Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

İn vitro mikronükleus tahlil genotoksisite ve sitotoksisite değerlendirmek için iyi kurulan bir yöntemdir ama manuel mikroskobik kullanarak tahlil Puanlama zahmetli ve subjektif ve inter-scorer değişkenlik muzdariptir. Bu yazıda, multispektral görüntüleme akışı sitometrisi kullanılarak testin tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır.

İn vitro Mikronukleus (MN) tahlil genellikle sitotoksisite ve genotoksisite değerlendirmek için kullanılır ama manuel mikroskobik ile tahlil Puanlama zahmetli ve SCORERS arasındaki değişkenlik nedeniyle sonuçlarında belirsizlik tanıttı. Bu sorunu gidermek için, otomatik slayt tarama mikroskopinin yanı sıra geleneksel akış sitometri yöntemleri, skorer önyargı kaldırılması ve verimi artırmak için bir girişim tanıtıldı. Ancak, bu yöntemlerin hücre sitoplazması ve akış sitometri ile görsel MN doğrulama veya görüntü veri depolama eksikliği görselleştirmek için yetersizlik gibi kendi içsel sınırlamaları vardır. Multispectral Imaging Flow cytometry (MIFC) bu sınırlamaların üstesinden gelme potansiyeline sahiptir. MIFC, mikroskopinin yüksek çözünürlüklü floresan görüntülerini geleneksel Akış sitometrisi ile istatistiksel sağlamlık ve hız ile birleştirir. Buna ek olarak, tüm toplanan görüntüler doza özgü dosyalarda depolanabilir. Bu yazıda MIFC üzerinde MN tahlil tam otomatik bir sürümünü gerçekleştirmek için geliştirilen protokol açıklanmaktadır. İnsan lenfoblastoid TK6 hücreler (75 mM KCl),% 4 formalin ile sabit ve nükleer içerik Hoechst 33342 ile lekelenmiş bir hipotonik çözüm kullanılarak büyütüldü. Tüm örnekler MıC üzerinde süspansiyon, tahlil için gerekli tüm önemli olayların yüksek çözünürlüklü görüntülerin satın alma (örneğin, ve MN olmadan mononükleated ve polinükleated hücreler gibi binükleated hücreler) çalıştırıldı. Görüntüler otomatik olarak tanımlanan, kategorize ve MIFC veri analizi yazılımı numaralandırılmış, hem sitotoksisite ve genotoksisite otomatik Puanlama için izin. Sonuç olarak MıC in vitro MN tahlil gerçekleştirmek için kullanarak MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışların sitotoksisite birkaç farklı düzeylerde tespit edilecek sağlar, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında TK6 hücrelerin maruz kalma aşağıdaki Mitomisin C ve colchicine, mannitol 'a maruz kaldıktan sonra MN frekansında önemli bir artış görülmez.

İn vitro mikronükleus (MN) assay, çeşitli alanlara maruz kalan bireyler arasında insan biomonitoring gibi kimyasal ve ilaç geliştirme gibi çeşitli alanlarda bir tarama aracı olarak sitotoksisite ve genotoksisitesi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir testtir. çevre, mesleki veya yaşam tarzı faktörler^1,2,3. MN, iki ana kız çekirdeğinden birine dahil olmayan hücre bölünmesi sırasında oluşturulan kromozom parçaları veya tüm kromozomlar oluşur. Telophase takipte, bu kromozomal malzeme, ana çekirdeklerden iki ayrı olan Sitoplazmanın içindeki bir birey, yuvarlak bir vücuda dönüşür². Bu nedenle, MN DNA hasarının temsilcisidir ve genotoksisite testi⁴' te bir uç nokta olarak yıllardır kullanılmıştır. MN ölçmek için en uygun yöntem sitokinesis-Block Mikronukleus (cbmn) tahlil olduğunu. CBMN tahlil kullanarak, binükleated hücrelerde MN sıklığı (BNCs) numunenin içine Sitalasin B (CYT-B) ekleyerek puan olabilir. CYT-B nükleer bölünme sağlar ancak hücresel bölünmesini önler ve böylece, sadece bir kez⁵bölünmüş bncs için MN Puanlama kısıtlar.

Hem microskopi hem de Akış sitometrisi kullanarak protokoller geliştirilmiştir ve doğrulanmıştır ve rutin olarak in vitro MN tahlil^{6,7,8,9,10, gerçekleştirmek için kullanılır 11},^12,13,14. Mikroskopide, MN 'in meşru olduğunu ancak zaman alıcı ve Puanlayıcılar¹⁵arasında değişkenliğe eğilimli olduğunu görsel olarak onaylayabilmesini sağlar. Bu adrese, otomatik mikroskopi yöntemleri slaytlar taramak ve çekirdekler ve mn^16,17,18,19görüntüleri yakalamak için geliştirilmiştir, ancak sitoplazma görselleştirilebilir, yapma bir MN gerçekten belirli bir hücre ile ilişkili olup olmadığını belirlemek zor. Ayrıca, bu yöntemlerin CYT-B⁹kullanırken sitotoksisite hesaplanması için gerekli olan POLINÜKLEATED (Poly) hücreleri (Tri ve quadranucleated hücreler dahil) tespit zorlukları vardır. Akış cytometri yöntemleri MN tahlil gerçekleştirmek için geliştirilen floresans yanı sıra ileri ve yan Scatter yoğunlukları her iki çekirdekler ve mn aşağıdaki hücre dan kurtarılmış olan nüfus belirlemek için uygulanan lizis^{20,21 ,22}. Bu, verilerin birkaç dakika içinde birkaç bin hücreden elde edilmesini sağlar ve otomatik analiz²³' e izin verir; Ancak, hücreleri görselleştirmek için yetersizlik puan olayların hakiki olduğunu onaylamak mümkün kılar. Ayrıca, hücre membranı parçalanması CYT-B kullanımını inhibe yanı sıra kromozom agrega veya apoptotik organları gibi diğer enkaz içeren bir süspansiyon oluşturma ve bu MN²⁴ayırt etmek için bir yolu yoktur.

Bu sınırlamalar ışığında, multispectral Imaging Flow cytometry (MIFC), mikroskopinin yüksek çözünürlüklü floresan görüntülerini konvansiyonel akış sitometri istatistiksel sağlamlık ve hızı ile birleştiren bu yana MN tahlil gerçekleştirmek için ideal bir sistemdir. Mifc 'de, tüm hücreler bir akışkanlar sistemine getirilmiştir ve daha sonra hidrodinamik olarak bir akış hücresi küvetinin merkezine odaklanmıştır. Tüm hücrelerin ortogonal aydınlatma bir aydınlık alan (BF) ışık yayan diyot (LED), bir yan Scatter lazer ve (en azından) bir floresan lazer kullanımı ile gerçekleştirilir. Floresan fotonlar üç (20X, 40X veya 60x) yüksek sayısal diyafram objektif lensler biri tarafından yakalanan ve daha sonra bir spektral ayrışma elemanı geçer. Fotonlar daha sonra akış hücresinden geçerek tüm hücrelerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için bir şarj bağlantılı cihaz (CCD) kamera üzerine odaklanmıştır. Bulanıklaştırma veya streaking önlemek için, CCD zaman gecikmesi entegrasyonu (TDı) modunda, piksel içeriği satırdan hücreye akış hücre hızı ile eşzamanlı CCD aşağı satır aktararak izler çalışır. Piksel bilgileri daha sonra son piksel satırından toplanır. Spektral ayrıştırma ile birlikte TDı görüntüleme 12 görüntü (2 BF, 10 floresan) akış hücresinden geçen tüm hücrelerden aynı anda yakalanması için izin verir. Tüm yakalanan görüntüler örnek özgü veri dosyalarında saklanır, izin çözümleme MıC veri analizi yazılımı kullanarak herhangi bir zamanda gerçekleştirilecek. Son olarak, veri dosyaları tüm iki değişkenli grafiklerde hücresel görüntüler ve noktalar arasındaki bağlantıyı korur. Bu, geleneksel bir iki değişkenli arsa üzerinde herhangi bir nokta vurgulanabilir ve karşılık gelen BF ve floresan görüntüleri²⁵görünecektir anlamına gelir.

