Induzindo lesão hepática aguda em ratos via tetracloreto de carbono (CCl₄) exposição através de um tubo orogástrico

Este protocolo descreve um método comum e viável de induzir lesão hepática aguda (ALI) através da exposição ao ClC₄ através de uma sonda orogástrica. A exposição ao CCl₄ induz ali através da formação de espécies reativas de oxigênio durante sua biotransformação no fígado. Este método é utilizado para analisar a fisiopatologia da ALI e examinar diferentes estratégias hepatoprotetoras.

A lesão hepática aguda (ALI) desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, que é caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada. Modelos animais adequados são vitais para testar o mecanismo e a fisiopatologia da ALI e investigar diferentes estratégias hepatoprotetoras. Devido à sua capacidade de realizar transformações químicas, o tetracloreto de carbono (CCl₄) é amplamente utilizado no fígado para induzir ali através da formação de espécies reativas de oxigênio. A exposição do_{ClC 4} pode ser realizada intraperitonicamente, por inalação ou por sonda nasogástrica ou orogástrica. Aqui, descrevemos um modelo de roedor, no qual ali é induzido pela exposição ccl₄ através de uma sonda orogástrica. Este método é barato, facilmente realizado e tem risco mínimo. O modelo é altamente reproduzível e pode ser amplamente utilizado para determinar a eficácia de potenciais estratégias hepatoprotetoras e avaliar marcadores de lesão hepática.

A frequência de insultos tóxicos ao fígado, especialmente devido ao abuso de álcool e drogas, está aumentando. A lesão hepática aguda (ALI) está associada a altas taxas de mortalidade e tem causado preocupações clínicas^1,2. Lesões tóxicas levam à morte sinalizando caminhos no fígado, resultando em apoptose hepatocito, necrose ou piropose. A ALI desempenha um papel crucial no desenvolvimento da insuficiência hepática, caracterizada por disfunção hepática grave, incluindo complicações como encefalopatia hepática e síntese proteica prejudicada^3,4. Embora pesquisas recentes tenham aumentado nosso conhecimento sobre as mudanças fisiológicas e patológicas que acompanham a insuficiência hepática, ela não explicou completamente as características patomoleculares que afetam os mecanismos da morte celular. Além disso, não há medicamentos disponíveis atualmente para reverter a deterioração progressiva em pacientes ali. Atualmente, o único tratamento significativamente eficaz é o transplante hepático^5,6.

A fim de investigar o mecanismo e fisiopatologia da ALI e testar diferentes estratégias hepatoprotetoras, diferentes modelos animais são usados para induzir ali. Um modelo animal preferencial da ALI deve imitar o processo patológico da doença por meio de um método confiável, validado, barato e fácil de aplicar. Exemplos de modelos experimentais incluem agentes hepatotóxicos, procedimentos cirúrgicos como hepatectomia total ou parcial, devascularização completa ou transitória e procedimentos infecciosos^7,8,9. Substâncias hepatotóxicas conhecidas incluem galactosamina, acetaminofeno, thioacetamina, azoxymetano e ClC₄. Destes, o CCl₄ é amplamente utilizado, embora ainda não tenha sido bem caracterizado^10,11,12,13.

CCl₄ é um composto líquido incolor orgânico com um cheiro doce e quase nenhuma inflamabilidade em temperaturas mais baixas. A exposição a altas concentrações de ClC₄ pode causar danos ao sistema nervoso central, incluindo deterioração do fígado e rins. CCl₄ induz ALI através de sua biotransformação no fígado, que forma espécies reativas de oxigênio. Isso ocorre através da enzima citocromo P450 2E1, formando um metabólito ativo e resultando em dano celular por ligação de macromoléculas, aumento da peroxidação lipídica e perturbação da homeostase de cálcio intracelular¹⁴. Além disso, o modelo CCl₄ pode ser usado para estimular os astrócitos ao nível da síntese de RNA¹⁵. Esta hepatotoxina tem sido administrada pelas rotas intraperitoneal, intraportal, oral e intratragastrica¹⁶.

