גרימת פגיעה חמורה בכבד חולדות באמצעות פחמן טטרכללוריד (CCl₄) חשיפה באמצעות צינורית אורוקיבה

פרוטוקול זה מתאר שיטה נפוצה ומקובלת לגרימת פגיעה בכבד חריפה (ALI) באמצעות החשיפה של CCl₄ דרך צינור הקיבה. החשיפה CCl₄ גורמת ALI דרך היווצרות של מינים חמצן תגובתי במהלך ביומרה בכבד. שיטה זו משמשת כדי לנתח את הפתופסולוגיה של עלי ולבחון אסטרטגיות hepatop, שונים.

פגיעה חריפה בכבד (ALI) ממלאת תפקיד מכריע בהתפתחות כשל הכבד, אשר מאופיין בתפקוד כבד של בעיות כגון סיבוכים כגון אנצפלופתיה הכבד סינתזה חלבון לקויי. מודלים בעלי חיים מתאימים חיוניים לבדיקת המנגנון והפתופסולוגיה של עלי ולחקור אסטרטגיות שונות של hepatopquo. בשל יכולתה לבצע טרנספורמציות כימיות, פחמן טטרכלוריד (CCl₄) נמצא בשימוש נרחב בכבד כדי לגרום ALI דרך היווצרות של מינים חמצן תגובתי. חשיפה CCl₄ ניתן לבצע intraperitoneally, על ידי שאיפת, או דרך שפופרת או באמצעות צינור הקיבה. כאן, אנו מתארים מודל מכרסם, שבו עלי נגרמת על ידי חשיפה CCl₄ דרך צינור הקיבה. שיטה זו זולה, מבוצעת בקלות והיא מסכנת סיכון מינימלי. המודל הוא מאוד ניתן לשימוש והוא יכול לשמש רבות כדי לקבוע את היעילות של אסטרטגיות hepatopquo פוטנציאלי ולהעריך סמנים של פציעה בכבד.

תדירות העלבונות הרעילים לכבד, בעיקר בשל אלכוהול ושימוש בסמים, גוברת. פגיעה חריפה בכבד (עלי) קשורה לשיעורי תמותה גבוהים וגרמה לחששות קליניים^1,2. פציעה רעילה מובילה למוות איתות מסלולים בכבד, וכתוצאה מכך ההיפטציט אפופטוזיס, נמק, או פירופסיס. עלי משחק תפקיד מכריע בהתפתחות כשל הכבד, אשר מאופיין בתפקוד כבד בעיות כולל סיבוכים כגון אנצפלופתיה הכבד סינתזה חלבון לקויי^3,4. למרות שמחקרים אחרונים הגדילו את הידע שלנו על השינויים הפיזיולוגיים והפתולוגיים הנלווים לכישלון הכבד, הוא לא הסביר לחלוטין את התכונות הפתומקולריות המשפיעות על מנגנוני מוות התאים. יתר על כן, תרופות אינן זמינות כעת כדי להפוך את ההתדרדרות הפרוגרסיבית בחולים ALI. כיום, הטיפול האפקטיבי היחיד באופן משמעותי הוא השתלת כבד^5,6.

על מנת לחקור את המנגנון ואת פתופסיולוגיה של עלי ולבדוק אסטרטגיות hepatopquo שונים, מודלים בעלי חיים שונים משמשים כדי לגרום ALI. מודל בעל חיים מועדפת של עלי לחקות את התהליך הפתולוגי של המחלה באמצעות שיטה אמינה, מאומתת, זולה וקלה להחלה. דוגמאות של מודלים ניסיוניים כוללים סוכני hepatotoxic, הליכים כירורגיים כגון סה כ כריתת העין הכוללת, מלאה או ארעי הליכים, ו-בהליכים מסוימים^7,8,9. חומרים מוכרים כוללים את החומר הרעיל של גלטוסמיטין, פרצטמול, תיודרחאמיד, אזובמיתאן ו-CCl₄. מאלה, ccl₄ נמצא בשימוש נרחב למרות שזה עדיין לא מאופיין היטב^10,11,12,13.

