Bakteri ve Kimyasalların Caenorhabditis elegans'ın Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Etkilerinin Ölçülmesi

Bu protokol, Caenorhabditis elegansbağırsak geçirgenliği ölçmek için nasıl açıklar. Bu yöntem bağırsak bakterileri ve ev sahibi arasındaki etkileşim ile ilgili bağırsak sağlığı temel biyolojik araştırma ve sızıntılı bağırsak sendromu ve inflamatuar barsak hastalıkları nın tedavisi için probiyotik ve kimyasal ajanları belirlemek için tarama için yararlıdır.

Yaşayan organizmalarda, bağırsak hiperpermeability birçok inflamatuar barsak hastalıklarına yol açan ciddi bir belirtidir (IbDs). Caenorhabditis elegans, kısa ömrü, şeffaflığı, maliyet etkinliği ve hayvan etiği sorunlarının eksikliği nedeniyle yaygın olarak bir tahsin sistemi olarak kullanılan memeli olmayan bir hayvan modelidir. Bu çalışmada, c. elegans'ın yüksek işlemli görüntü analiz sistemi ile bağırsak geçirgenliği üzerine farklı bakterilerin ve 3,3'-diindolylmethane (DIM) etkilerini araştırmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Solucanlar farklı bağırsak bakterileri ile enfekte edildi veya 48 saat dim ile birlikte tedavi edildi ve floresan isotiyoyanat ile beslenen (FITC)-dextran gecede. Daha sonra, bağırsak geçirgenliği floresan görüntüleri ve solucan cisimleri içindeki floresan yoğunluğu karşılaştırılarak incelendi. Bu yöntem aynı zamanda hayvan modelinde bağırsak geçirgenliğini etkileyen probiyotik ve patojenik bağırsak bakterileri belirlemek için potansiyele sahip olabilir ve bağırsak geçirgenliği ve bağırsak sağlığı üzerinde zararlı veya sağlık teşvik kimyasalların etkilerini incelemek için etkilidir. Ancak, bu protokol aynı zamanda genetik düzeyde bazı önemli sınırlamalar vardır, özellikle hangi genlerin hastalığı kontrol etmek için değiştirilir belirlemek için, Bu yöntem çoğunlukla fenotipik belirlenmesi için kullanılır çünkü. Buna ek olarak, bu yöntem tam olarak hangi patojenik substratların inflamasyona neden olduğunu belirlemek veya enfeksiyon sırasında solucanların bağırsaklarının geçirgenliğini artırmakla sınırlıdır. Bu nedenle, mutant bakteri ve nematodların moleküler genetik mekanizmasının araştırılması nın yanı sıra bakterilerin kimyasal bileşen analizi de dahil olmak üzere daha derinlemesine çalışmalar, bağırsak geçirgenliğini belirlemede bakteri ve kimyasalların işlevini tam olarak değerlendirmek için gereklidir.

Bağırsak geçirgenliği bağırsak mikrobiyotası ve mukozal bağışıklık ile ilgili ana engellerden biri olarak kabul edilir ve bağırsak mikrobiyota modifikasyonları, epitel bozukluğu veya mukus tabakası değişiklikleri gibi çeşitli faktörlerden etkilenmesi muhtemeldir¹. Son kağıtlar bağırsak hücre^tabakası2 genelinde floresan akı oranları analiz ederek kültürlü insan bağırsak hücrelerinin bağırsak geçirgenliğini ölçmek için etkili protokoller bildirdin 2 , ama daha az araştırma kağıtları nematodlarda bağırsak geçirgenliğini ölçmek için uygun bir prosedür mevcut, Özellikle C. elegans, FITC-dextran boyama kullanarak.

Nil kırmızısı³ ve erioglaucine disodyum (veya Şirin tayini) 4^,5kullanarak C. elegans bağırsak geçirgenliğini ölçmek için iki temsili protokol vardır. Bu protokolde, Nil kırmızısı (MW = 318,37) ve erioglaucin disodyum (MW = 792,85) çok daha yüksek molekül ağırlığına sahip FITC-dextran (ortalama molekül ağırlığı 10.000) kullanıldı. FITC-dextran, Nil kırmızısı veya erioglaucine disodyum boyalarından bağırsak tabakası yoluyla emilen karbonhidratlar gibi gerçek makromoleküler besinlere daha benzer. Erioglaucine disodyum (mavi Şirin boya) ile beslenen C. elegans bağırsak geçirgenliği kolayca floresan mikroskopi olmadan değerlendirilebilir. Ancak Şirin tahlillerinde, bağırsak geçirgenliğinin kantitatif analizi standardizasyon eksikliği nedeniyle zordur ve elle değerlendirilmelidir^4,5. Nil kırmızısı tetkik durumunda, Nil kırmızısı da hücrelerde lipid damlacıkları lekeler, Hangi C. elegansbağırsak geçirgenliği tam belirlenmesi ni engelleyebilir⁶. Bu protokoller, spesifik olmayan lipid boyamakaçınArak çeşitli bağırsak bakteri ve kimyasallar ile tedavi Edilen C. elegans bağırsak geçirgenliğinin hızlı ve kesin kantitatif analizini sağlar.