Son zamanlarda, mifc tabanlı yöntemler her iki trik radyasyon biodosimetri için MN tahlil gerçekleştirmek için geliştirilmiştir^{26,27,28,29,30,31} ve genetik Toksikoloji^32,33 test. Bu çalışma, ana çekirdeklerin, MN ve Sitoplazmanın hücresel görüntülerinin diğer yöntemlerden²⁶' dan daha yüksek verim ile yansımalı olduğunu göstermiştir. MONO hücreler, BNCs (MN ile ve olmadan) ve POLI hücreler de dahil olmak üzere analiz için gerekli tüm hücre türleri, otomatik olarak MIFC veri analiz yazılımında tanımlanabilir ve Fenech ve ark. tarafından geliştirilen Puanlama kriterlerinin uygulanması ile gerçekleştirilir. çeşitli matematiksel algoritmalar kullanımı^6,34. Biyodozimetri sonuçları, doz tepkisi kalibrasyonu eğrilerinin, BNC²⁹başına MN oranını ölçerek literatürdeki diğer otomatik yöntemlerden elde ettikleri boyutta benzer olduğunu göstermiştir. Ayrıca, toksikoloji son çalışmalar MONO hücreler, BNCs (ve MN olmadan) ve POLY hücreler görüntüleri otomatik olarak, tespit, sınıflandırılmış ve MIFC kullanılarak numaralandırılmış olabilir göstermiştir. Protokol ve veri analizi çeşitli clastogens ve aneugens³²TK6 hücreleri açığa sonra sitotoksisite ve genotoksisite hesaplanması sağladı.

Bu yazıda sunulan protokol MıC kullanarak in vitro MN tahlil gerçekleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu çalışmada kullanılan örnek işleme tekniği, tek bir örnek işlemek için 2 h 'den az gerektirir ve diğer yöntemlere kıyasla gerçekleştirmek oldukça kolaydır. MıC analiz yazılımında veri analizi karmaşıktır, ancak analiz şablonunun oluşturulması bu yazıda özetlenen adımları izleyerek birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Ayrıca, şablon oluşturulduktan sonra, herhangi bir başka iş olmadan tüm toplanan verilere otomatik olarak uygulanabilir. Protokol, TK6 hücrelerini clastogens ve aneugens 'a göstermek için gereken tüm adımları özetliyor, nasıl kültür, işlem ve leke hücrelerini açıklar ve MIFC kullanarak yüksek çözünürlüklü görüntülerin nasıl elde edildiğini gösterir. Ayrıca, bu yazıda otomatik olarak tanımlamak ve teklı hücreler, BNCs ve POLY hücreleri hem sitotoksisite ve genotoksisite hesaplamak amacıyla puan için MIFC yazılım verileri analiz için geçerli en iyi uygulamaları göstermektedir.

1. kültür orta ve TK6 hücre kültürü hazırlanması

Not: Bu protokolde kullanılan bazı kimyasallar toksik. Sitchasin B ile cildin solunmasını, yutulması veya temas etmesi ölümcül olabilir. Laboratuvar ceket ve iki çift nitril eldiven dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. Ele aldıktan sonra ellerini iyice yıkayın. Formalin/formaldehit, solunduğu veya yutulması durumunda zehirlidir; gözleri, solunum sistemi ve cilt için tahriş edici olduğunu; ve inhalasyon veya cilt teması ile hassasiyete neden olabilir. Gözleri ciddi hasar riski vardır. Bu potansiyel bir kanserojen.

1. Hazırlamak 565 mL 1x RPMı kültür ortamı. 5 ml em olmayan esansiyel amino asitler (100x), 5 ml sodyum pyruvat (100 mM), 5 ml penisilin-streptomisin-glutamin (100x) ve 50 mL, fetal sığır serumu (FBS) bir 500 mL şişe 1x RPMI 1640 orta ekleyin. 2-8 °C ' de biyoemniyet kabininde orta ve mağaza hazırlayın. TK6 hücrelere eklemeden önce Orta ° 37 °C ' ye ısı (bkz. malzeme tablosu).
2. 10 mL orta olarak 1 mL TK6 hücre (DMSO 'da-80 °C ' de saklanır) çözüyor. Hücre santrifüjler 200 x g 8 dakika ve Aspire supernatant. Hücreleri 50 mL 'ye aktarın ve 37 °C,% 5 CO₂' de inküye yapın. TK6 hücrelerin ikiye katlama süresi ~ 12-18 h ve birkaç (3 veya 4) geçiş hücrelerin maksimum proliferasyon oranı ulaşmak için gerekli olacaktır değişir (bkz. malzeme tablosu).
3. Kültür 100 mL hücreleri ~ 7-8 x 10⁵ hücreler/ml konsantrasyonu.

2. clastogens ve/veya aneugens ve Sitchasin B hazırlanması

1. İstenilen clastogens ve aneugens uygun stok konsantrasyonları hazırlayın. Örneğin, Mitomycin C için, 200 μg/mL 'Lik son bir stok konsantrasyonuna ulaşmak için 10 mL steril su içinde tam 2 mg şişe eritin. Mitomycin C üç ay boyunca 4 °C ' de saklanabilir (bkz. malzeme tablosu).
2. Deney gününde, sırasıyla steril su veya DMSO 'da seyreltiliyorsa, istenilen pozlama konsantrasyonlarına göre 10 kat veya 100 kat daha yüksek olan istenilen kimyasalların seyreltilmeleri hazırlayın.
3. Mitomycin C için, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 ve 5,0 μg/mL steril suda 3 mL seyreltme hazırlayın. Colchicine için, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 ve 0,5 μg/mL steril suda 3 mL seyreltme hazırlayın. Son olarak, mannitol için, 5, 10, 20, 30, 40 ve 50 mg/mL steril suda 3 mL dilüsyon hazırlayın.
4. 5 mg şişesini 25 mL DMSO 'ya sökerek bir 200 μg/mL stok konsantrasyonunu Sitahasin B 'ye hazırlayın. Sitchasin B, birkaç ay boyunca-20 °C ' de depolanabilir.

3. hücrelerin clastogens ve/veya aneugens maruz kalma

1. T25 Flask içinde ~ 7-8x10⁵ hücreler/ml hücrelerde 9 ml istenen kimyasal (örneğin Mitomycin C) 1 ml ekleyin. Kontrol örnekleri için 1 mL steril su ekleyin. Bir 37 °c, 5% Co₂ kuluçk 3 h için şişeler yerleştirin.
   Not: kimyasalların DMSO 'da seyreltilmiş olması durumunda, her Flask için sadece 100 μL kimyasal ekleyin ve denetimlere 100 μL DMSO ekleyin. Her Flask 9,900 mL hücre içermelidir.
2. 3 h sonra, kuluçk ve transfer hücreleri 15 ml Polipropilen tüpler için şişeler çıkarın. 200 x g 'de 8 dakika santrifüjler, süpernatant Aspire ve toplam 10 ml taze kültür ortamı içeren yeni T25 flsorlar için hücreleri transfer. 3 μg/mL 'Lik son konsantrasyon elde etmek için her bir Flask için Sitahasin B 'nin stok konsantrasyonu (200 μg/mL) 150 μL ekleyin.
3. OECD kuralları⁹' da önerdiği gibi, 1,5-2.0 iki katına eşit bir iyileşme süresi Için 37 °c, 5% Co₂ kuluçko için flsorları geri dönün. Bu iş için kullanılan TK6 hücreleri için, kurtarma süresi 24 saat oldu.
   Not: burada kullanılan TK6 hücrelerin ikiye katlama süresi 15 saat ve 24 saat (1,6 ikiye katlama kez) bir iyileşme süresi kullanıldı. Kurtarma süreleri daha az 1,5 ikiye katlama kez daha yüksek dozlarda BNCs sayısını etkileyen maruz numunelerde proliferasyonu azaltacaktır. tersine, 2,0 ' den fazla iyileşme süreleri kontrol örneklerinde polinükleated hücrelerin orantısız bir sayısını üretecektir, sitotoksisite hesaplamaları eğriltme.