Neste protocolo, descrevemos em detalhes ccl₄-induzido ALI em ratos através de uma sonda orogástrica. Este método induz ali robusto e reprodutível que pode ser usado para investigar a patogênese de ALI. A determinação da gravidade da doença hepática é monitorada pela medição do soro glutamato-piruvato transaminase (GPT), enzimas transaminase oxaloacticais glutamicas (GOT) e bilirrubina total (TB), bem como diagnóstico histológico definitivo por hematoxilina e eosina (H&E) tecidos hepáticos manchados. A exposição ao CCl₄ através de um acesso intragastric permite um método prático, barato e minimamente invasivo com risco mínimo de risco.

Os experimentos foram realizados de acordo com as recomendações das Declarações de Helsinque e Tóquio e das Diretrizes para o Uso de Animais Experimentais da Comunidade Europeia. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Universidade Ben-Gurion do Negev.

NOTA: O modelo CCL₄ foi gerado e utilizado em um estudo anterior¹⁷. O cronograma do protocolo é demonstrado na Tabela 1.

1. Preparar ratos para o procedimento experimental

NOTA: Selecione ratos machos adultos sprague Dawley pesando 300-350 g.

1. Obter aprovação para experimentos do Comitê de Cuidado e Uso de Animais Institucionais (IACUC).
2. Mantenha os ratos em temperatura ambiente (22 °C ± 1 °C), com 12 h de luz e 12 h de ciclos escuros. Forneça comida de rato e água ad libitum.
3. Realize todos os experimentos entre 6:00 e 12:00.
4. Raspe o rato e desinfete a pele com álcool.

2. Determinação dos níveis de linha de base do soro GOT, GPT e TB

1. Anestesia
   1. Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
   2. Anestesiar o rato com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
      NOTA: Use isoflurano de 1 a 5% para indução e manutenção de anestesia.
2. Cannulate a veia traseira com um cateter de 22 G.
3. Coletar uma amostra de sangue de 0,5 mL na linha de base. Certifique-se de que o volume sanguíneo recuperado não exceda as diretrizes da IACUC.
4. Realizar análises bioquímicas sanguíneas incluindo as medidas do soro GOT, GPT e TB, conforme descrito anteriormente¹⁸.
   NOTA: Os exames de enzimas hepáticas e nível de TB foram realizados no laboratório bioquímico do Soroka Medical Center. As amostras de sangue foram analisadas utilizando-se um método de fluorescência em um analisador de química (Tabela de Materiais).

3. Indução de lesão hepática aguda em ratos

ATENÇÃO: A exposição a altas concentrações de ClC₄, incluindo absorção através de vapor ou pele, pode ter efeitos negativos no sistema nervoso central e causar degeneração do fígado e rins. Exposição prolongada pode causar coma ou morte.

1. Prepare uma solução de 50% de CCl₄ (Tabela de Materiais) misturando CCl₄ com azeite como veículo em uma proporção 1:1.
   NOTA: A solução deve ser preparada de acordo com as diretrizes da IACUC para compostos não farmacêuticos.
2. Induzir hepatotoxicidade in vivo pela administração do CCL₄ através de uma sonda orogástrica.
   1. Insira uma sonda orogástrica de 16 G (3 polegadas de profundidade) através da cavidade oral do rato.
   2. Exponha o rato a diferentes doses de CCl₄ injetando uma seringa com uma das seguintes soluções diluídas no estômago do rato: 1 mL/kg (ALI leve), 2,5 mL/kg (ALI moderado) ou 5 mL/kg (ALI grave) da solução de 50%. Para o grupo de controle falso, exponha o rato apenas a 5 mL/kg de azeite.

4. Determinação dos níveis de soro GOT, GPT e TB após 24 h

1. Anestesia
   1. Prepare um sistema de administração isoflurano contínuo para induzir anestesia. Certifique-se de que o sistema de vaporizador está cheio de isoflurano.
   2. Anestesiar os ratos com 2% de isoflurano. Confirme que o rato está totalmente anestesiado observando o movimento e o reflexo do pedal em resposta a estímulos externos.
2. Coletar amostras de sangue às 24h da exposição ao ClC_4.
3. Realizar análisebioquímica sanguínea, incluindo medidas de soro GOT, GPT e TB.

