Sıçanlarda Karbon Tetraklorür (CCl₄₎Orogastrik Tüp Ile Maruz Kalma Yoluyla Akut Karaciğer Hasarının Neden

Bu protokol, orogastrik tüp yoluyla CCl₄ maruziyeti yoluyla akut karaciğer hasarı (ALI) indükleyen yaygın ve uygulanabilir bir yöntemi tanımlar. CCl₄ maruziyeti, karaciğerdeki biyotransformasyonu sırasında reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla ALI'yi indükler. Bu yöntem ALI'nin patofizyolojisini analiz etmek ve farklı hepatoprotektif stratejileri incelemek için kullanılır.

Akut karaciğer hasarı (ALI), hepatik ensefalopati ve bozulmuş protein sentezi gibi komplikasyonlar da dahil olmak üzere ciddi karaciğer disfonksiyonu ile karakterize olan hepatik yetmezlik gelişiminde önemli bir rol oynar. Uygun hayvan modelleri ALI'nin mekanizmasını ve patofizyolojisini test etmek ve farklı hepatoprotektif stratejileri araştırmak için hayati önem taşımaktadır. Kimyasal dönüşümler gerçekleştirebilme yeteneği nden dolayı, karbon tetraklorür (CCl₄₎karaciğerde reaktif oksijen türlerinin oluşumu yoluyla ALI'yi indüklemek için yaygın olarak kullanılır. CCl₄ maruziyeti intraperitoneally yapılabilir, inhalasyon yoluyla, veya bir nazogastrik veya orogastrik tüp yoluyla. Burada, ali bir orogastrik tüp ile CCl₄ maruz ilerlediği bir kemirgen modeli, açıklar. Bu yöntem ucuzdur, kolayca gerçekleştirilir ve en az tehlike riski vardır. Model son derece tekrarlanabilir ve yaygın potansiyel hepatoprotektif stratejilerin etkinliğini belirlemek ve karaciğer hasarı belirteçleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Özellikle alkol ve uyuşturucu kullanımı nedeniyle karaciğere yapılan toksik hakaretlerin sıklığı artmaktadır. Akut karaciğer hasarı (ALI) yüksek mortalite oranları ile ilişkilidir ve klinik kaygılara neden olmuştur^1,2. Toksik yaralanma karaciğerde ölüm sinyal yollarını yol açar, hepatosit apoptoz, nekroz veya piroptoz ile sonuçlanan. ALI hepatik ensefalopati ve bozulmuş protein sentezi gibi komplikasyonlar da dahil olmak üzere ciddi karaciğer disfonksiyonu ile karakterize dir hepatik yetmezliği gelişiminde önemli bir rol oynar^3,4. Son araştırmalar hepatik yetmezliğe eşlik eden fizyolojik ve patolojik değişiklikler hakkındaki bilgimizi artırmış olsa da, hücre ölüm mekanizmalarını etkileyen patomoleküler özellikleri tam olarak açıklamamıştır. Ayrıca, ali hastalarında ilerleyici bozulmayı tersine çevirmek için şu anda hiçbir ilaç mevcut değildir. Şu anda, tek önemli ölçüde etkili tedavi karaciğer nakli^5,6.

ALI'nin mekanizmasını ve patofizyolojisini araştırmak ve farklı hepatoprotektif stratejileri test etmek için, ALI'yi ikna etmek için farklı hayvan modelleri kullanılmaktadır. ALI'nin tercih edilen bir hayvan modeli, güvenilir, doğrulanmış, ucuz ve uygulaması kolay bir yöntemle hastalığın patolojik sürecini taklit etmelidir. Deneysel modellere örnek olarak hepatotoksik ajanlar, total veya parsiyel hepatektomi gibi cerrahi işlemler, tam veya geçici devaskülarizasyon ve enfektif işlemler^7,8,9sayılabilir. Bilinen hepatotoksik maddeler galaktosamin, asetaminofen, tiyoasetamid, azoksitanatuar ve CCl₄içerir. Bunlardan, CCl₄ yaygın olarak henüz iyi karakterize edilmemişolmasına rağmen kullanılır^10,11,12,13.