4. DNA içeriğinin sabitleme ve etiketlenmesi için tamponların hazırlanması (bkz. malzeme tablosu)

1. Hazırlamak 75 mm potasyum klorür (KCL) ekleyerek 2,79 g için 500 ml Ultra saf su. 200 μm filtreli bir manyetik karıştırıcı ve steril filtre kullanarak solüsyonu 5 dakika karıştırın. 75 mM KCl çözeltisi birkaç ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir.
2. Deneme için yeterli miktarda 4% formalin hazırlayın ve toplam 2,1 mL 'Lik her örneğe eklenmesi gerektiğini tahmin ediniz. Örneğin, 10 mL% 4 formalin hazırlamak için, CA^{2 +} veya mg^{2 +} (PBS) olmadan 6 ml 1x Dulbecco fosfat-tamponlu tuzlu solüsyona 4 ml% 10 formalin stok ekleyin. Bu% 4 formalin birkaç hafta oda sıcaklığında saklanabilir.
3. 500 mL şişe 1x PBS 'ye 10 mL FBS ekleyerek 510 mL yıkama tamponu (1X PBS 'de% 2 FBS) hazırlayın.
4. 10 mL 100 μg/mL konsantrasyonunu Hoechst 33342 ile hazırlamak için 100 μL stokta konsantrasyon (1 mg/mL) ile 1X PBS 'den 9.900 μL 'ye eklenerek hazırlayın. Hoechst 33342 çözeltisi birkaç ay boyunca 4 °C ' de depolanabilir.

5. numune işleme: hipotonik şişme, fikrasyon, hücre sayımı ve etiketleme DNA içeriği

1. İyileşme döneminin sonunda, tüm flsorlarının kuluçkanından çıkarın ve tüm numuneleri 15 mL polipropilen tüplere aktarın. 8 dakika boyunca 200 x g 'de tüm numuneleri Santrifüjü
2. Supernatant aspirate, hücreleri pelletini ve 5 ml 75 mm KCL. Mix hafifçe inversiyon tarafından üç kez ekleyin ve 7 dk için 4 °c ' de kulkarmak.
3. Her örneğe 2 mL% 4 formalin ekleyin, üç kez inversiyon ile hafifçe karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 °C ' de inküyeyin. Bu adım "yumuşak sabitleme" olarak davranır.
4. 8 dakika boyunca 200 x g 'de tüm numuneler Santrifüjü 20 dakika boyunca 100 μL% 4 formalin içinde süper natant ve pelletini aspirate. Bu adım "sert sabitleme" olarak davranır.
5. 5 ml yıkama tamponu ekleyin ve 200 x g 'de santrifüjün 8 dk. içinde süpernatant ve pelletini, 100 μL yıkama tamponu içinde aspirate.
6. Tüm numuneleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarın.
7. Her örnek için bir hücre sayısı, örnek başına hücre sayısını belirlemek için gerçekleştirin. Numuneler, 1x PBS 'de 1:100 seyreltme (990 μL 'de PBS 'de 10 μL) büyük olasılıkla doğru bir sayım elde etmek için gerekli olacak şekilde konsantre edilecektir.
   Not: Bu noktada bir hemocytometer kullanarak hücre sayar gerçekleştirmek için en iyisidir. KCl ekleme sitoplazmayı saydam bir görünüm verir, otomatik hücre sayaçları onları tanımak için zor hale. Ayrıca, otomatik sayaçların boyutları nedeniyle polinükleated hücreler Puanlama zorluk vardır.
8. Numuneleri MıC 'de hemen çalıştırıyorsanız, birkaç gün boyunca 4 °C ' de depolanabilir. Örnekleri çalıştırmaya hazır olduğunda, her bir örneğe 1x10⁶ hücreler/ml başına 5 μl 100 μg/ml ekleyin. Ayrıca 50 μg/mL 'Lik son konsantrasyon için 100 μL örnek başına 10 μL 500 μg/mL RNase ekleyin. Numuneleri 37 °C ' de,% 5 CO₂ ' de 30 dakika süreyle inkulat.
9. Mikro-santrifüjün tüm numuneleri 200 x g 'de 8 dakika boyunca kullanılır ve ~ 30 μL bırakarak süpernatant kaldırmak için bir pipet kullanın. MIC üzerinde çalıştırmadan önce tüm örnekleri pelletini için bir pipet kullanın tüpte hiçbir kabarcıklar sağlamak. Değil Vortex.

6. MIFC 'nin başlatılması ve kalibre edilmesi

1. Kılıf, Sistem kalibrasyon reaktif, debubbler, temizleyici ve Sterilizatör konteynerlerinin dolu ve atık tankı boş olduğundan emin olun. Sistemi güç ve MIFC yazılım simgesine çift tıklayın. Başlangıç düğmesini tıklatın ve Tüm kalibrasyonları ve Testleri Başlat onay kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Bu sistem, yük kılıf ve sistem kalibrasyon reaktifleri Flush ve sistemi kalibre ( malzeme tablosubakın).

7. MıC örnekleri çalışan

Not: Bu bölüm 2 fotoğraf makinesi MIFC kullanımını varsayar. 1 fotoğraf makinesi MIFC kullanıyorsanız, lütfen ek 1-tam protokol, Bölüm 7 satın alma sırasında grafiklerinin oluşturulması için bkz

1. MıC veri edinme yazılımını başlatın (bkz . malzeme tablosu). Şekil 1 , enstrüman ayarlarını gösterir. 405 nm lazeri açın ve lazer gücünü 10 mW (A) olarak ayarlayın. Devre dışı tüm diğer lazerler (SSC dahil) ve Kanallar 1 ve 9 (B) için BF ayarlayın. Büyütme kaydırıcının 60x (C) olarak ayarlandığını, yüksek hassasiyetli mod seçili (D) olduğunu ve yalnızca 1, 7 ve 9 kanalının görüntü galerisinde gösterildiğini onaylayın.
2. Scatterplot simgesine tıklayın. Tüm popülasyon seçin ve Y ekseni üzerinde X ekseni ve en boy oranı M01 alan M01 seçin. Kare bölge simgesine tıklayın ve tek hücrelerin etrafında bir bölge çizin. Bu bölge tek hücrelerolarak adlandırın. Sağ arsa üzerine tıklayın ve bölgelerseçin. Tek hücreler bölgesini vurgulayın ve x koordinatlarını 100 ve 900 olarak değiştirin ve y koordinatlarını 0,75 ve 1 (Şekil 1I) olarak değiştirin.
3. Scatterplot simgesine tıklayın. Üst popülasyon olarak tek hücreler 'i seçin, X ekseni üzerinde gradyan RMS M01 ve Y EKSENI üzerindeki gradyan RMS m07 öğesini seçin. Kare bölge simgesine tıklayın ve hücrelerin çoğunluğu etrafında bir bölge çizin. Bu bölgeye odaklanmış hücreleradı. Sağ arsa üzerine tıklayın ve bölgelerseçin. Odaklanan hücreler bölgesini vurgulayın ve x koordinatlarını 55 ve 75 olarak değiştirin ve y koordinatlarını 9,5 ve 20 (Şekil 1J) olarak değiştirin.
4. Histogram simgesine tıklayın. Odaklanmış hücreler popülasyon seçin ve özellik olarak yoğunluk m07 seçin. Doğrusal bölge simgesine tıklayın ve histogram içinde ana zirve genelinde bir bölge çizin. Bu bölgeyi DNA-pozitifolarak adlandırın. Sağ arsa üzerine tıklayın ve bölgelerseçin. DNA pozitif bölgeyi vurgulayın ve koordinatları 2 x 10⁵ ve 2 x 10⁶olarak değiştirin. Aralık, histogram üzerindeki yoğunluk zirvesine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir (Şekil 1K).
5. Edinme parametrelerini ayarlayın (Şekil 1E). Dosya adını ve hedef klasörü belirtin, 20.000 için olayların sayısını değiştirmek ve DNA pozitif popülasyon seçin.
6. Yükle (Şekil 1F) seçeneğini tıklatın ve denetim örneğini mifc 'ye yerleştirin. Verileri toplamak için edinme düğmesini tıklatın (Şekil 1G). Alım tamamlandıktan sonra, örneği döndürmek için Return düğmesine tıklayın (Şekil 1H). Örnek tüpü enstrümandan çıkarın. Denemede kalan tüm örnekler için bu işlemi yineleyin.