CCl₄ הוא תרכובת נוזלית אורגנית עם ריח מתוק וכמעט ללא צבע בטמפרטורות נמוכות. חשיפה לריכוזים גבוהים של CCl₄ יכול לגרום נזק למערכת העצבים המרכזית, כולל הידרדרות של הכבד והכליות. CCl₄ גורם עלי באמצעות טרנספורמציה ביולוגית בכבד, אשר מהווה מיני חמצן תגובתי. זה מתרחש באמצעות האנזים P450 ציטוכרום 2E1, ויוצרים פעילות מטבוליט פעילה וכתוצאה מכך נזק לתא על ידי מקרומולקולה binding, שיפור peroxidation שומנים והפרעה של סידן תאיים הומאוסטזיס¹⁴. בנוסף, מודל CCl₄ יכול לשמש כדי לעורר את האסטרוציטים ברמה של סינתזה RNA¹⁵. הפאטאוטוקסין הזה מנוהל על ידי הצפק, הפנים, דרך הפה, ודרכי העיכול¹⁶.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים בפירוט CCl₄המושרה עלי בחולדות באמצעות צינור הקיבה. שיטה זו מעוררת עלי החזקה והניתנת לקריאה, שניתן להשתמש בה כדי לחקור את הפתוגנזה של עלי. קביעת חומרת מחלת הכבד היא בפיקוח על ידי מדידה של הנסיוב גלוטמט-פירואמיאז (GPT), גלוטמית אוקסלואצטט טרנסאמיאז (יש) אנזימים הכולל בילירובין (TB), כמו גם אבחנה היסטולוגית סופית על ידי המטאוקסילין ואאוזין (H & E) רקמות הכבד ויטראז '. חשיפה ל-CCl₄ דרך גישה התוך הקיבה מאפשר שיטה מעשית, זולה, פולשנית עם סיכון סכנה מינימלי.

הניסויים נערכו על פי המלצות ההצהרות של הלסינקי וטוקיו ולהנחיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים בקהילה האירופית. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב.

הערה: דגם CCl₄ נוצר ונעשה בו שימוש במחקר הקודם¹⁷. ציר הזמן של הפרוטוקול מוצג בטבלה 1.

1. הכנת חולדות להליך הניסיוני

הערה: בחירת הזכרים בוגרים מהספרג במשקל 300-350 גרם.

1. לקבל אישור לניסויים מתוך הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש (IACUC).
2. לשמור על החולדות בטמפרטורת החדר (22 ° c ± 1 ° צ'), עם אור 12 h ו 12 h מחזורים כהים. . לספק משקה עכברים ומים ליסיביות
3. בצע את כל הניסויים בין 6:00 לפנות בוקר לשעה 12:00.
4. גלח את החולדה וחטא את העור באלכוהול.

2. קביעת הסרום מגיע, מסוג GPT, ו-TB רמות בסיסיות

1. רדמה
   1. הכינו מערכת מינהל מתמשך. כדי לגרום להרדמה תוודא שמערכת האידוי. מלאה באיזוofלבנה
   2. הלבין את החולדה. בעלת 2% הנחה ודא שהעכברוש מורדם לחלוטין על-ידי התבוננות בתנועה וברפלקס הדוושה בתגובה לגירויים חיצוניים.
      הערה: השתמש ב-1-5% בגין הרדמה ותחזוקה.
2. . צינורית בעורק הזנב עם צנתר בסול 22
3. לאסוף דגימת דם 0.5 mL בבסיס. ודא שנפח הדם שאוחזר אינו חורג מהנחיות IACUC.
4. לבצע ניתוח דם ביוכימיים כולל מדידות של סרום יש, GPT ו-TB, כפי שמתואר בעבר¹⁸.
   הערה: בדיקות אנזימי כבד ורמת השחפת בוצעו במעבדה הביוכימית של המרכז הרפואי סורוקה. דגימות דם נותחו באמצעות שיטה פלואורסצנטית על מנתח כימיה (טבלת חומרים).