C. elegans biyolojik alanlarda uygun fiyat, kolay manipülasyon, sınırlı hayvan etiği sorunları ve hızlı deneme 7için yararlı olan kısa ömrü nedeniyle tipik bir modeldir. Özellikle C. elegans genomunun tamamı yayınlandıktan sonra C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %40'ının insan hastalıklarına neden olan genler için ortolog olduğu bulunmuştur⁸. Ayrıca, şeffaf vücut hücresel olayları araştırmak ve hücre biyolojisi floresan uygulamaları için avantajlı organizma içinde gözlem sağlar, örneğin, DAPI veya immünohistokimya ile kök hücre boyama⁹. C. elegans genellikle bağırsak mikrobiyota ve konak arasındaki etkileşimi incelemek için deneysel bir hayvan olarak kullanılır; buna ek olarak, C. elegans tarama için kullanılır sağlık teşvik probiyotik bakteriler^10,11,12 yanı sıra diyet kimyasallar bağırsak sağlığını teşvik^13,14.

Pseudomonas aeruginosa ve Enterococcus faecalis olumsuz gastrointestinal sistemi etkileyen iyi bilinen bağırsak bakterileri, bağırsak sistemi özellikle kolon epitel hücreleri^15,16. Bu nedenle, bu bakterilertarafından tetiklenen bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi, bakteriyel inflamasyon ve enfeksiyonun neden olduğu hasarı geri kazanabilen ve azaltabilecek yeni ilaçların taranması ve geliştirilmesi için gereklidir. Bu protokolde, bu bağırsak bakterilerinin C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini test ettik.

Ayrıca C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerinde kimyasallar test etmek için optimize edilmiş bir protokol rapor. Bu amaçla, dim indole-3-karbinol elde edilen bir biyoaktif metabolit bileşik olduğu için bir model kimyasal olarak 3,3'-diindolylmethane (DIM) kullanılan, Brassica gıda tesislerinde mevcut olan, ve farelerde IBD üzerinde tedavi edici etkileri olduğu bildirilmiştir^17,18. Buna ek olarak, son zamanlarda DIM hem kültürlü insan bağırsak hücrelerinde bağırsak geçirgenliği disfonksiyonu yanı sıra model nematode C. elegans¹⁹geliştirir keşfetti.

Bu çalışmada üç farklı deneysel koşul kullandık. İlk olarak, farklı bakterilerin, P. aeruginosa ve E. faecalis'in bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 1). İkinci olarak, canlı ve ısıya bağlı P. aeruginosa'nın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 2). Üçüncü olarak, Dim 'in (bir model kimyasal) P. aeruginosa ile beslenen C. elegans'ın bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini ölçtük(Şekil 3).

Bu çalışmanın amacı, çeşitli bağırsak bakterileri ile tedavi ile de değişen C. elegansbağırsak geçirgenliğini ölçmek optimize protokoller geliştirmek oldu yanı sıra kimyasallar ile.

1. P. aeruginosa PAO1 ve Escherichia coli OP50 Kültürünün hazırlanması

1. 500 mL sterilize Edilmiş Luria-Bertani (LB) ortamı(Tablo 1)hazırlayın ve p. aeruginosa kolonisini ortama aşılayın. Kültürü 37 °C'de 150 rpm sallayarak 14 ila 15 saat kuluçkaya yatırın.
2. Bakteri kültürünü eşit olarak iki 500 mL santrifüj tüpüne dağıtın ve tüpleri 30 dakika boyunca 4 °C'de 3.220 x g'de santrifüj edin.
3. Hacim 50 mL (ilk hacmin onda biri) olana kadar supernatant çıkarın ve bakteriyel pelet resuspend.
4. Konsantre bakteri kültürünü kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. P. aeruginosa kültürünün depolama süresi kadar olabilir 1 ay, ama taze kültür bağırsak hasarı neden olmak için daha iyidir.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Tüm canlı bakterilere ek olarak, bakteri kültürünün supernatant bağırsak bakterilerin etkilerini test etmek için kullanılabilir¹⁹.
5. E. coli OP50 hazırlamak için, dyt ortamda kültür E. coli OP50(Tablo 1)ve daha sonra yukarıda açıklananlar için benzer adımlar uygulayın ama orijinal hacmin altıda birine hacmi azaltmak. Örneğin, ilk hacim 500 mL ise, supernatant çıkardıktan sonra, kalan hacim yaklaşık 83 mL'dir.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

