיסים. אם ריכוזי אוריאה תחתון במאגר הליזה הם הרצויים, טיהור אהדה חייב להיבדק עבור המבנים הבודדים. 2 שתנן עבד גם עבור כמה בנייה, במיוחד עבור אלה שבו התגית שלו היה מחובר לתחום הידרופילי ולכן עדיין מסוגל לאגד את שרף.  צעד טיהור נוסף לאחר שלו-תג טיהור באמצעות הדרה כרומטוגרפיה גודל יכול להגביר את התשואה שלפוחית לפוחית כמו גם.

במקרה של החלת הפרוטוקול THF-נפיחות, את הצרכים האמפיפילי צריך להיות מתויג עם צבע אורגני פלורסנט עבור ויזואליזציה. החשוב ביותר עבור התיוג BDP של האמפיפיל האמפיבי (ראה מידע משלים לרצפי חומצות אמינו המכילים UAA פזגז) באמצעות ספאץ ' הוא העדר של כל האלסטנט כגון TCEP, DTT ולא β-mercaptoethanol בכל מאגרי הטיהור. זה הכרחי כדי למנוע את מדווחת היטב אזיד כדי אמין הפחתת של פזגז לפני התגובה ספאק²⁴.

את התגובה המדויקת הסטואיצ'ימטריה של הצבע כדי לעשות למען הטוב ביותר (כגון פזגז-R40F20) הוא לא קריטי שכן אין צורך לתייג כל מולקולה מיקרוולית והדמיה פשוטה באמצעות מיקרוסקופ אפיסטנטית. לכן, הקורלציה של להקת SDS ג'ל והמדגם המשוקלל המתאים נדרש רק פעם אחת עבור כל מבנה חלבון. עם זאת, אם קרוב 100% תשואה לתיוג הוא הרצוי יחס של 1:1 לצבוע המקבילה למולקולות של מולקולות. מאוד דומה האמפיפילי ELPs נותחו במעבדה שלנו כדי להיות מתויג באופן מלא בתוספת שווה של BDP (הנתונים עדיין לא פורסם).

להכנת הכנת שלפוחית באמצעות שיטת הנפיחות THF, הצעדים הקריטיים ביותר הם נפיחות של ליאופריבוד האמפיפילית ולאחר מכן הבאים של פתרון זה על גבי שלב מאגר מימית. לפיכך, הדרך הטרייה של הננו-אפים מחייבת להיות בלתי הפיך ככל האפשר, שניתן להשיג באמצעות אוורור של ליאופליזר עם גז חנקן יבש וסגירה מיידית של עפעפי התגובה. אם זמין, מחיצת נעל אטום יבש יש להשתמש כדי להגדיל את התשואה שלפוחית השמש, אבל THF העוזר (> 99.5%) גם ללא עבודות מחיצת המחיצה. הצעד הריבוד על הנפיחות של האוכל האמפיבי של THF יבש צריך להתבצע בזהירות מרבית. ריבוד מוצלחת של שני פתרונות מבוקרת טמפרטורה מוביל גבול הפאזה גלוי בבירור בין שלב אורגני ומימית. הצעד הראשוני ריבוד צריך להתבצע לאט למרות טמפרטורות גבוהות להוביל ערבוב תרמית המושרה של שלבים אלה. מתהווה עכירות של הפתרון בשל פיזור אור של שלפוחיות, סיבים או מוצאכטים. בדגימות שליטה חסר החלבון, אין העכירות מופיע למרות בגודל קטן מבנים (עד 200 ננומטר) מדווחים על ממשק המים THF²⁵. הצעד THF ריבוד הוא הצעד הקריטי ביותר ונוטה כישלון של פרוטוקול נפיחות. לאחר שלב הדגירה המבנים המולקולריים יכול להיות דיאליזה נגד מאגר או מים באולטרטהורים. מעדיפים את אותו פתרון מימית יש להשתמש אשר הוחל על ההרכבה הראשונית כדי לשמור על האוסמטיות ולמנוע נפיחות או כיווץ של שלפוחיות המורכב. לאחר דיאליזה, השלפוחיות, סיבים ומוקאכטים יציבים בדרך כלל למשך שבוע אחד לפחות. בהתאם לפרמטרים הסביבתיים במהלך ההרכבה לעתים קרובות חלק קטן של מבנים supraמולקולריים אחרים מלבד המבנה העיקרי הם נוכחים אם שיטת הנפיחות THF מוחל⁸. שיטת thf המתוארת מגדילה את התשואה ההרכבה שלפוחית באמצעות סדר גודל אחד בזמן buoh ההבלטה משפרת את התשואה על ידי שלוש הזמנות של גודל בהשוואה לאור שלנו שפורסם בעבר בשיטה מחוץ לגופית⁵.

שיטת BuOH ההבלטה מוחל על מנת להשיג באופן בלעדי מבנים vesicular יציבה בלעדית עם שיקוף גבוה, סיבים האוורור וכדורי הכדורית. שיטה זו היא פחות שגיאה הנוטה ותואמת חלבונים פלורסנט. לכן F20R20-mEGFP או F20R20-mCherry ניתן להחיל, כמו גם BDP-R40F20 או BDP-E20F20. הצעד הקריטי היחיד הוא ערבוב מהיר של תמיסת חלבון מימית לאחר תוספת של 10% – 20% v/v BuOH. ריכוז F20R20-mEGFP או F20R20-mCherry צריך להיות בסביבות 1 – 15 μM. על-ידי החלת buoh שיטת ההבלטה ושלפוחיות ניתן להרכיב במים אלקטרופורזה או מאגר המכיל עד 5 m הנאגול או 4 m אוריאה ו-pH החל 5 אל 8. הבלטת מבנה PMBCs בתוך 20% v/v או BuOH ניתן לאחסן לפחות 6 חודשים ב 4 ° c תוך שמירה על המבנה המקביל שלהם. כדי לצמצם את התפלגות גודל שלפוחית התינוק, הם יכולים להיות הבלטת באמצעות משטח הבלטת ממד דרך קרום של 0.2-1 יקרומטר גודל הנקבוביות. זה שחול הנקבובית יכול להיעשות ישירות לאחר buoh תוספת לקבל את העבודה האמפיפילית או לאחר הרכבה שלפוחית. אם PMBCs הם מרוכזים מדי עבור הדמיה, התאספו שלפוחיות ב BuOH יכול להיות מדולל באמצעות ערבוב מהיר באמצעות מאגר מימית המכיל 10% – 20% v/v BuOH.