3. אינדוקציה של פגיעה בכבד חריפה בחולדות

התראה: חשיפה לריכוזים גבוהים של CCl₄, כולל קליטה באדים או בעור, יכולים להיות השפעות שליליות על מערכת העצבים המרכזית ולגרום לניוון של הכבד והכליות. חשיפה ממושכת יכולה. לגרום לתרדמת או מוות

1. הכינו פתרון 50% של CCl₄ (לוח חומרים) על ידי ערבוב ccl₄ עם שמן זית כרכב ביחס 1:1.
   הערה: הפתרון צריך להיות מוכן על פי הנחיות IACUC עבור תרכובות שאינן תרופות כיתה.
2. הvivo על ידי מנהל CCl₄ באמצעות צינורית בקיבה.
   1. הכנס צינור 16 האורוקיבה (3 ס מ עמוק) דרך חלל אוראלי של החולדה.
   2. לחשוף את העכברוש למינונים שונים של CCl₄ על ידי הזרקת מזרק עם אחד מהפתרונות הבאים מדולל לתוך הבטן של החולדה: 1 מ ל/ק"ג (מתון עלי), 2.5 ml/ק ג (עלי מתון), או 5 מ ל/ק"ג (ali חמור) של 50% פתרון. לקבוצת הבקרה הפועלת באמצעות התחזות, חשפו את החולדה לשמן זית של 5 מ ל/ק"ג בלבד.

4. קביעת הסרום יש, GPT, ו TB רמות לאחר 24 שעות

1. רדמה
   1. הכינו מערכת מינהל מתמשך. כדי לגרום להרדמה תוודא שמערכת האידוי. מלאה באיזוofלבנה
   2. לעשות את החולדות. עם 2% בלבד ודא שהעכברוש מורדם לחלוטין על-ידי התבוננות בתנועה וברפלקס הדוושה בתגובה לגירויים חיצוניים.
2. לאסוף דגימות דם ב 24 שעות מחשיפה CCl₄ .
3. לבצע ניתוח דם ביוכימיים כולל מדידות של סרום יש, GPT ו-TB.

5. הכבד אוסף לבדיקה היסטולוגית

1. המתת חסד על ידי החלפת תערובת הגז השראה עם 20% O₂/80% CO₂. ודא כי CO₂ מועברת בקצב מוגדר מראש בהתאם להנחיות IACUC.
2. להבטיח מוות על ידי בדיקת חוסר דופק ולאשר על ידי שיטה משנית בהתאם הנחיות IACUC.
3. מניחים את החולדה על לוח מבתר עם המשטח הפנימי שלו פונה כלפי מטה והבטן פונה כלפי מעלה. . תגלח את הבטן של העכברוש
4. עם אזמל, מפרק את האורך המלא של העור הונרום מן פי הטבעת אל הסנטר. . הפרד את העור לחלל את קיר הבטן עם אזמל מן הרקטום אל הסחוס xyphoid, חשיפת מעיים הבטן.
5. באמצעות מספריים ומלקחיים, לבודד את הכבד על ידי מבתר אותו מן הרצועות שלה וקבצים מצורפים. החל מתוך הכבד hilum, בזהירות לבצע כריתת המעי הריאה על ידי שחרור כל האונות הכבד מפני קבצים מצורפים. מנתחים וחותכים את כל הרצועות ואת כלי הדם.
6. . להעביר את הכבד לצלחת פטרי לתקן את הכבד בתמיסה 4% פורמלדהיד באגירה (טבלת חומרים) לפחות 24 שעות.

6. בדיקה היסטולוגית

1. הכנה לדוגמא
   1. לאחר קיבעון, לחתוך את המדגם לתוך 5 יקרומטר סדרת פרוסה עבה על ידי הפחתת מיקרוטום.
   2. מקם בעדינות את הפרוסות על שקופיות זכוכית עם מברשת רכה, פרוסה אחת לכל שקופית.
   3. לבצע כתמים H & E כפי שתואר בעבר¹⁹.
2. בדוק את הפרוסות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 200x באמצעות עדשת יעד של 20 מ"מ (טבלת חומרים).
   הערה: מקטעי הכבד צריך להיות מדורגים על ידי פתולוג מיוחד עיוור לפרוטוקול הטיפול. ציון של 0 מצביע על חריגות בכבד, 1 – 2 מציין פציעה בכבד מתון, 3 – 4 מציין פציעה בכבד מתון, ו-5 – 6 מעיד על פציעה חמורה בכבד^20,21,22.