8. ıDEAS 'da bir veri dosyası açma

1. MıC analiz yazılım paketini başlatın ( malzeme tablosunabakın). Açık dosya Sihirbazı'nı başlatmak Için çözümleme Başlat 'ı tıklatın. İstenen RAW görüntü dosyasına (. rif) göz atarak bir veri dosyası seçin. Aç düğmesini tıklatın ve İleri'yi tıklatın.
2. Bu tek bir renk tahlil olduğundan, tazminat gerekli değildir bu yüzden tazminat adımını atlamak için İleri 'yi tıklatın. Bu aşamada uygulamak için hiçbir analiz şablonu yok, bu yüzden İleri tekrar 'ı tıklatın. Analiz şablonu tamamlayıcı malzemeye indirildiğinde, şimdi seçin. Bu şablonlar sadece BF ile 2 kamera MIFC kanalları 1 ve 9 ve Kanal 7 satın alma sırasında nükleer görüntüleri ayarlamak ile çalışır.
3. Varsayılan olarak,. cif ve. DAF dosya adları. rif ile eşleşecek şekilde otomatik olarak oluşturulur. . Cif ve. DAF adlarının değiştirilmesi önerilmez. İleri'yi tıklatın. 01 ve 07seçerek görüntü görüntüleme özelliklerini ayarlayın. İleri'yi tıklatın. Bu uygulama için sihirbaz yoktur, bu nedenle son 'utıklatın. Veri çözümleme dosyasını (. DAF) ve analiz şablonunu (. AST) genellikle 9 – 14 bölümlerde ilerleme kaybını önlemek için kaydetmek çok önemlidir.

9. BNCs tanımlamak için maskeler ve özellikler oluşturma

1. Resim galerisi özellikleri simgesine (mavi/beyaz simge) tıklayın. Görüntü özellikleri sekmesinde aralığı piksel verilerine ayarla 'yı tıklatın, sonra rengi sarı olarak değiştirin. Tamam'ı tıklatın. Hoechst görüntüleri şimdi siyah arka plan karşı görüntülemek için daha kolaydır.
2. Olmayan-apoptotik hücreler Plot oluşturun.
   1. Analiz sekmesine tıklayın, ardından maskeler'e tıklayın. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. Altında işlevi seçin eşik, altında maske seçin m07 ve yoğunluk yüzdesini ayarlamak 50. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın. Kapat'ı tıklatın.
   2. Analiz sekmesine tıklayın, Özellikler'e tıklayın, ardından Yeni'ye tıklayın. Özellik türü seçin alanıiçin. Maske için eşik seçin (m07, Ch07, 50). Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Özellik değerlerini hesaplamaya başlamak için Kapat 'ı tıklatın.
   3. Nokta çizimi simgesine tıklayın. Tüm popülasyon 'ı seçin. X ekseni özelliği için Contrast_M01_Ch01 özelliğini seçin ve Y ekseni özelliği için Area_Threshold (m07, Ch07, 50)seçeneğini belirleyin. Tamam'ı tıklatın.
   4. Kare bölge düğmesini tıklatın ve hücrelerin çoğunluğu etrafında bir bölge çizin. Bu bölgeyi apoptotik olmayanara. Arsa üzerine sağ tıklayın ve bölgeler'i tıklayın. Apoptotik olmayan bölgeyi vurgulayın. X koordinatlarını 0 ve 15 olarak ayarlayın ve y koordinatlarını 50 ve 300 olarak ayarlayın. Kapat'ı tıklatın.
3. Yalnızca iki çekirdekleri içeren hücreleri tanımlamak için BNC maskesini (Steps 9.3.1-9.3.5) oluşturun.
   1. Resim galerisinde bir BNC için göz atın ve üzerine tıklayın. Bu Hoechst kanalda maske oluşturulması görselleştirmek için.
   2. Analiz sekmesine tıklayın, ardından maskeler'e tıklayın. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. İşlev altında LevelSetseçin, maske altında seçin m07, Orta düzey maskesi radyo düğmesini seçin ve kontur ayrıntı ölçeği 3,00 olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
   3. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. Altında işlev, seçin dilate, ve maske altında LevelSet seçin (m07, Ch07, orta, 3). Ch07için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın ve piksel sayısını 2 olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
   4. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. Altında fonksiyon seçin Watershed, ve maske altında seçin dilate (LevelSet (m07, Ch07, orta, 3) 2). Ch07için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın ve satır kalınlığını 1 olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
   5. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. Fonksiyon altında Aralıkseçin, maske altında Watershed seçin (dilate (LevelSet (m07, Ch07, orta, 3) 2)). Ch07için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın. Minimum ve maksimum alan değerleri için 115 ve 5000, sırasıyla ayarlayın. Minimum ve maksimum en boy oranı değerleri 0,4 ve 1, sırasıyla ayarlayın. Tamam 'ı tıklatın . Ad alanında BNC okumak Için metni değiştirin sonra Tamam'ı tıklatın.
4. Son BNC nüfus elde etmek için özellikleri ve çizimleri oluşturun
   1. Spot Count BNC özelliği: analiz sekmesine tıklayın, sonra Özellikler, sonra Yeni. Özellik türü Için nokta sayımıseçin. Maskeiçin, 9.3.5 'de oluşturulan son BNC maskesini seçin. Bağlanılmayı dörde ayarlayın ve adı nokta sayısı BNColarak değiştirin. Özellik değerlerini hesaplamak için Tamam 'ı tıklatın.
   2. Spot Count BNC histogram. Histogram simgesini tıklatın. Üst nüfus olarak apoptotik olmayan seçin. X ekseni özelliği Için spot Count BNC özelliğini seçin. Tamam'ı tıklatın. Doğrusal bölge simgesine tıklayın. Depo gözü 2arasında bir bölge çizin. Bu bölge 2nçağırın.
      Not: son BNC nüfus tanımlamak için kalan maskeler, Özellikler ve çizimleri oluşturmak için ek 1-tam protokol Bölüm 9 bakın

10. BNC nüfusu içinde MN tanımlamak için maskeler ve özellikler oluşturma

1. MN maskesi oluşturun. Resim galerisinde bir MN içeren ve üzerine tıklayın bir BNC için göz atın. Bu Hoechst kanalda MN maskesi oluşturulması görselleştirmek için. Analiz sekmesine tıklayın, ardından maskeler'e tıklayın.
   1. Spot tanımlama maskesi 1 oluştur:
      1. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. İşlev altında spot seçin ve parlak radyo düğmesinin seçildiğinden emin olun. Maske altında m07seçin, nokta hücre arka plan oranı için 2,00olarak ayarlayın. Minimum yarıçapı 2 ' ye ve en fazla yarıçapa 6olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
      2. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. Altında Işlev aralığıseçin ve maske altında LevelSet seçin (m07, Ch07, orta, 3). Ch07Için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın. Minimum ve maksimum alanı 80 ve 5000, sırasıyla ayarlayın. Minimum ve maksimum en boy oranı sırasıyla 0 ve 1 olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
      3. Tıklayın Yeni sonra işlevitıklatın. İşlev altında dilateseçin, maske altında aralığı seçin (LevelSet (m07, Ch07, Middle, 3), 80-5000, 0-1). Ch07Için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın. Piksel sayısını 2olarak ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
      4. Yeni'yi tıklatın. Çift tıklayın spot (m07, Ch07, parlak, 2, 6, 2) maske tanımına eklemek için maske. ' I tıklatın ve işleci ve sonra değil işleci. Çift tıklatın dilate (Range (LevelSet (m07, Ch07, orta, 3), 80-5000, 0-1), 2) maskesi eklemek için maske tanımı. Tamam'ı tıklatın.
      5. Tıklatın Yeni, sonra işlev. Altında Işlev aralığı seçin ve maske altında oluşturulan maske seçin 10.1.1.4:
         1. Spot (m07, Ch07, parlak, 2, 6, 2) seçin ve dilate değil (Range (LevelSet (m07, Ch07, orta, 3), 80-5000, 0-1), 2).
         2. Görüntüyü Ch07için görüntüle olarak ayarlayın. Minimum ve maksimum alanı 10 ve 80, sırasıyla ayarlayın. Minimum ve maksimum en boy oranı 0,4 ve 1 için sırasıyla ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın. Spot tanımlama maskesi 1 tamamlandı.
            Not: son MN nüfus tanımlamak için maskeler, Özellikler ve çizimleri oluşturmak için ek 1-tam protokol 10 bölümüne bakın