2. Enterococcus faecalis KCTC 3206 Kültür hazırlanması

1. Sterilize beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu 500 mL hazırlayın(Tablo 1).
2. Bir koloniyi BHI suyu 500 mL'ye dönüştürün ve 37 °C ve 150 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesinde 14-15 saat boyunca kültürü kuluçkaya yatırın.
3. Bakteri kültürünü eşit olarak iki 500 mL santrifüj tüpüne dağıtın ve tüpleri 30 dakika boyunca 4 °C'de 3.220 x g'de santrifüj edin.
4. Hacim 50 mL (ilk hacmin onda biri) olana kadar supernatant çıkarın ve pelet yeniden askıya.
5. Konsantre bakteri kültürünü kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Taze kültür bağırsak geçirgenliği üzerindeki etkilerini test etmek için daha iyidir.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

3. Isı ile inaktive E. coli OP50 ve Isı ile inaktive P. aeruginosa PAO1 Kültürlerin Hazırlanması

1. Kültür ve hasat yukarıda açıklandığı gibi bakteri (adım 1.1-1.3).
2. Isı-E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 kültür daha önce açıklandığı gibi^{inaktive 20,21,22}. Isı inaktivasyonu için, 65 °C 'de (su banyosu) 30 dakika boyunca resuspended bakterileri kuluçkaya yatırın.
3. Konsantre bakteri kültürünü oda sıcaklığına kadar soğutun ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Depolama süresi 1 aya kadar olabilir.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

4. C. elegans Bağırsak Geçirgenliği Farklı Bakterilerin Etkilerini Test etmek için Nematod Büyüme Orta (NGM) Plakaların Hazırlanması

1. 500 mL cam şişeye 1,25 g pepton, 1,5 g NaCl, 8,5 g agar, manyetik karıştırıcı ve 487,5 mL distile su yerleştirin(Tablo 1).
2. Karışımı iyice karıştırın, 121 °C'de 15 dk karışımı otoklavlayın ve karışımı 30 dk su banyosunda 55 °C'ye kadar soğutun.
3. Ortayı su banyosundan çıkarın, bileşenleri (0,5 mL 1 M CaCl_2,0,5 mL kolesterol, 0,5 mL MgSO₄, 12,5 mL KPO₄)(Tablo 1) NGM'ye ekleyin ve iyice karıştırın.
   NOT: Kolesterol (mutlak etanol içinde çözünmüş) dışında tüm bireysel bileşenler otoklavlı olmalıdır ve her deneysel adım temiz bir tezgah üzerinde yapılmalıdır.
4. Her 90 x 15 mm Petri kabına 20 mL NGM dağıtın ve agarın oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) temiz bir tezgahta katılamasını bekleyin. NGM plakaları 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.
   NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. FITC-dextran boyama için kullanılan NGM plakaları aynı prosedürle (4.1-4.3. basamaklardan) hazırlanmıştır. Her 60 x 15 mm Petri kabına 10 mL NGM dağıtıldı ve oda sıcaklığında (yaklaşık 20 °C) temiz bir tezgahta katılaşmaya izin verildi.
5. Bakteri kültürünü 4 °C buzdolabından çıkarın ve kültürü NGM plakalarına yaymadan önce kültürü iyice girdaplayın.
6. Her taze NGM plakasına toplam 800°L bakteri kültürü ekleyin ve plakaların bir gecede 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde kurumasını bekleyin.
   NOT: İlk deney için(Şekil 1), E. coli OP50 ile iki NGM plaka, P. aeruginosa PAO1 ile bir NGM plaka ve E. faecalis KCTC3206 ile bir NGM plaka sı hazırlanmıştır. İkinci deney için(Şekil 2), canlı E. coli OP50 ile iki NGM plaka, canlı P. aeruginosa PAO1 ile bir NGM plaka ve ısı yalıtımlı P. aeruginosa PAO1 ile bir NGM plaka sıyrıklı p. aeruginosa PAO1 hazırlandı.