שחפת, יש, ורמות GPT גדל באופן משמעותי 24 שעות לאחר גרימת עלי (יותר ב-CCl₄ מינונים) בהשוואה לפקדים בעלי הפעלה מזויפת (p < 0.001) (איור 1). רמות של TB, הגיע, ו-GPT בתוכנית הבסיסית היו נורמליים ולא היו שונים באופן משמעותי מאשר בקרות מופעל המזויף. ב 24 שעות, כל שלוש קבוצות התערבותית, 1 מ"ל/ק"ג CCl₄ (1, 1-2), 2.5 ml/ק"ג ccl₄ (3, 3-4), ו-5 מ"ל/ק"ג ccl₄ (4, 4-5.75), היה ציון גבוה יותר באופן משמעותי בדירוג היסטולוגית מאשר קבוצת הבקרה המופעלת באמצעות התחזות (0, 0-0) (p < 0.05, נתונים שהוצגו כחציון, 25 התמונות H & E של שליטה מופעלת התחזות (איור 2A) וקבוצות חשופים ccl₄ מינונים (איור 2B-D) הצגת שינויים histopathological 24 שעות לאחר החשיפה ccl₄ . שיבוש האדריכלות hepatocellular על ידי CCl₄ הוכח על ידי כיתה גבוהה של פגיעה ברקמות עם דפורמציה סיבי septa גדול, הרחבה של סיבים, הצטברות קולגן, והפרדת אונה מדומה בסעיפים בכבד (איור 2).

איור 1: סרום טרה-בתים (A), יש (ב), ו-GPT (C) רמות בדגימות דם 24 שעות לאחר החשיפה ל-ccl שונים₄ מינונים לעומת שולטת מופעל המזויף. סרגל כחול: שליטה; בר אדום: 24 שעות לאחר החשיפה CCl₄ . המשמעות של השוואות בין החולדות החשופות_{של CCl}לבין חולדות חשוף נקבעים באמצעות מבחן מאן-ויטני. ערך p של < 0.05 נחשב למשמעותי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: שינויים histopathological ברקמת הכבד עם מוכתם H & E לאחר 24 H CCl₄ שיכרון במינונים שונים. (א) שליטהבפועל, (ב) 1 מ"ל/ק"ג ccl₄, (ג) 2.5 ml/ק"ג ccl₄, ו (ד) 5 מ"ל/ק"ג ccl₄. סרגל קנה מידה = 50 μm. התפלגות התוצאות היסטולוגית החזוי על ידי רגרסיה לינארית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: הדגמה של ציר הזמן של הפרוטוקול. הקבוצות השונות של חולדות בזמנים שונים כוללות קבוצת שליטה מופעלת התחזות, עלי מתון (חשיפה ל-1 מ"ל/ק"ג CCl₄), עלי מתון (חשיפה ל-2.5 ml/ק"ג ccl₄), ו-ali חמור (חשיפה ל-5 מ ל/_ק"ג). בזמן 24 שעות, סרום הגיע, מסוג GPT ו-TB נמדדו, ו בדיקה היסטולוגית בוצעה עבור כל ארבע הקבוצות.

בפרוטוקול זה, CCl₄ משמש רעלן הכבד כדי לגרום ALI בחולדות. עלי מאופיין על ידי אובדן של הכבד בתוך כימומה ולאחר הדיסתקנה של פונקציות מטבולית וסינתטי של ההכבד. תרופות, וירוסים, רעלים, מחלות אוטואימוניות, מחלות מטבוליות, ובעיות בכלי הדם כל לגרום מוות hepatocyte, ואת התגובה הדלקתית הבאה תורמת הפתוגנזה של עלי.