11. Mononükleated ve Polinükleated nüfus tanımlamak için maskeler, Özellikler ve çizimler oluşturun

1. POLY maskesi oluşturun. Tıklayın analiz, sonra maskeler, sonra Yeni işlev. Altında işlevi seçin aralığı, altında maske seçin Watershed (dilate (LevelSet (m07, Ch07, orta, 3), 2)). Ch07için görüntülenecek görüntüyü ayarlayın. Minimum ve maksimum alan değerlerini 135 ve 5000 için sırasıyla ayarlayın. Minimum ve maksimum en boy oranı değerlerini 0,4 ve sırasıyla 1 olarak ayarlayın. Tamam'ı tıklatın. Adı alanında, Poly sonra ok sonra Kapat'ı tıklatın okumak için metni değiştirin. Polinükleated hücre maskesi tamamlandı.
2. POLY bileşen maskeleri oluşturun.
   1. POLY bileşen maskesi 1: analiz sekmesine tıklayın, sonra maskeler, sonra Yeni, sonra işlev. İşlev altında bileşeniseçin ve maske altında poli Mask seçin. Sıralamada Özellik seçme alanıiçin ve sıralama düzeni için azalan radyo düğmesini tıklatın. Rütbe 1' e ayarlayın. Tamam sonra tekrar Tamam ' ı tıklatın.
   2. POLY bileşen maskeleri 2, 3 ve 4:11.2.1 içindeki tüm adımları yineleyin, ayrı bileşen maskeleri oluşturmak için 2, 3 ve 4 ' e ayarlayın.
3. POLI maske kullanarak spot Count.
   1. Analiz sekmesini, ardından Özellikler'i, ardından Yeni'yi tıklatın. Özellik türüIçin spot sayısı'nı seçin. Maske için poli maske seçin ve 4' teki bağlanılma ayarlayın. Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın ve sonra özellik değerlerini hesaplamak için Tamam 'ı tıklatın.
   2. Histogram simgesini tıklatın. Apoptotik olmayan nüfus seçin. X ekseni özelliği Için spot Count_POLY_4 özelliğini seçin.
   3. MONO spot sayım bölgesi. Doğrusal bölge simgesine tıklayın. 11.3.2 içinde oluşturulan histogram üzerinde depo gözü 1 arasında bir bölge çizin. Bu bölge 1nçağırın.
   4. ÜÇ nokta sayımı bölge. Doğrusal bölge simgesine tıklayın. 11.3.2 içinde oluşturulan histogram üzerinde depo gözü 3 arasında bir bölge çizin. Bu bölgeyi 3Nolarak arayın.
   5. QUAD MONO nokta sayımı bölge. Doğrusal bölge simgesine tıklayın. 11.3.2 içinde oluşturulan histogram üzerinde depo gözü 4 arasında bir bölge çizin. Bu bölge 4Nçağırın.
4. MONO popülasyon tanımlayın.
   1. MONO en boy oranı özelliğini oluşturun. Analiz sekmesini, ardından Özellikler'i, ardından Yeni'yi tıklatın. Özellik türüaltında en boy oranı özelliğini seçin ve maske seçin bileşeni (1, alan, Poly, azalan)altında. Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın sonra Tamam'ı tıklatın.
   2. MONO Döngülerlik özelliğini oluşturun. Özellik Yöneticisi penceresi hala açıksa, Yeni'yi tıklatın. Özellik türüaltında, döngülerlik özelliğini seçin ve maske seçin bileşeni (1, alan, Poly, azalan)altında. Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın sonra Tamam 'ı tıklatın sonra özellik değerlerini hesaplamak için Kapat 'ı tıklatın.
   3. Dairesel MONO hücreler nokta çizimi için nokta çizimi simgesini tıklatın. Üst popülasyon olarak 1n seçin. X ekseni özelliği için Circularity_Component (1, alan, Poly, azalan) seçin ve Y ekseni özelliği için Aspect RATIO_COMPONENT seçin (1, alan, Poly, azalan). Tamam'ı tıklatın. Kare bölge düğmesini tıklatın ve hücrenin sağ üst kısmına doğru hücre popülasyon etrafında bir bölge çizin. Bu bölgeyi Circular_1Nolarak adlandırın. Arsa üzerine sağ tıklayın ve bölgeler'i tıklayın. Circular_1N bölgesini vurgulayın. X koordinatlarını 20 ve 55 olarak değiştirin ve Y koordinatlarını 0,85 ve 1,0 olarak değiştirin. Kapat'ı tıklatın.
   4. Alan POLY/Area_M07 özelliğini oluşturun. Analiz sekmesini, ardından Özellikler'i, ardından Yeni'yi tıklatın. Özellik türüaltında, alan özelliğini seçin ve maske altında bileşen SEÇIN (1, alan, Poli, azalan). Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın sonra Tamam'ı tıklatın.
   5. Özellik Yöneticisi penceresi hala açıkken, Yeni 'yi tıklatın sonra özellik türü altında birleştirilmiş radyo düğmesini tıklatın. Özellikler listesinden Area_Component (1, Area, Poly, Descending) vurgulayın ve özellik tanımına eklemek için aşağı oka tıklayın. Bölme sembolünü (/) tıklatın. Area_M07 özelliğini seçin ve özellik tanımına eklemek için aşağı oku tıklatın. Varsayılan adı ayarla 'yı tıklatın ve Tamam'ı tıklatın. Özellik değerlerini hesaplamaya başlamak için Kapat 'ı tıklatın.
   6. Son MONO nüfus nokta çizimi için nokta çizimi simgesini tıklatın. Üst popülasyon olarak Circular_1N seçin. X ekseni özelliği Için Aspect Ratio_M07 seçin ve Y ekseni özelliği için Area_Component (1, alan, Poly, azalan)/Area_M07seçin. Tamam'ı tıklatın. Kare bölge düğmesini tıklatın ve hücrelerin çoğunluğu etrafında bir bölge çizin. Bu bölgeyi Mononucleatedolarak adlandırın. Arsa üzerine sağ tıklayın ve bölgeler'i tıklayın. Mononucleated bölgesini vurgulayın. X koordinatlarını 0,85 ve 1,0 olarak değiştirin ve Y koordinatlarını 0,55 ve 1,0 olarak değiştirin. Kapat'ı tıklatın.
      Not: son trinükleated ve polinükleated nüfus tanımlamak için maskeler, Özellikler ve çizimler oluşturmak için ek 1-tam protokol 11 bölümüne bakın.