5. P. aeruginosa ile beslenen C. elegans Fed'in Bağırsak Geçirgenliği Üzerine Kimyasal (DIM) Etkilerini Test Etmek Için NGM Plakalarının Hazırlanması

1. 500 mL cam şişeye (NGM agar) 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL distile su, manyetik karıştırıcı ve 6,8 g agar ekleyin.
2. 0,5 g pepton, 0,6 g NaCl, 195 mL distile su ve başka bir 500 mL cam şişe (NGM suyu) için agar olmadan bir manyetik karıştırıcı ekleyin.
3. Otoklav iki şişe (adımlar 5.1-5.2), bir boş 100 mL cam şişe ve 15 dakika için boş 500 mL cam şişe 121 °C. Daha sonra, şişe içeren ortamın 30 dakika su banyosunda 55 °C'ye soğumasını bekleyin.
4. Katkı kimyasallarını NGM suyuna ekleyin: 0.4 mL 1 M CaCl_2,0.4 mL kolesterol etanol (mL), 0.4 mL 1 M MgSO₄ ve 10 mL 1 M KPO₄ (bu bileşenlerin hepsi etanoldeki kolesterol dışında sterilize edilmelidir). Daha sonra karışımı 55 °C'de manyetik bir karıştırıcı ile iyice karıştırın.
5. Otoklavlı boş 500 mL cam şişeyi dimetil sülfoksit (DMSO) ve otoklavlı boş 100 mL cam şişeyi DIM ile etiketleyin.
6. 50 mL NGM suyu midim etiketli 100 mL şişeye aktarın. Şişeye 500 μL 20 mM DIM stok ekleyin ve iyice karıştırın.
   NOT: DIM, DMSO'da (20 mM DIM stok) çözünür.
7. NGM agar ortamını su banyosundan hızlıca çıkarın, DIM etiketli şişeye 50 mL'lik NGM agar ortamı ekleyin ve iyice karıştırın.
8. Her 90 mm x 15 mm Petri kabına 20 mL DIM içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık beş DIM içeren NGM plakası yapılabilir.
   NOT: Her NGM plakasındaki DIM'in son konsantrasyonu 100 μM olacaktır.
9. DMSO içeren NGM plakasını hazırlamak için 150 mL NGM suyu DMSO etiketli 500 mL şişeye aktarın. Şişeye 1,5 mL DMSO ekleyin ve iyice karıştırın.
10. DMSO etiketli şişeye 150 mL NGM agar ortamı ekleyin ve iyice karıştırın.
11. Her 90 mm x 15 mm Petri kabına 20 mL DMSO içeren NGM ortamı yerleştirin. Bu adımdan yaklaşık on beş DMSO içeren NGM plakası yapılabilir.
    NOT: Her NGM plakasında KiDSO'nun son konsantrasyonu %0.5 olacaktır.
12. Plakaları oda sıcaklığında en az 3 saat katıhale getirin ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
13. E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 kültürünü 4 °C buzdolabından (adım 1.4)'ten çıkarın ve NGM plakalarına yayılmadan önce kültürü düzgün bir şekilde girdaplayın.
14. Her taze NGM agar plaka üzerine 800 μL E. coli OP50 veya P. aeruginosa PAO1 bakteri kültürünü koyun ve plakaların bir gecede 20 °C'lik bir kuluçka makinesinde kurumasını bekleyin.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir. Üçüncü deney için(Şekil 3),canlı E. coli OP50 ile kaplanmış iki DMSO içeren NGM plakası, canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir DMSO içeren NGM plakası ve canlı P. aeruginosa PAO1 ile kaplanmış bir DIM içeren NGM plakası hazırlanmıştır.

6. Yaş senkronize C. elegans hazırlanması

1. Katı bir NGM plaka üzerinde solucanlar büyümek ve istenilen nüfusa ulaşınkadar E. coli OP50 ile beslemek.
2. Daha önce açıklandığı gibi zamanlanmış yumurta döşeme yöntemi veya beyazlatma çözeltisi tedavisi kullanarak yumurta senkronize^20,23,24.