העלבון הראשוני לכבד מוביל לייצור cy, כימוקין שחרור, והסתננות לאחר מכן של תאים דלקתיים לתוך הכבד. שלושה מסמנים בעלי בדיקות נפוצות להערכת עלי הם GPT, יש ורמות TB. מסוג GPT ו-יש אנזימים הנמדדים ברמת הפעילות ואילו רמת השחפת מודדת את תפקוד הכבד על ידי ריכוז הנסיוב. כאשר רמות הפעילות של אנזימים מוגבהים, מציינות פגיעה בדלקת הפציטים או המרה²³. שיטת spectrophotometric מהירה דווחה לראשונה ביצירתו של ארתור קרמן ב-1955²⁴, שאיפשר ליישום הקליני הנרחב של מדידת אנזימים בסרום. מאז הוחלו גם מדידות מסוג ' מקבל ' ו-GPT על מנת לזהות פציעה באמצעות ההיציט. מסוג GPT משמש לעתים תכופות יותר, ובדיקות GPT בו מגלה בדרך כלל תוצאות עודפות. הגידול ברמות הפעילות של יש ו-GPT בין שערי השחרור ושיעורי הסיווג מתאים פצועים ניתן להשתמש כדי למדוד בערך את שיעור הפגיעה בתאים. כאשר התאים הפצועים הכבד לגרום לכבד להיכשל בפעילות הרגילה שלה, כגון עיבוד והסרה של בילירובין כמו מרה, זה מצביע על כך עלי חמור יותר.

קיימים מספר שלבים בפרוטוקול הקריטיים והראויים לשיקול דעת. רוב הפרוטוקולים דורשים בדיקות בדיקת סרום לפני ואחרי החשיפה לסוכן החוקר, כמו הגבהים של הסרום ברמות ריכוז אנזימים נפוצים. עם זאת, עקב תנודות בעיתוי של ALT מוגבר, יש לערוך מספר בדיקות באופן תקופתי כדי לזהות כל העלאה. בפרוטוקול זה, בחרנו לבדוק יש, מסוג GPT ו-TB רמות בסיסית ו -24 שעות לאחר החשיפה לרעלן. על פי המחקרים האחרונים, רמות של בסמנים אלה בקורלציה היטב עם חומרת עלי בזמן זה מרווח¹⁷. כפי שמוצג באיור 1, רמות של דם יש, GPT, ו-TB היו גבוהות בכל הדגימות 24 h לאחר גרימת ALI. הדבר מצביע על כך שהמודל מכיל תוצאות בזמן קצר מאוד מאז החשיפה ל-CCl₄. אחד צריך לקחת בחשבון כי בעלי הכבד חמור מאבד את יכולתו לסנתז יש ו-GPT. לכן, במקרים אלה ייתכן שאנזימים אלה לא יהיו בעלי ערך ניבוי שלהם כפי שמתואר בספרות.

ממצאים היסטולוגית של חולדות שנחשפו ל-CCl₄ מאופיינים על ידי בלונים של תאים, ונמק בתוך הראש ונוכחות של גופי חבר המועצה²⁵. במודל זה היה נזק נרחב הוכח להיות פרופורציונלי למינון של CCl₄ מנוהל.

שיטה זו של גרימת לעלי באמצעות החשיפה CCl האורוקיבה₄ יש יתרונות רבים. היא פשוטה, זולה, ובעלת סיכון מזערי לסיכונים. הפרוטוקול מספק תוצאות משמעותיות בפרק זמן קצר מאוד. המודל הוא מאוד הניתן לשימוש והוא יכול לשמש בדרך כלל כדי לקבוע את היעילות של אסטרטגיות hepatopquo פוטנציאלי ולהעריך סמנים של פציעה בכבד.

חשוב לציין כי CCl₄ משפיע בעיקר על האזור המרכזי של הכבד, אשר אינו מתאים נמק מסיבי לראות בדרך כלל בספיקת כבד האדם. יתר על כן, CCl₄ אינו מטבוליזם לחלוטין בכבד, וחלק ccl שאינם מטבוליזם₄ יכול להזיק לאיברים אחרים, כולל הריאות והכליות¹⁶. בנוסף, בשל רמות שונות של פיתוח ויעילות P450 ציטוכרום, יש וריאציה גדולה ברגישות בהתאם מינים וגיל²⁶. למרות מגבלות אלה, השיטה של CCl מושרה₄עלי המושרה עדיין משמש מודל מכרסם רב ערך.

. למחברים אין מה לגלות

המחברים מכירים בהכרת תודה את ברטה דלגדו, המחלקה לפתולוגיה, המרכז הרפואי סורוקה, הפקולטה למדעי הבריאות, אוניברסיטת בן-גוריון בנגב, לעזרתה במעבדה ובניתוח היסטולוגיה.