המגבלה העיקרית של שיטת BuOH ההבלטה היא כי PMBC דיאליזה נגד מאגרים מימית לעתים קרובות גורמת לתשואה עניים שלפוחית. עוד, הנוכחות של BuOH שיורית בתוך מרחב הקרום לא ניתן להוציא מאז חומצות שומן פשוטות הצליחו לשלב לתוך קרום PMBC²¹. לכן, ממברנות PMBC יכול להיות במידה מסוימת להיות מורכב של חלבון alkanol moieties.

כימוס של מולקולות מטענים כימית מגוון עובד הטוב ביותר באמצעות שיטת BuOH ההבלטה. עוד, DMSO כמו ממס עבור פתרון המניה של הצבע כדי להילכד מגביר את היעילות עטיפת הצבע. עבור מטענים עדינים להיות אנקפסולציה, 5% – 10% v/v 1-octanol יכול לשמש הרכבה pmbc והוכח להיות תואם טוב יותר, כאשר בהשוואה buoh, עם אנזימים שעברו אנקפסולציה תפקודית כגון DNA-ligase או tev פרוטאז^21,26. עם זאת, בשל אורך שרשרת קצרה של n-butanol זה יכול להיות דיאליזה מאגר מימית בניגוד ל-1-octanol, אשר אינו מסוגל לחלחל את קרום דיאליזה מיושם. מגבלה נוספת של שיטה היא כי הטמפרטורות שהוחלו ואת ערכי ה-pH הדרושים כדי לשלוט על היווצרות מבנה suprastructure רצוי יכול להשפיע על פעילות אנזימים. בעבודה בעתיד, טיהור אהדה או הוצאה לאור טיהור בגודל צריך להיות מוקם כדי להפריד שאינו מעובד לעומת מולקולות שעברו אנקפסולציה ללא הידרדרות שלמות קרום הממברנה.

בניגוד לשיטות הצילום של הסרט^16,17 הפרוטוקולים המתוארים להלן מאפשרים הרכבה של גדלים ושלפוחיות גדולים מ-600 ננומטר. זה מאפשר ניטור של אירועי היתוך בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ אפיזיאני פשוט והתבוננות של הפרדה בשלב הממברנה⁸. לעומת הטמפרטורה הופעלה הרכבה של האמפיפיל האמפיבי⁹ הפרוטוקולים המתוארים כאן להניב PMBC עם יציבות זמן רב של עד 6 חודשים. עם זאת, החיסרון העיקרי הוא הצורך של הממס האורגני עבור מבנה המבנה. למרות BuOH לחלוטין שומר על היושרה והתפקוד של חלבונים פלורסנט²⁷ (נתונים לא מוצגים), הפעילות של אנזימים מוכלאים עשוי להיות מוגבל על ידי הממס אורגני שיורית יש לבדוק בנפרד. עם זאת, תגובות קטליטי מעורבים DNA-ligase, tev-פרוטאז ו ligase נערכו בהצלחה בתוך שטח הלומיאל של שלפוחיות, התאספו על ידי 1-octanol או buoh שחול^26,21. בנוסף, למרות thf דיאליזה לאחר ההרכבה היא בעייתית מאוד שלמות שלפוחית לפוחית נשמר, הסרת buoh לעתים קרובות התוצאות הפסד של שלמות שלפוחית בשל סיבות לא ידועות.

הפרוטוקולים המתוארים מאפשרים לחוקרים להרכיב מבני מיקרומטר מיקרומטר מולקולרית מבנים סופרא מולקולרית בגודל מולקולרי עם תכונות כימיות שונות, תכונות אנקפסולציה טוב, ויציבות זמן רב. אלה מבנים supraמולקולריים ניתן להחיל על העיצוב של תאים מינימליים²⁶ או מחקר תא מלאכותי²¹, עטיפת אנזים, או ניסוח התרופה. PMBCs פונקציונלי הציג עוד מועמדים מבטיחים עבור העברת סמים, מאז אבני הבניין שלהם אינם מתפקדים²⁸, התערוכה מיצג היתוך דינמי, ולאפשר עטיפת מטענים שונים.

המחברים לא מצהירים על אינטרסים פיננסיים מתחרים.

המחברים מודים ל-BMBF לתמיכה פיננסית ולמרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (מרכז המחקר) למתן מתקן מחקרי. אנו אסירי תודה לפ. ג. שולץ, TSRI, לה הויה, קליפורניה, ארה ב לאספקת הפלפמיד pEVOL-פזף. אנו מודים לצוות של מרכז הדמיה לייף (LIC) במרכז לניתוח מערכות ביולוגיות (Ludwigs SA) של ה אלברט-, אוניברסיטת פרייבורג לעזרה עם משאבי המיקרוסקופיה שלהם, ותמיכה מצוינת בהקלטת תמונה.