7. Bakteri veya DIM ve FITC-dextran Besleme tedavisi

1. Canlı E. coli OP50 ile desteklenen NGM plakalarında 20 °C'de yaş senkronize yumurtaları 64 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
2. Yaş senkronize L4 larvasını S-tampon ile yıkayın ve bunları (yaklaşık 500'den fazla solucan) farklı bakteri ve kimyasallar içeren tedavi NGM plakalarına aktarın (adım 4.6 ve 5.14'ten sonra NOT'ta açıklanmıştır). 20 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
   NOT: Kullanılan bakteri ve kimyasallara göre tedavi süresi 24 ile 72 saat arasında değişmektedir. DIM terapötik veya önleyici etkisi de patojenler ile solucanlar pretreating ve daha sonra DIM (terapötik etkisi) ile solucanlar tedavi veya DIM ile solucanlar pretreating ve daha sonra patojenler ile tedavi (önleyici etkisi)¹⁹değerlendirilebilir.
3. FITC-dekstran takviyesi plakaları hazırlamak için 2 mL ısı yalıtımlı E. coli OP50 ile 4 mg FITC-dextran'ı karıştırın. Daha sonra, FITC-dextran ve E. coli OP50 karışımının 100 μL'sini yirmi taze NGM agar plakaya (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
   NOT: Her NGM plakasında KI FITC-dextran'ın son konsantrasyonu 20 g/mL olacaktır.
4. Araç kontrol tedavisi için FITC-dextran olmadan beş Adet E. coli OP50 içeren NGM plakası hazırlayın. Bu amaçla, 100 μL ısı yalıtımlı E. coli OP50'yi her taze NGM agar plakasına (60 mm x 15 mm) bölün ve plakaların temiz bir tezgahta 1 saat kurumasını bekleyin.
   NOT: Her bağımsız deney için, on beş FITC-dextran takviyesi NGM plakaları ve FITC-dextran olmadan beş NGM plakaları gereklidir.
5. 48 saat tedaviden sonra (adım 7.2'den itibaren), solucanları S-tampon ile yıkayın, solucanları FITC-dextran takviyesi plakalara ve STK plakalarına FITC-dextran olmadan aktarın ve plakaları bir gecede kuluçkaya yatırın (14-15 saat).
   NOT: Her tedavi grubu için FITC-dextran boyama (veya araç kontrol beslemesi) 5 kopyagereklidir.
6. Solucanları S-tampon ile yıkayın ve taze NGM agar plakasında 1 saat boyunca sürünmelerine izin verin.
   NOT: Her bağımsız deney için toplam 20 adet taze NGM plakasına ihtiyaç vardır. Bu adımda, E. coli OP50 olmadan veya E. coli OP50 ile desteklenen NGM plakasını kullanabilirsiniz.
7. Siyah 96 kuyulu düz alt plakanın her kuyuya %4 formaldehit çözeltisi 50 μL ekleyin. Floresan ölçümleri için her NGM plakasından yaklaşık 50 solucanı her kuyuya aktarın. 1 ila 2 dakika sonra, iyice her kuyudan tüm formaldehit çıkarın ve kuyuları kaplamak için montaj ortamı 100 μL ekleyin.
   NOT: Formaldehit çözeltisi (%4) solucanları hareketsiz hale getirmek ve onarmak için kullanılır. Her tedavi grubu için görüntü analizi için 5 kuyu (5 çoğaltma) kullanılır.

8. Operet Görüntüleme Sistemi ile Görüntüleme C. eleganlar ve FITC-dekstran Floresan Alımı Ölçülerek Bağırsak Geçirgenliğinin Tayini

NOT: Floresan stereomikroskopi Operet sistemi yerine görüntü analizi için kullanılabilir.

1. Floresan görüntüleri yakalayın ve Operet Yüksek İçerikli Görüntüleme Sistemi'ni kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün ve Harmony yazılımı ile görüntüleri analiz edin.
2. Harmony yazılımında, kapağı açmak ve plakayı makineye koymak için kapağı aç simgesine basın.
3. Parametreleri ayarlayın.
4. Ayarla'yıtıklatın, plaka türünü seçin (96-iyi corning düz alt) ve kanalları ekleyin (parlak alan ve EGFP kanalları).
5. Düzeni ayarlayın. Düzen seçiminegidin ve ardından Parça'yı seçin ve parametreleri ayarlayın (ilk resim 1 μm, düzlem sayısı 10, mesafe 1 μm' dir).
6. Tedavi kuyularından birini seçin ve bir yakalama alanı seçin ve resimlerin Çalıştır deneyi bölümünde tatmin edici olup olmadığını kontrol etmek için Test tuşuna basın.
7. Resimler tatmin ediciyse, Ayarla bölümüne dönün ve ekranın sonundaki Sıfırla simgesine basın. Ardından, tüm hedef kuyuları ve uygun sayıda yakalama alanını seçin.
8. Denemeyi Çalıştır'a tekrar gidin ve plaka adını girin, ardından işleme başlamak için Başlat'a basın.
9. Floresan yoğunluğunu ölçmek için görüntü analizi bölümüne gidin ve görüntüyü girin. EGFP kanalını ve yöntemini seçerek hücreyi bulun B. Ortak eşiği 0,5'e,alanı >200 μm 2'ye, bölme faktör'ü 3,0'a, bireysel eşiği 0,18'e ve 0,18'den fazlasına göre ayarlayın. Ardından, yoğunluk özelliklerini hesaplayın ve çıkış olarak ortalamayı seçin. Kurulumu kaydetmek için Uygula simgesine basın.
10. Bir ısı haritası ve veri tablosu alarak yoğunluğuölçmek için Değerlendirme bölümüne gidin. Okuma parametresini Hücrelere ayarlayın — Yoğunluk Hücresi EGFP Ortalaması — İyi Başına Ortalama ve değerlendirmeye başlayın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
11. Operet'ten veri ayıklamak için Ayar düğmesini tıklatın ve Veri yönetiminiseçin.
12. Arşiv Yaz'ıseçin ve ardından gözatlayı açın ve dosyayı seçin.
13. Dosyayı seçmek için sol köşedeki küçük + sinyali tıklatın ve ardından Ölçüm'ü tıklatın ve Plaka adınıseçin.
14. Dosyayı seçin ve Tamam'ıtıklatın.
15. Etkin yolda Gözat sinyalini tıklatarak dosyayı kaydetme yolunu seçin.
16. Veri dosyasını kaydetmek için Başlat'ı tıklatın.
    NOT: Protokol burada duraklatılmış olabilir.