12. BNC ve MN maskeleri incelemek için özel bir görünüm oluşturun

1. Tıklayın resim galerisi özellikleri düğmesini sonra tıklayın Görünüm sekmesi. kompozitler sekmesine tıklayın ve ardından Yeni'ye tıklayın. Ad türü CH01/Ch07altında. Resim Ekle 'yi tıklatın. Altında resim CH01 seçin ve yüzde 100 için ayarlayın. Tıklayın resim Ekle yeniden, altında resim seçin Ch07 ve yüzde 100 için ayarlayın.
2. Yeni 'yi tıklatın ve ad türü BNC ve mn maskeleri altında
3. Sütun Ekle'yi tıklatın. Resim türü altında CH01 seçin ve maske altında hiçbiri seçin
4. Sütun Ekle'yi tıklatın. Resim türü altında Ch07 seçin ve maske altında hiçbiri seçin
5. Sütun Ekle'yi tıklatın. Resim türü altında Ch07 seçin ve maske altında BNC seçin
6. Sütun Ekle'yi tıklatın. Resim türü altında Ch07 seçin ve maske altında MN maskesi seçin
7. Sütun Ekle'yi tıklatın. Resim türü altında bileşik radyo düğmesini tıklatın. CH01/Ch07 bileşik görüntü görünüme otomatik olarak eklenmelidir. Resim galerisi Özellikler penceresini kapatmak için Tamam 'ı tıklatın.

13. POLY maskesini incelemek için özel bir görünüm oluşturun

1. POLY maskesi incelemek için özel bir görünüm oluşturmak için ek 1-tam protokol Bölüm 13 bakın

14. anahtar olayları numaralandırmak için bir istatistik tablosu oluşturma

1. Raporlar sekmesine tıklayın, ardından istatistik raporunu tanımla'ya tıklayın. Yeni pencerede sütunEkle 'yi tıklatın.
2. BNC Count istatistik ekleyin. Istatistiklerin altında Count seçin ve Seçili nüfus altında bncs nüfus seçin. İstatistiği listeye eklemek için Istatistik Ekle 'yi tıklatın.
3. MN BNCs, mono, TRI ve POLY nüfus için ayrı sütunlar oluşturmak için 14,2 adım yineleyin. Kapat 'ı tıklatın ve Tamam'ı tıklatın.
4. Veri çözümleme şablonu tamamlandı (Şekil 2). Şablonu kaydedin (dosya, şablon olarak Kaydet). Tam maske listesi ek 2-maske listesindebulunabilir.

15. veri çözümleme şablonunu kullanarak toplu işlem deneme dosyaları

1. Altında Araçlar menüsünde tıklatın toplu iş veri dosyaları sonra tıklatın toplu Ekle yeni pencerede.
2. Yeni pencerede, toplu iş eklemek için deneme dosyalarını (. rif) seçmek için Dosya Ekle 'yi tıklatın. Altında bir şablon veya veri çözümleme dosyası (. AST,. DAF) seçeneğini seçin , göz atın ve 14,4 adımda kaydedilmiş veri çözümleme şablonu (. ast dosyası) açmak için açık klasör simgesini tıklatın.
3. İstatistik tablosunu önizlemek için Istatistik raporunu önizleme düğmesini tıklatın. Henüz hesaplanmamış olduğundan, burada hiçbir değer görüntülenmez. Ancak, bu adım, toplu işlemi çalıştırmadan önce uygun çözümleme şablonunun seçildiğinden emin olmak için bir denetim görevi görür.
4. Geçerli pencereyi kapatmak için Tamam 'ı tıklatın. Sonra tüm dosyaların toplu işleme başlatmak için toplu Işlemleri gönder 'i tıklatın.
5. Toplu işlem tamamlandığında, bir. txt dosyası tüm. rif dosyalarının bulunduğu klasörde kullanılabilir. Genotoksisite ve sitotoksisite hesaplamak için bu istatistikleri kullanın.

16. genotoksisite ve sitotoksisite parametrelerinin hesaplanması

1. Genotoksisite hesaplanması: genotoksisite hesaplamak Için, 15,5 yılında oluşturulan istatistik tablosunu kullanın. MN BNCs popülasyonunda hücrelerin sayısını BNCs popülasyonunda hücre sayısına bölerek 100 tarafından çarpın:
   
2. Sitotoksisite hesaplanması: TRI ve QUAD hücrelerinin sayısını toplayarak POLY hücrelerinin toplam sayısını belirleyin.
   1. Sitokinesis-Block proliferasyon Indeksi (CBPı) MONO, BNCs ve POLY hücre sayısını kullanarak hesaplayın aşağıdaki gibidir:
      
   2. Son olarak, her kültürün sitotoksisitesi denetim kültürlerinden (C) CBPı değerlerini kullanarak ve kimyasal olarak maruz Kültür (T) aşağıdaki gibi hesaplayın:
      

Bu yazıda özetlenen analiz yöntemi, genotoksisite hesaplamak için ve MN olmadan, BNCs otomatik kimlik ve Puanlama için izin verir. Buna ek olarak, MONO ve POLY hücreler de otomatik olarak tanımlanır ve sitotoksisite hesaplamak için attı. Yayımlanan puanlama kriterleri^6,34 bu olayların mifc veri analiz yazılımında uygulanmakta olduğu zaman buna uymak zorundadır. Burada sunulan sonuçlar, artan sitotoksisite ile MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışların, insan lenfoblastoid TK6 hücrelerinin iyi bilinen MN İndükleme kimyasallara (Mitomycin C ve colchicine) maruz kalmasıyla algılandığını göstermektedir. Test ek kimyasallar için benzer sonuçlar ayrı bir yayın³²gösterildi. Buna ek olarak, mannitol kullanımı sonucu olmayan-MN inducing kimyasallar da doğru burada özetlenen MIFC yöntemi kullanılarak tespit edilebilir gösterir. Tüm maskeler, Özellikler ve bölge sınırları oluşturmak için protokolde açıklanan parametreler büyük olasılıkla farklı hücre türleri (örneğin Çince hamster hücreleri) tahlil gerçekleştirmek için kullanıldığında ayarlanması gerekecektir.

Şekil 3 , bncs (Şekil 3A-3D) tanımlamak için seçilen dört paneli gösterir. Burada gösterilen iki çekirdekler (şekil3A) ve benzer döngü (Şekil 3B), benzer Alanlar ve yoğunluklarla bncs seçimi sağlayan iki değişkenli çizimleri ile hücrelerin seçimi sağlayan bir histogram olduğunu (şekil3C ) ve bncs iyi ayrılmış, çakışan olmayan çekirdekler (Şekil 3D) Puanlama ölçütünü^6,34başına olarak. Şekil 3 E BF ve Hoechst görüntüleri yanı sıra BNC ve mn maskeleri tek veya bırden fazla MN Ile bncs tespit edilebilir ve numaralandırılmış gösteren gösterir. Bu, genotoksisite son BNC nüfusunun mikronükleated BNCs oranını belirleyerek hesaplanmasına olanak sağlar. Şekil 4 mono, TRI ve Quad hücrelerini tanımlamak için Poly maskesini kullanarak spot sayım özelliğinin uygulamasını gösterir. TRI ve QUAD hücrelerinin sayısı sonra POLY hücrelerinin son sayısını elde etmek için toplanır (Tablo 1). Bu, sitotoksisite protokolde gösterilen formül kullanılarak hesaplanmasını sağlar. Bu nedenle, denemede her doz noktası genotoksisite ve sitotoksisite parametreleri ile değerlendirilebilir.

Şekil 5 Aneugen colchicine için genotoksisite ve sitotoksisite değerlerini gösterir, clastogen mitomisin C ve negatif bir kontrol Için, mannitol. Colchicine için (Şekil 5A) 0,02 ile 0,05 μg/ml dozlar, MN frekansında istatistiksel olarak anlamlı artışlar üretilerek,% 1,28 ile% 2,44 arasında değişen Solvent kontrolü (Tablo 1). Mitomisin C (Şekil 5B) durumunda, 0,4 ve 0,5 μg/ml 'lik iki üst doz, solvent kontrolleri ile KARŞıLAŞTıRıLDıĞıNDA istatistiksel olarak anlamlı MN frekansları üretti. Bu MN frekansları 0,4 μg/mL 'de% 0,93, 0,5 μg/mL 'de% 1,02 (Tablo 2) idi. Son olarak, mannitol için (Şekil 5C), hiçbir doz test% 30 üzerinde bir sitotoksisite neden, ne de onlar beklendiği gibi, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında MN frekansında önemli artışlar üretti (Tablo 3).