CCl₄ tatlı bir koku ve düşük sıcaklıklarda hemen hemen hiç yanıcı organik renksiz sıvı bileşiktir. CCl yüksek konsantrasyonlarda maruz_{kalma 4} merkezi sinir sistemi hasara neden olabilir, karaciğer ve böbreklerin bozulması da dahil olmak üzere. CCl₄ reaktif oksijen türlerini oluşturan karaciğerde biyotransformasyon yoluyla ALI indükler. Bu P450 sitokrom enzim 2E1 yoluyla oluşur, aktif bir metabolit oluşturan ve makromolekül bağlanması ile hücre hasarı ile sonuçlanan, lipid peroksidasyonu geliştirme ve hücre içi kalsiyum homeostaz bozukluğu¹⁴. Buna ek olarak, CCl₄ modeli RNA sentezi düzeyinde astrosituyarmak için kullanılabilir¹⁵. Bu hepatotoksin intraperitoneal, intraportal, oral ve intragastrik yolları tarafından uygulanmıştır¹⁶.

Bu protokolde, bir orogastrik tüp ile sıçanlarda CCl₄-indüklenen ALI ayrıntılı olarak açıklayın. Bu yöntem, ALI patogenezini araştırmak için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir ALI'yi indükler. Karaciğer hastalığının şiddetinin belirlenmesi serum glutamat-pirüuvaz transaminaz (GPT), glutamik oksaloasetik transaminaz (GOT) enzimleri ve total bilirubin (TB) ölçümü ve hematoksilin ve eozin (H&E) ile kesin histolojik tanı ile izlenir. İntragastrik erişim yoluyla CCl_4'e maruz kalmak, en az tehlike riski olan pratik, ucuz, minimal invaziv bir yönteme olanak sağlar.

Deneyler Helsinki ve Tokyo Bildirileri'nin tavsiyeleri ve Avrupa Topluluğu'nun Deneysel Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Yönergeler'e göre gerçekleştirilmiştir. Deneyler Negev Ben-Gurion Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.

NOT: CCl₄ modeli bir önceki çalışmada oluşturuldu ve¹⁷. Protokol zaman çizelgesi Tablo 1'degösterilmiştir.

1. Farelerin deneysel prosedüre hazırlanması

NOT: 300−350 g ağırlığında yetişkin erkek Sprague Dawley sıçanlarını seçin.

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nden (IACUC) deneyler için onay alın.
2. Sıçanları oda sıcaklığında (22 °C ± 1 °C), 12 saat Açık ve 12 saat karanlık döngülerle koruyun. Sıçan chow ve su reklam libitum sağlayın.
3. 06:00 ile 12:00 arasında tüm deneyleri gerçekleştirin.
4. Sıçantıraş ve alkol ile cildi dezenfekte.

2. Serum GOT, GPT ve TB taban çizgisi düzeylerinin belirlenmesi

1. Anestezi
   1. Anestezi yi tetiklemek için sürekli bir isoflurane yönetim sistemi hazırlayın. Buharlaştırıcı sisteminin isoflurane ile dolu olduğundan emin olun.
   2. Sıçanı %2 isoflurane ile anesteize et. Dışarıdan uyaranlara yanıt olarak hareket ve pedal refleksini gözlemleyerek farenin tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
      NOT: Anestezi indüksiyonu ve bakımı için %1−5 isofluran kullanın.
2. Kuyruk damarını 22 G kateterle kanüle edin.
3. Taban çizgisinde 0,5 mL kan örneği alın. Alınan kan hacminin IACUC yönergelerini aşmadığından emin olun.
4. Daha önce açıklandığı gibi serum GOT, GPT ve TB ölçümleri de dahil olmak üzere kan biyokimyasal analiz yapmak¹⁸.
   NOT: Karaciğer enzimleri ve tüberküloz düzeyi tetkikleri Soroka Tıp Merkezi'nin biyokimyasal laboratuvarında yapılmıştır. Kan örnekleri bir kimya analizörü(Tablo Malzemeler)üzerinde floresan yöntemi kullanılarak analiz edildi.