9. C. eleganların FITC-dekstran Floresanlarının İstatistiksel Analizi

1. Verileri içe aktarın ve bir istatistik yazılımı kullanarak ortalama ve standart sapmayı (SD) hesaplayın.
2. Tukey'nin çoklu karşılaştırma testini takip eden tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile önemli farkı analiz edin.

P. aeruginosa PAO1 ile kuluçkadan sonra, C. elegans diğer iki bakteri suşları ile kuluçka sonrası gösterilen floresan göre solucan vücudunda FITC-dextran floresans önemli bir artış gösterdi(Şekil 1). E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 ve E. faecalis KCTC3206 ile beslenen solucanların floresan yoğunlukları sırasıyla 100.0 ± 6.6, 369.7 ± 38.9 ve 105.6 ± %10.6 idi. Veriler P. aeruginosa epitelyal bağırsak bariyerinde daha hayati hasara neden olduğunu vurgulamak, ve bu nedenle, solucanlar bağırsak geçirgenliği dramatik bir artış sergiledi. Bu sonuca dayanarak, FITC-dextran kolayca bağırsak tabakası ile nüfuz edebilir, bu yüzden P. aeruginosa DIM etkilerini taramalar için potansiyel bir aday patojen olarak seçildi. E. faecalis ekstrasellüler süperoksit ve hidrojen peroksit üretebilir bir bağırsak patojen olmasına rağmen, hangi zarar kolon epitel hücreli DNA¹⁵, Bazı durumlarda, E. faecalis de bazı patojenlere karşı bakteriyosin üretmek için yeteneği nedeniyle potansiyel bir probiyotik bakteri olarak bilinir^25,26. Bir probiyotik fonksiyonları epitel yüzeylere bağlılık dahil, insan gastrointestinal sistemde kalıcılık, bağışıklık stimülasyonu ve bağırsak patojenlerine karşı antagonistik aktivite²⁶. Bu nedenle, E. faecalis ile kuluçkaya yatan solucanların bağırsak geçirgenliği araç kontrol solucanları ile karşılaştırıldığında değişmeden kalmıştır. Bu sonuç enfeksiyon miktarı floresan yoğunluğundaki artış tarafından incelenebilir gösterir, ve P. aeruginosa diğer suşları daha fazla bağırsak geçirgenliği neden olur.

Şekil 2 solucan gövdesindeki FITC-dextran floresan yoğunluğuna göre canlı ve ısı yalıtılmış P. aeruginosa PAO1 arasındaki farkı göstermektedir. Hem floresan görüntüleri hem de istatistiksel veriler patojenin ısı inaktivasyonundan sonra nematodlara karşı herhangi bir toksisiteyi tetiklemeyeceğini göstermektedir. P. aeruginosa eksotoksin A üretebilir - birçok hayvan için ölümcül güçlü bir hücre dışı sitotoksin²⁷. Ekzoztoksin A, 45 °C ila 60 °C²⁸arasında ısıtılarak hızla kaldırılabilir. Bu nedenle, ısı-inaktive P. aeruginosa solucanların bağırsak epitel geçirgenliği zarar edemedi. P. aeruginosa PAO1 kültürünün supernatant önemli ölçüde bağırsak geçirgenliği zarar, ve bu nedenle, kültür supernatant yerine bütün P. aeruginosa hücreleri bağırsak geçirgenliği disfonksiyonu neden kullanılabilir¹⁹. Supernatant endotoksinler içerir, eksotoksin A, ve lipopolisakkaritler²⁹, ve bu bileşenlerin hücre toksisitesi neden olduğu bilinmektedir^30,31. Bu nedenle, supernatant bu bileşenleri bağırsak geçirgenliği etkileyebilir, biz C. elegansbağırsak geçirgenliği üzerinde eksotoksinler ve lipopolisakkaritler doğrudan etkisini kontrol etmedi rağmen.