Şekil 1 : Mifc enstrüman ayarları. Protokolün 7. adımda açıklandığı gibi MIFC ayarlarının bir ekran görüntüsü. (A) 405 nm lazer gücünü 10 MW 'a ayarlama. (B) BF kanallarını 1 ve 9 olarak ayarlama. (C) 60x büyütme objektif objektifin seçilmesi. (D) en yüksek çözünürlükte görüntü üreten en yavaş akış hızını seçme. (E) 20.000 için toplanan olayların sayısını belirtme. (F) yükleme düğmesini tıklatarak örnek yükleme işlemine başlayabilirsiniz. (G) görüntüleri almaya başlamak için edinme düğmesine tıklamak. (H) herhangi bir kullanılmayan örnek döndürmek için Return düğmesini tıklatın. (I) tek hücrelerin seçilmesi Için BF alanı 'NA karşı KF en boy oranı 'nın dağılıdır. (J) odaklanmış hücrelerin seçilmesi Için Hoechst gradyan RMS 'Nin BF degrade RMS 'ye karşı bir çizim. (K) DNA pozitif hücrelerin seçilmesi Için Hoechst yoğunluğu histogram. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 2 : Analiz yazılımı gating stratejisi. Protokol Bölüm 9 ' da açıklanan gating stratejisinin bir ekran görüntüsü. Bölgeler, binükleated hücrelerin (kırmızı kutu), mikronüklei (sarı kutu) ve mono-ve polinükleated hücreler (mavi kutu) tanımlaması için sıralı olarak gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 3 : MN ile ve olmadan BNCs tanımlaması ve skorlama. (A) iki farklı çekirdekleri olan hücrelerin seçimi. (B) en boy oranı yoğunluğu özelliğinin kullanımı ile iki yüksek dairesel çekirdekleri olan binükleated hücrelerin (bncs) tanımlaması. (C) benzer Alanlar ve yoğunluklarla çekirdekleri olan bncs seçimi. Bu her iki çekirdeklerin alan oranı ve her iki çekirdeklerin en boy oranı oranını hesaplamak tarafından gerçekleştirilir. (D) iki iyi ayrılmış çekirdekleri olan bncs tanımlamak Için şekil oranı ve en boy oranı özellikleri kullanımı. (E) tek veya birden fazla MN ile bncs tespit ve numaralandırılabilir gösteren Mikronukleus (MN) maskesi kullanarak spot sayım özelliği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 4 : Mono ve Poly hücrelerinin tanımlanması ve Puanlama. Mono, Tri ve quadranucleated hücreleri tanımlamak ve numaralandırmak için spot sayımı özelliğinin kullanımı. Bileşen maskesi 1, mononükleated hücrelerin tanımlanması (üst görüntü) sağlar. 1 ile 3 arasındaki bileşen maskeleri, trinükleated hücrelerin (orta görüntü) tanımlanması sağlar. 1 ile 4 arasındaki bileşen maskeleri quadranucleated hücrelerin (alt görüntü) tanımlanması sağlar. Bu rakam Rodrigues 2018³²güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Şekil 5 : Sitotoksisitenin ölçülmesini. Sitotoksisite, (a) kolşisin, (B) Mitomycin C ve (a) için 3 saat pozlama ve 24 saat iyileşme sonrasında MN (açık çubuklar) yüzdesi kullanılarak nicelendirme (siyah daireler) ve genotoksisite ile cytotoksiyon ile ölçülebilir. C) mannitol. Kontrol ile karşılaştırıldığında MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışlar yıldızlar (Chi-squared test; *p < 0,05, * *p < 0,01, * * *p < 0,001) ile belirtilir. Tüm miktarlar her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır. Bu rakam Rodrigues 2018³²güncellenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Sitotoksisite (mono-, bi-ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (mikronükleated binükleated hücrelerin sayısı ve yüzdesi) colchicine için hesaplamak için gerekli parametreler. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.

Tablo 2: To parametreler sitotoksisite hesaplamak için gerekli (mono-, iki-ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (sayı ve mikronükleated binükleated hücrelerin yüzdesi) mitomisin C için. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.

Tablo 3: Mannitol için sitotoksisite (mono-, iki ve polinükleated hücrelerin sayısı) ve genotoksisite (mikronükleated binükleated hücrelerin sayısı ve yüzdesi) hesaplamak için gerekli parametreler. Tüm hesaplanan miktarlarda her doz noktasında iki çoğaltır ortalamasıdır.

Ek 1: tam protokol. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Ek 2: maske listesi. Bu dosyayı indirmek Için lütfen buraya tıklayın.

Son yayınında Verma ve al. akış sitometrisinin yüksek verimlilik avantajı ile görüntü analizi³⁵veri ve görüntü depolama yararları birleştiren bir sistem geliştirme önemini vurguladı. Bu yazıda açıklanan MIFC in vitro MN tahlil bu tırnak karşılar ve mikroskobik ve akış sitometri yöntemlerinde yukarıda bahsedilen zorlukların çoğunu aşmak için potansiyele sahiptir. Burada açıklanan protokol, her iki sitotoksisite ve genotoksisite MIFC kullanılarak değerlendirilebilir gösterir. Numune hazırlama, hücresel boyama ve veri toplama basit ancak her zaman uygulanması gereken protokolde bazı kritik adımlar vardır. Hücrelere potasyum klorür (KCl) ilavesi, hücreleri şişmeye, ana çekirdekler arasında ayrılık yaratan öneme sahiptir. Bu maskeleme algoritması BNCs ve POLY hücreler (POLY hücreler) kendi numaralandırma için gerekli olan tüm bireysel çekirdekleri tanımlayabilir sağlar. Ayrıca, KCL doğru MN maskeleme ve quantitation için gerekli olan çekirdekler ve MN arasında ayrım sağlar. Ayrıca, KCL ilavesi sonrasında formalin kullanımı santrifüjleme sırasında hücrelerin parçalanması önler. Sitalasin B ilavesi, birden fazla nükleer bölünme geçirmiş TK6 hücrelere oldukça büyük olması neden olur. Sonuç olarak, sitoplazma kırılgan hale gelir ve santrifüjleme KCl eklendikten hemen sonra gerçekleştirilirse Lyse olabilir. Dahası, örnekdeki hücrelerin sayısına göre ve son konsantrasyona göre değil, örneklere Hoechst tanıtmak çok önemlidir. Örneğin, Hoechst 10 μg/ml son konsantrasyon eşit 1 x 10⁶ hücreli bir örnek leke olacak ama yeterli 5 x 10⁶ hücre içeren bir örnek leke olmayabilir ve loş lekeli çekirdekler ile birçok hücreye neden olabilir, analiz zor hale. Mifc 405 nm uyarma lazer veya DRAQ5 ile donatılmış ise Hoechst DAPı gibi başka bir DNA boya ile değiştirilebilir dikkat etmek de önemlidir MIFC 488 nm ve/veya 642nm uyarma lazer (ler) ile donatılmıştır. Nükleer leke değiştirirken, gerekli/istenen lazer gücü için uygun konsantrasyon bulmak için leke titrat için önemlidir.

MıC 'de veri topluyorsanız, gradyan RMS özellikleri için en uygun bölge sınırlarını belirlemek önemlidir. Bu protokolde sunulan sınırlar, MIFC aletleri arasındaki bazı hafif farklılıklar nedeniyle ayarlama gerektirebilir. Bu özelliğin veri toplama sırasında uygulanması, son derece odaklanmış görüntülerin yakalanmasını sağlamak için esastır. Veri dosyaları birçok bulanık veya odaksız görüntüler içeriyorsa, analiz yazılımındaki maskeleme algoritmaları yanlış pozitif eserler yüksek sayıda MN olarak puan önde gelen bulanık alanlarda boyama eserler hatalı vurgulamak olasıdır. Burada açıklanan görüntü işleme teknikleri zor olabilir rağmen, bir analiz şablonu MIFC yazılım geliştirilmiştir kez, toplu işlem veri dosyalarının otomatik olarak analiz edilmesini sağlar, kullanıcı müdahalesini ortadan kaldırmak ve bu nedenle, golcü Önyargı. Ayrıca, TK6 hücre dışındaki bir hücre çizgisi tahlil işlemini gerçekleştirmek için kullanılırsa, hücrelerin morfolojik özellikleri (örn. boyut) TK6 hücrelerden farklı olacak şekilde maskeler ve bölge sınırlarını değiştirmek gerekli olacaktır.