5. Coleta de fígado para exame histológico

1. Eutanie o rato substituindo a mistura de gás inspirada por 20% O₂/80% CO₂. Certifique-se de que o CO₂ seja entregue a uma taxa pré-determinada de acordo com as diretrizes da IACUC.
2. Certifique-se de morte verificando a falta de batimentos cardíacos e confirme por um método secundário de acordo com as diretrizes da IACUC.
3. Coloque o rato sobre uma tábua de dissecação com sua superfície dorsal voltada para baixo e abdômen voltado para cima. Raspe o abdômen do rato.
4. Com um bisturi, incida o comprimento total da pele ventrum do ânus até o queixo. Separe a pele. Incise a parede abdominal com um bisturi do ânus até a cartilagem xilóide, expondo as vísceras abdominais.
5. Usando tesouras e fórceps, isole o fígado dissecando-o de seus ligamentos e fixações. Começando pelo hilum do fígado, realize cuidadosamente uma hepatectomia liberando todos os lóbulos do fígado de anexos. Dissecar e cortar todos os ligamentos e vasos sanguíneos.
6. Transfira o fígado para uma placa de Petri. Fixar o fígado em uma solução de formaldeído tampão de 4%(Tabela de Materiais)por pelo menos 24 h.

6. Exame histológico

1. Preparação da amostra
   1. Após a fixação, corte a amostra em uma série de fatias de 5 μm de espessura por secção de microtomes.
   2. Coloque delicadamente as fatias em lâminas de vidro com um pincel macio, 1 fatia por slide.
   3. Realizar a coloração de H&E como descrito anteriormente¹⁹.
2. Examine as fatias sob um microscópio a uma ampliação de 200x usando uma lente objetiva de 20 mm(Tabela de Materiais).
   NOTA: As seções hepáticas devem ser classificadas por um patologista especializado cego ao protocolo de tratamento. Um escore de 0 não indica anormalidades hepáticas, 1-2 indica lesão hepática leve, 3-4 indica lesão hepática moderada, e 5-6 indica lesão hepática grave^20,21,22.

Os níveis de TB, GOT e GPT aumentaram significativamente 24 h após induzirem ALI (mais doses de CCl₄₎ em comparação com controles falsos (p < 0,001) (Figura 1). Os níveis de TB, GOT e GPT na linha de base eram normais e não eram significativamente diferentes dos controles operados por fraude. Às 24 horas, todos os três grupos intervencionais, 1 mL/kg CCl₄ (1, 1−2), 2,5 mL/kg CCl₄ (3, 3−4) e 5 mL/kg CCl₄ (4, 4-5,75), apresentaram um escore de classificação histológica significativamente maior do que o grupo de controle falso operado (0, 0-0) (p < 0,05, dados apresentados como mediana, 25-75%). As imagens de H&E de um controle falso(Figura 2A)e grupos expostos a diferentes doses de CCl₄ (Figura 2B−D)mostram alterações histopatológicas 24 h após a exposição da CCl_4. A interrupção da arquitetura hepatocelular por CCl₄ foi demonstrada por um alto grau de lesão tecidual com grande deformação de septo fibroso, extensão de fibras, acúmulo de colágeno e separação pseudo-lóbulo em seções hepáticas(Figura 2).

Figura 1: Níveis de TB sérica (A), GOT (B) e GPT (C) em amostras de sangue 24 h após exposição a diferentes doses de CCl₄ em comparação com controles falsos operados. Barra azul: controle; barra vermelha: 24 horas após a exposição do CCl_4. O significado das comparações entre ratos expostos ao CCL₄e ratos não expostos é determinado usando o teste de Mann-Whitney. Um valor p de <0,05 foi considerado significativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Alterações histopatológicas no tecido hepático manchados com H&E após 24 h de intoxicação ccl₄ em várias doses. (A) controle falso, (B) 1 mL/kg CCl₄, (C) 2,5 mL/kg CCl_4,e(D) 5 mL/kg CCl₄. Barra de escala = 50 μm. A distribuição dos desfechos histológicos foi prevista por regressão linear. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Demonstração do cronograma do protocolo. Os vários grupos de ratos em diferentes momentos incluem um grupo de controle falso, ALI leve (exposição a 1 mL/kg CCl₄), ALI moderado (exposição a 2,5 mL/kg CCl₄) e ALI grave (exposição a 5 mL/kg CCl₄). Às 24 horas, foram medidos os níveis de soro GOT, GPT e TB, e foi realizado exame histológico para os quatro grupos.