48 h için DIM cotreatment önemli ölçüde P. aeruginosa tek tedavi ile karşılaştırıldığında solucanların bağırsakları içinde FITC-dextran floresan yoğunluğu azaldı(Şekil 3C,D). Tek yönlü ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile yapılan istatistiksel analizler, DIM ile tedavi den sonra, p. aeruginosa-onlytreatment floresan yoğunluğuile karşılaştırıldığında ortalama floresan yoğunluğunun önemli ölçüde azaldığını göstermiştir. P. aeruginosaile tedavi edilen solucanların floresan yoğunlukları sırasıyla %486.3 ± 41.7 ve 414.2 ± %25.0 idi (Şekil 3E). Bu sonuca dayanarak, DIM bakteriyel enfeksiyonların neden olduğu bağırsak geçirgenlik disfonksiyonu tedavi etmek için iyi bir doğal ürün olarak kabul edilebilir. Bu sonuç DIM bağırsak hücrelerinde hücre iltihabı zayıflatmak olduğunu gösterdi, hangi bağırsak geçirgenliğini azaltır¹⁹. Bu sonuç bir fare modeli elde edilen sonuçlara benzer, hangi DIM kolon iltihabı önemli bir azalma gösterdi³².

Şekil 1: Farklı bakterilerin C. elegans'ın bağırsak geçirgenliği üzerine etkileri. Parlak alan, FITC floresan (yeşil kanal) ve birleştirilmiş görüntüler de dahil olmak üzere solucanların mikroskopi görüntüleri. (A) E. coli OP50'den FITC-dekstran beslemesiz solucanların mikroskobu görüntüleri, (B) FITC-dextran beslemeli E. coli, (C) FITC-dextran beslemeli P. aeruginosa PAO1 ve (D) E. faecalis KCTC3206 FITC-dextran besleme ile. Ölçek çubuğu = 1 mm (beyaz) ve 200 μm (siyah). Yaş senkronize L4 larvaları E. coli (A, B), P. aeruginosa (C) ve E. faecalis (D)ile tohumlanmış NGM plakalarında 48 saat kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, solucanlar FITC-dextran(B-D)içeren plakalara transfer edildi , araç kontrolü hariç(A). (E) Farklı bakteriyel tedavilerin FITC floresan yoğunluğu. FITC floresan daha yüksek bir yüzdesi daha yüksek bir bağırsak geçirgenliği gösterdi. Sütunlar ve hata çubukları araç kontrolünden önemli bir fark için ± SD. ***P < 0.001 ortalamayı gösterir. ^###P < 0.001 P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) ile beslenen FITC-dekstran ile tedavi solucanlar önemli bir fark için. Bu grafik iki bağımsız denemeyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Canlı ve ısı yayan P. aeruginosa PAO1'in C. elegans'ınbağırsak geçirgenliği üzerine etkileri. (A) canlı E. coli OP50 fitc-dextran besleme olmadan solucanların mikroskobu görüntüleri, (B) FITC-dextran besleme ile canlı E. coli, (C) FITC-dextran besleme ile canlı P. aeruginosa PAO1, ve (D) FITC-dextran besleme ile ısı-inaktive P. aeruginosa. Ölçek çubuğu = 1 mm (beyaz) ve 200 μm (siyah). Yaş senkronize L4 larvaları canlı E. coli (A, B), canlı P. aeruginosa (C),ve ısı yalıtımlı P. aeruginosa (D) ile tohumlanmış NGM plakalarında 48 saat kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, solucanlar FITC-dextran(B-D)içeren plakalara transfer edildi , araç kontrolü hariç(A). (E) FITC floresan yoğunluğu canlı ve ısı-inaktive P. aeruginosa PAO1 karşılaştırarak. Sütunlar ve hata çubukları araç kontrolünden önemli bir fark için ± SD. ***P < 0.001 ve **P < 0.01 ortalamayı gösterir. ^###P < 0.001 canlı P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) ile beslenen FITC-dextran-treated solucanlar önemli bir fark için. Bu grafik iki bağımsız denemeyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: DIM'in C. elegans beslediği Bağırsak geçirgenliği üzerine etkisi P. aeruginosa'yı besler. (A) E. coli OP50'den FITC-dekstran beslemesiz solucanların mikroskobu görüntüleri, (B) FITC-dextran beslemeli E. coli, (C) FitC-dextran beslemeli P. aeruginosa PAO1 ve (D) P. aeruginosa ve DIM (100 μM) FITC-dextran besleme ile eş zamanlı işlem. Ölçek çubuğu = 1 mm (beyaz) ve 200 μm (siyah). Yaş senkronize L4 larvaları canlı E. coli (A, B), canlı P. aeruginosa (C), canlı P. aeruginosa ve DIM(D)ile tohumlanmış NGM plakalarında 48 saat kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, solucanlar FITC-dextran(B-D)içeren plakalara transfer edildi , araç kontrolü hariç(A). (E) FITC floresan yoğunluğu C. elegans bağırsak geçirgenliği DIM etkilendiğini gösterir. Sütunlar ve hata çubukları araç kontrolünden önemli bir fark için ± SD. ***P < 0.001 ortalamayı gösterir. ^###P < 0.001 ve ^##P < 0.01 P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) ile beslenen FITC-dextran ile tedavi edilen solucanlardan önemli bir fark için. Bu grafik iki bağımsız denemeyi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Otomatik floresan mikroskobu ve kantitatif görüntü analizini birleştiren C. elegans'ta bağırsak geçirgenliğini belirlemek için bu yeni yöntem kullanılarak, bağırsak mikroorganizmalarının veya kimyasallarının neden olduğu farklar özellikle C. elegans bağırsağında invivo olarak belirlenebilir. Bu protokol bağırsak geçirgenliği araştırmaları için yararlıdır ve rahatlığı ve kolay manipülasyonu nedeniyle reaktif oksijen türlerinin (ROS) stres koşulları altında belirlenmesi ve morfolojik incelemeler gibi birçok görev için geçerlidir. Ayrıca bu yöntem, C. elegans'ta birden fazla patojene karşı terapötik ve önleyici yöntemlerin etkilerini belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, zararlı ve yararlı bakteriler de dahil olmak üzere farklı bakteriyel suşların mekanizmalarını araştırmak için etkili bir protokol olabilir. Benzer yapılara sahip bazı patojenler ve probiyotik bakteriler konak üzerinde farklı etkiler uygulamak^33,34. Bu prosedür, bakterilerin hangi mekanizmayı kullandığını ve hedeflenen yüzeylerin hücre dışı veya hücre içi olarak nerede salgılanabileceğinin değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Buna ek olarak, bu yöntem aynı zamanda ısıl tedavi patojen inaktivasyonu nda hayati bir rol oynadığı hipotezini güçlendirmek için yardımcı olabilir.