3. Sıçanlarda akut karaciğer hasarıin indüksiyonu

DİkKAT: CCl₄yüksek konsantrasyonlarda maruz kalma , buhar veya deri yoluyla emilimi de dahil olmak üzere, merkezi sinir sistemi üzerinde olumsuz etkileri olabilir ve karaciğer ve böbreklerin dejenerasyonuna neden olabilir. Uzun süreli maruz kalma koma veya ölüme neden olabilir.

1. CCl_4'ü zeytinyağı ile 1:1 oranında karıştırarak %50 oranında CCl₄ (Malzeme Tablosu)çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Çözelti, farmasötik olmayan sınıflar için IACUC yönergelerine göre hazırlanmalıdır.
2. Bir orogastrik tüp ile CCl₄ uygulaması ile in vivo hepatotoksisite indüklemek.
   1. Farenin ağız boşluğuna 16 G orogastrik tüp (3 inç derinliğinde) yerleştirin.
   2. Farenin midesine aşağıdaki seyreltilmiş çözeltilerden biriyle bir şırınga enjekte ederek sıçanı Farklı dozlarda CCl_4'e maruz bırakın: 1 mL/kg (hafif ALI), 2,5 mL/kg (orta ALI) veya %50 çözeltinin 5 mL/kg (şiddetli ALI). Sham-operated kontrol grubu için, sıçanı sadece 5 mL/kg zeytinyağına maruz bırakın.

4. Serum GOT, GPT ve Tüberküloz düzeylerinin 24 saat sonra belirlenmesi

1. Anestezi
   1. Anestezi yi tetiklemek için sürekli bir isoflurane yönetim sistemi hazırlayın. Buharlaştırıcı sisteminin isoflurane ile dolu olduğundan emin olun.
   2. Fareleri %2 isoflurane ile anestezi. Dışarıdan uyaranlara yanıt olarak hareket ve pedal refleksini gözlemleyerek farenin tamamen anestezi yediğini doğrulayın.
2. CCl₄ maruziyetinden 24 saat kan örneği alın.
3. Serum GOT, GPT ve Tüberküloz ölçümleri de dahil olmak üzere kan biyokimyasal analizleri yapın.

5. Histolojik inceleme için karaciğer toplanması

1. %20 O₂/80% CO₂ile ilham gaz karışımı değiştirerek sıçan ötenazi. CO_2'nin IACUC yönergelerine uygun olarak önceden belirlenmiş bir hızda teslim edilmesini sağlayın.
2. Kalp atışı eksikliğini kontrol ederek ölümü sağlayın ve IACUC yönergelerine uygun olarak ikincil bir yöntemle onaylayın.
3. Onun sırt yüzeyi aşağı bakan ve karın yukarı bakan bir diseksiyon tahtası üzerinde sıçan yerleştirin. Farenin karnını tıraş edin.
4. Bir neşter ile, anüs çene için ventrum deri tam uzunluğu eğim. Deriyi ayırın. Anüsten ksifoid kıkırdak için bir neşter ile karın duvarı incise, karın vissera açığa.
5. Makas ve forceps kullanarak, onun ligamentler ve ekleri onu keserek karaciğer izole. Karaciğer hilum başlayarak, dikkatle ekleri tüm karaciğer lobları serbest bırakarak bir hepatektomi gerçekleştirin. Tüm bağları ve kan damarlarını kesip kes.
6. Karaciğeri petri kabına aktar. En az 24 saat boyunca %4 oranında tamponlu formaldehit çözeltisi(Malzeme Tablosu)içinde karaciğeri düzeltin.

6. Histolojik inceleme

1. Numune hazırlama
   1. Fiksasyondan sonra, mikrotome kesitile numuneyi 5 μm kalınlığında dilim serisine kesin.
   2. Dilimleri yumuşak bir fırçayla, slayt başına 1 dilim le cam slaytlara yavaşça yerleştirin.
   3. Daha önce açıklandığı gibi H & E boyama gerçekleştirin¹⁹.
2. 20 mm objektif lens(Malzeme Tablosu)kullanarak 200x büyütmede bir mikroskop altında dilimleri inceleyin.
   NOT: Karaciğer bölümleri tedavi protokolüne kör olmuş uzman bir patolog tarafından derecelendirilmelidir. 0 skoru karaciğer anormallikleri gösterir, 1-2 hafif karaciğer hasarı gösterir, 3-4 orta karaciğer hasarı gösterir, ve 5-6 ciddi karaciğer hasarı gösterir^20,21,22.