Burada sunulan sonuçlar (Şekil 5) Mitomycin C ve colchicine ÇEŞITLI dozlarda TK6 hücreleri AÇıĞA zaman MN indüksiyon istatistiksel olarak önemli artışları gösterir. Her iki kimyasallarda birkaç doz için solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında MN frekansında istatistiksel olarak önemli artışlar gözlenmiştir. Buna ek olarak, hiçbir doz mannitol üzerinde bir sitotoksisite indüklenen 30%, ne de MN frekansında istatistiksel olarak önemli bir artış zaman solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında, beklendiği gibi. In vitro MN tahlil gerçekleştirmek için MIFC kullanarak bu yazıda açıklanan protokol hem olumlu hem de negatif kontrol kimyasalları beklenen sonuçlar verir. Hem çözücü kontrolleri hem de negatif kontrol kimyasalları kullanarak, hem MN frekansının hem de sitokinez bloğu proliferasyon Indeksi (CBPı) temel değerleri geliştirmek için çok sayıda deney gerçekleştirmek çok önemlidir. Genotoksisite için, MN frekansında istatistiksel olarak önemli artış, kullanılan hücre tipi için tanınmış olması gereken temel MN frekanslarına kıyasla belirlenir. Ayrıca tüm sitotoksisite hesaplamaları, kontrol örneklerinin CBPı üzerine dayanır ve bu nedenle, MONO, BNCs ve POLY hücrelerinin temel oranları iyi kontroller nicelik olmalıdır.

Birkaç sınırlamalar ve mn tahlil bağlamında mifc kullanmanın avantajları önceki çalışma açıklanan^29,32. Ana sınırlamalar, mikroskopiye kıyasla düşük MN frekanslarını ilgilendiriyor, bu da analiz yazılımında Puanlama ölçütlerini ve MIFC alanının sınırlı derinliğini uygularken muhtemelen hem esnekliğin eksikliği sonucu oluşur. İyi konturlu maskeler doğru ana çekirdekler ama (veya çok yakın) ana çekirdekleri BNC maskesi içinde yakalanan olabilir dokunmadan MN tanımlamak için oluşturulabilir. Ayrıca, küçük eserler Puanlama önlemek için MN maskesi alan parametresi alt sınırı nedeniyle MıC kullanırken oldukça kolay mikroskobik kullanarak puan olabilir çok küçük MN muhtemelen yanlış cevapsız. Görüntü tabanlı veri analizinde mevcut zorluklara ek olarak, tasarım nedeniyle, MIFC üç boyutlu hücresel nesnelerin iki boyutlu projeksiyon görüntüleri alır. Bu muhtemelen bazı MN odak farklı bir derinlikte yakalanması neden iki ana MN, onları çok loş ve un-scorable maskeleme kullanarak görünmesini yapma. Dahası, MN küçük bir kısmı iki ana çekirdekleri birinin arkasında ikamet edebilir, onları imkansız görselleştirmek ve puan yapma. Bu nedenle, bu zorluklar göz önüne alındığında, düşük dozlarda MN frekansında önemli artışları yorumlarken dikkat kullanılmalıdır.

Bu eksiklikleri rağmen, MıC yöntemi burada açıklanan diğer teknikler üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor. Fenech ve ark. önerilen kriterler ve talimatlar MN için otomatik sistem ve metodolojileri geliştirirken dikkate alınmalıdır³⁶. Bunlar, ancak, ana çekirdekler ve Sitoplazmanın doğrudan görselleştirme, kimyasal veya Ajan test edilen çeşitli dozlarda MN sıklığı belirlenmesi ve morfoloji Nice ve yeteneği tüm konumunu belirlemek için sınırlı değildir çekirdekleri ve MN, Sitoplazmanın içinde olduklarından emin olmak için. Bu yazıda MıC yöntemi in vitro MN tahlil karşılayan (veya karşılamak için potansiyel sahip) bu kriterleri gerçekleştirmek için geliştirilen gösterir. Özellikle, Çekirdekler ve MN görüntüleri floresan lazerler tarafından yakalanabilir, ancak sitoplazmik görüntüler BF LED 'i kullanılarak elde edilebilir. Normal nükleer morfolojiye sahip hücrelerin görüntüleri, gelişmiş maskeler ve Özellikler kombinasyonu kullanılarak düzensiz morfolojiye sahip bu hücrelerden otomatik olarak ayırt edilebilir. Colchicine ve Mitomycin C (Şekil 5) için sunulan sonuçlar, her iki genotoksisite ve sitotoksisite, solvent kontrolleri ile karşılaştırıldığında çeşitli dozlarda değerlendirilebilir ve istatistiksel olarak önemli MN frekanslarının nerede gözlemlendiğini gösterir Beklenen. Ayrıca, OECD test Kılavuzu 487, sitotoksisite⁹' ı belirlemek için test konsantrasyonu başına en az 500 hücre ile birlikte genotoksisite belirlemek için MN varlığını değerlendirmek için test konsantrasyonu başına 2.000 bncs Puanlama önerir; Bu manuel microkopi kullanarak 1 h üzerinde alabilir. Protokol ve bu yazıda sonuçları yaklaşık 6.000 BNCs, 16.000 MONO hücreler ve 800 POLY hücrelerin ortalama yakalanan ve yaklaşık 20 dakika içinde test konsantrasyonu başına puan olduğunu göstermektedir. Veri edinme hızlı oranı ve aday hücrelerin yüksek sayıda böyle kısa bir zamanda attı In vitro MN tahlil gerçekleştirmek için MIFC istihdam başka önemli bir avantajı vurgulamak.

Bu yazıda sunulan sonuçlar teşvik ederken, onlar erken bir kavram kanıtı yönteminin temsilcisidir. Bu çalışma, daha kapsamlı bir araştırma tarafından takip edilmelidir daha geniş, daha çeşitli kimyasal set birden fazla sınıf ve mekanizmalar genotoksisite ve sitotoksisite bu gibi Kirkland ve ark tarafından önerilen gibi kapsar.³⁷ bu tür çalışmalar zaman alıcı ve emek yoğun, ve bu makalenin kapsamı dışında düşmek ancak, bu büyük ölçekli çalışmalar güvenilir zayıf genotoksisik ajanlar tanımlamak için yöntemin yeteneği içine değerli fikir verecektir. Burada sunulan metodoloji henüz daha büyük bir doz aralığında daha hızlı ve verimli tarama sağlayacak bir mikrowell biçimine, minyatürlenmiş olmamıştır. Böyle, mevcut formunda, MIFC tabanlı in vitro MN tahlil burada sunulan en iyi laboratuvar uygulamaları içine emek yoğun takip çalışmaları veya araştırma için uygun olabilir. Ancak, yöntem en iyi duruma getirilmeye devam edecek ve doğrulanır ve hücre oranını artıran aneugen pozlama gibi morfoloji ile ilgili kimyasal spesifik olayların saptanmasında artan esnekliğe izin verme potansiyeline sahiptir hala yanık³⁸olan dairesel olmayan çekirdekler. Son olarak, mifc yöntemi, MN indüksiyon mekanizmasının daha kapsamlı bir görünümünü sağlamak için MN tahlil (örneğin kinetochore boyama) içine ek biyolojik tanıtmak için bir fırsat sunar.

Yazar Luminex Corporation, bu çalışmanın kullanılan ImageStream multispektral görüntüleme akışı sitometresi yapımcısı tarafından istihdam edilmektedir.

Yazar sayesinde Christine Probst (Luminex Corporation) veri analizi şablonu önceki formları gelişmekte olan çabaları için, yanı sıra Dr Haley Pugsley (Luminex Corporation) ve Dr Phil Morrissey (Luminex Corporation) incelemek ve düzenlemek için El yazması.