Ancak, bu işlem sırasında bazı zorluklar da vardır. İlk olarak, her tabaktaki solucan sayısı istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar ve sağlam solucan tespiti için önemlidir, bu nedenle %70-90 birleşme (kuyu başına en az 50 solucan) önerilir. Buna göre, uygun solucanlar elde etmek için deneme deneyleri yapılmalıdır. İkinci olarak, plaka özellikleri, özellikle alt malzeme için görüntü kalitesini ve yoğunluk tayini etkileyen önemli faktörlerden biridir. Bazı gelişmiş deneylerde, mükemmel optik kalitesi sayesinde floresan ölçümü için en iyi seçenek cam alttır. Ancak, yüksek fiyat nedeniyle, bir polistiren alt genellikle kullanılır, kalite cam alt kadar yüksek olmasa da. Son olarak, C. elegans için plaka kaplama yöntemleri optimizasyon gerektirir. Bu deneyde floresan montaj ortamı, doku kesitlerinin etiketlemeyi koruyabileceği ve geliştirebildiği, ancak plaka nın altındaki solucanları düzgün bir şekilde düzeltemediği için uygulanmıştır.

Bu protokolün sınırlamaları vardır; C. elegans bir nematod olduğu için, insan bağırsak hücresi monokatlarında ve memelilerde değerlendirme gibi başka deneyler yapılmalıdır. Bu yöntemde C. elegans'ta patojenik bakteri ve kimyasallarla beslenen fenotibik değişiklikler saptı. Bu nedenle, bağırsak bakterilerinin patojenik veya probiyotik etkilerinin yanı sıra kimyasalların terapötik etkilerinin altında yatan moleküler ve genetik mekanizmalar daha da açıklığa kavuşturulmalıdır. Patojenik bakteriyel enfeksiyon ve kimyasalların terapötik etkileri ile uygulanan spesifik sinyal yolları hem çeşitli mutant bakteriler hem de mutant solucanlar kullanılarak değerlendirilebilir. Buna ek olarak, bağırsak bakterilerinpatojenik ve probiyotik etkileri sorumlu kimyasal bileşenleri tanımlayan daha derinlemesine çalışmalar yararlı olacaktır.

Burada, FITC-dextran besleme kullanılarak farklı bakteri ve kimyasallarla tedavi edilen C. eleganlarda bağırsak geçirgenliğinin ölçülmesi için deneysel bir protokol sunulur. Biz bu protokoller temel biyolojik araştırma için yararlı olacağına inanıyoruz, bağırsak mikrobiyota ve bağırsak sağlığı arasındaki etkileşimi çalışma gibi, yanı sıra bağırsak sağlığı sorunlarının önlenmesi ve tedavisi için probiyotikler ve nutraceuticals gelişimi için.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışma Kore Bilim ve Teknoloji Enstitüsü intramural araştırma hibe (2E29563) tarafından desteklenmiştir.