TB, GOT ve GPT düzeyleri, sahte çalışan kontrollere göre ALI'yi (daha yüksek CCl₄ dozlarında daha fazla) indükledikten sonra 24 saat arttı (p < 0.001)(Şekil 1). Taban çizgisindeki Tüberküloz, GOT ve GPT düzeyleri normaldi ve sahte kontrollerden önemli ölçüde farklı değildi. Saat 24'te, her üç girişimsel grup, 1 mL/kg CCl₄ (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4) ve 5 mL/kg CCl₄ (4, 4−5,75), sahte kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha yüksek histolojik derecelendirme skoruna sahipti (0, 0−0) (p < 0.05, median olarak sunulan veriler, 25−75% aralığında). Sahte bir kontrol(Şekil 2A)ve farklı CCl₄ dozlarına maruz kalan grupların(Şekil 2B−D)H&E görüntüleri, CCl₄ maruziyetinden 24 saat sonra histopatolojik değişiklikler göstermektedir. CCl₄ ile hepatosellüler mimarinin bozulması büyük fibröz septa deformasyonu, liflerin uzantısı, kollajen birikimi ve karaciğer kesitlerinde psödo lob ayrımı ile yüksek derecede doku hasarı ile gösterilmiştir(Şekil 2).

Şekil 1: Serum Tüberküloz (A), GOT (B) ve GPT (C) düzeyleri kan örneklerinde 24 saat farklı CCl maruz kaldıktan sonra₄ doz sham-işletilen kontroller ile karşılaştırıldığında. Mavi çubuk: kontrol; kırmızı çubuk: CCl₄ pozlama dan 24 saat sonra. CCl₄-maruz kalan sıçanlar ve maruz kalan sıçanlar arasındaki karşılaştırmaların önemi Mann-Whitney testi kullanılarak belirlenir. <0.05 p değeri önemli kabul edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çeşitli dozlarda 24 saat CCl₄ zehirlenmesinden sonra H&E ile boyanmış karaciğer dokusunda histopatolojik değişiklikler. (A) sham-işletilen kontrol, (B) 1 mL/kg CCl₄, (C) 2,5 mL/kg CCl₄ve (D) 5 mL/kg CCl₄. Ölçek çubuğu = 50 μm. Histolojik sonuçların dağılımı doğrusal regresyon ile öngörülmüştür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokol zaman çizelgesinin gösterilmesi. Farklı zamanlarda sıçanların çeşitli gruplar bir sham işletilen kontrol grubu, hafif ALI (maruz kalma 1 mL/kg CCl_4),orta ALI (maruz kalma 2.5 mL/kg CCl₄), ve şiddetli ALI (maruz kalma 5 mL/kg CCl_4). Bu dönemde serum GOT, GPT ve Tüberküloz düzeyleri ölçüldü ve dört grup için histolojik muayene yapıldı.

Bu protokolde, CCl₄ sıçanlarda ALI indüklemek için bir karaciğer toksin olarak kullanılır. ALI karaciğer parankim kaybı ve karaciğermetabolik ve sentetik fonksiyonların sonraki disregülasyon ile karakterizedir. İlaçlar, virüsler, toksinler, otoimmün hastalıklar, metabolik hastalıklar ve vasküler hastalıkların hepsi hepatosit ölümüne neden olur ve sonraki inflamatuar yanıt ALI'nin patogenezine katkıda bulunur.