Neste protocolo, CCl₄ é usado como uma toxina hepática para induzir ALI em ratos. Ali é caracterizada pela perda de parenchyma hepático e subsequente desregulação das funções metabólicas e sintéticas do fígado. Drogas, vírus, toxinas, doenças autoimunes, doenças metabólicas e doenças vasculares induzem a morte hepatocito, e a resposta inflamatória subsequente contribui para a patogênese da ALI.

O insulto inicial ao fígado leva à produção de citocina, liberação de quimiocina e posterior infiltração de células inflamatórias no fígado. Três dos biomarcadores comumente testados para avaliação de ALI são os níveis de GPT, GOT e TB. GPT e GOT são enzimas medidas pelo nível de atividade, enquanto o nível de TB mede a função hepática pela concentração do soro. Quando elevados, os níveis de atividade enzimática do soro denotam lesões em hepatócitos ou colangiocitos²³. O método espectrofotométrico rápido foi relatado pela primeira vez no trabalho de Arthur Karmen em 1955^24,o que permitiu a aplicação clínica generalizada da medição da enzima sérilha. Desde então, as medidas GOT e GPT também foram aplicadas para detectar lesões hepatocitos. O GPT é usado com mais freqüência, e os testes gpt simultâneos geralmente revelam resultados redundantes. O aumento dos níveis de atividade de GOT e GPT entre as taxas de liberação e as taxas de liberação de células feridas pode ser usado para medir aproximadamente a taxa de lesão nas células. Quando as células hepáticas feridas fazem com que o fígado falhe em suas atividades normais, como o processamento e a remoção da bilirrubina como bile, isso indica que o ALI é mais grave.

Existem várias etapas no protocolo que são críticas e merecem uma consideração cuidadosa. A maioria dos protocolos requer testes de biomarcadores de soro antes e depois da exposição ao agente investigativo, já que elevações nos níveis de concentração de enzimas sérgicas são comuns. No entanto, devido a flutuações no tempo de ALT elevado, vários testes devem ser realizados periodicamente para detectar qualquer elevação. Neste protocolo, optamos por testar os níveis got, GPT e TB na linha de base e 24 h após a exposição à toxina. De acordo com estudos recentes, os níveis desses biomarcadores correlacionaram-se bem com a gravidade da ALI durante este intervalo de tempo¹⁷. Conforme mostrado na Figura 1,os níveis de sangue GOT, GPT e TB foram elevados em todas as amostras 24h após induzir ali. Isso indica que o modelo quantificou os resultados em um intervalo de tempo muito curto desde a exposição à CCl₄. Deve-se levar em conta que em ALI grave o fígado perde sua capacidade de sintetizar GOT e GPT. Portanto, nesses casos essas enzimas podem não ter seu valor preditivo como demonstrado na literatura.

Os achados histológicos de ratos expostos à CCL₄ são caracterizados pelo balonismo de células, necrose centrilobular e a presença de corpos de vereador²⁵. Neste modelo houve dano generalizado que se mostrou proporcional à dose de CCl₄ administrada.

Este método de induzir ali através da exposição orogástrica CCl₄ tem inúmeras vantagens. É simples, barato e com risco mínimo. O protocolo fornece resultados significativos em um intervalo de tempo muito curto. O modelo é altamente reproduzível e pode ser comumente utilizado para determinar a eficácia de potenciais estratégias hepatoprotetoras e avaliar marcadores de lesão hepática.

É importante notar que o CCl₄ afeta principalmente a zona central do fígado, que não corresponde à necrose maciça tipicamente vista na insuficiência hepática humana. Além disso, o CCl₄ não é completamente metabolizado no fígado, e alguns dos CCl₄ não metabolizados podem danificar outros órgãos, incluindo pulmões e rins¹⁶. Além disso, devido aos diferentes níveis de desenvolvimento e eficácia citocromo P450, há uma grande variação de sensibilidade dependendo das espécies e idade²⁶. Apesar dessas limitações, o método de Ali induzido pelo CCl₄ainda serve como um modelo valioso de roedores.

Os autores não têm nada para revelar.

Os autores agradecem bertha Delgado, Departamento de Patologia, Soroka Medical Center, Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade Ben-Gurion do Negev, por sua ajuda no laboratório, bem como na análise histologia.