Karaciğere ilk hakaret sitokin üretimine yol açar, kemokin salınımı, ve karaciğeriçine inflamatuar hücrelerin sonraki infiltrasyon. ALI değerlendirme için sık test edilen biyobelirteçlerden üçü GPT, GOT ve TB düzeyleridir. GPT ve GOT aktivite düzeyine göre ölçülen enzimlerdir, Tüberküloz düzeyi ise karaciğer fonksiyonlarını serum konsantrasyonu ile ölçer. Yükseldiğinde serum enzim aktivitesi düzeyleri hepatosit veya kolanjiyositlerin yaralanmasını gösterir^23. Hızlı spektrofotometrik yöntem ilk olarak 1955²⁴yılında Arthur Karmen'in çalışmalarında bildirilmiştir ve bu yöntem serum enzim ölçümünün yaygın klinik uygulamasına olanak sağlamıştır. O zamandan beri hepatosit yaralanmasını saptamak için GOT ve GPT ölçümleri de uygulanmıştır. GPT daha sık kullanılır ve eşzamanlı GPT testi genellikle gereksiz sonuçları ortaya çıkarır. Serbest bırakma oranları ve yaralı hücrelerden temizleme oranları arasında GOT ve GPT aktivite düzeylerinde artış hücrelere yaralanma oranını yaklaşık ölçmek için kullanılabilir. Yaralı karaciğer hücreleri karaciğerin normal aktivitelerinde başarısızlığa neden olduğunda, örneğin bilirubinin safra gibi işlenmesi ve çıkarılması gibi, bu ALI'nin daha şiddetli olduğunu gösterir.

Protokolde kritik ve dikkatli bir değerlendirmeyi hak eden birkaç adım vardır. Çoğu protokol, serum enzim konsantrasyonu düzeylerinde yükseklikler yaygın olduğundan, araştırmacı ajana maruz kalmadan önce ve sonra serum biyomarker testi gerektirir. Ancak, yüksek ALT zamanlaması dalgalanmalar nedeniyle, herhangi bir yükseklik tespit etmek için periyodik olarak çeşitli testler yapılmalıdır. Bu protokolde, got, GPT ve Tüberküloz düzeylerini taban çizgisinde ve toksine maruz kaldıktan sonra 24 saat test etmeyi seçtik. Son çalışmalara göre, bu biyobelirteçlerin düzeyleri de bu zaman aralığında ALI şiddeti ile ilişkili¹⁷. Şekil 1'degösterildiği gibi, ALI'yi indükledikten sonra tüm örneklerde kan GOT, GPT ve Tüberküloz düzeyleri 24 saat olarak yükseltildi. Bu model CCl maruz kalma bu yana çok kısa bir zaman aralığında sonuçları nicel olduğunu gösterir_4. Bir dikkate alınmalıdır ki şiddetli ALI karaciğer GOT ve GPT sentez yeteneğini kaybeder. Bu nedenle, bu durumlarda bu enzimler literatürde gösterildiği gibi tahmin değeri eksikliği olabilir.

CCl_4'e maruz kalan sıçanların histolojik bulguları hücrelerin balonlanması, centrilobuler nekroz ve meclis üyesi organlarının varlığı ile karakterizedir²⁵. Bu modelde uygulanan CCl₄ dozu ile orantılı olduğu gösterilen yaygın hasar vardı.

Orogastrik CCl₄ maruziyeti ile ALI'yi indükleme yönteminin birçok avantajı vardır. Basit, ucuz ve minimum tehlike riski ile. Protokol çok kısa bir zaman aralığında önemli sonuçlar sağlar. Model son derece tekrarlanabilir ve yaygın potansiyel hepatoprotektif stratejilerin etkinliğini belirlemek ve karaciğer hasarı belirteçleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu CCl₄ esas olarak karaciğer merkezi bölge etkiler dikkat etmek önemlidir, hangi genellikle insan karaciğer yetmezliği görülen masif nekroz eşleşmiyor. Ayrıca, CCl₄ tamamen karaciğerde metabolize değildir, ve bazı nonmetaboliz_{CCl 4} diğer organlara zarar verebilir, akciğerler ve böbrekler de dahil olmak üzere¹⁶. Buna ek olarak, sitokrom P450 gelişimi ve etkinliği farklı düzeylerde nedeniyle, tür ve yaş²⁶bağlı olarak duyarlılık büyük bir varyasyon vardır. Bu sınırlamalar rağmen, orogastrik CCl₄-indüklenen ALI yöntemi hala değerli bir kemirgen modeli olarak hizmet vermektedir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yazarlar minnetle Bertha Delgado, Patoloji Bölümü, Soroka Tıp Merkezi, Sağlık Bilimleri Fakültesi, Ben-Gurion Üniversitesi Necef, laboratuvar yanı sıra histoloji analizi nde yaptığı yardım için kabul.