Kabarcık sütun Photobioreactors ve bir tahlil yeşil mikroalg ekimi için nötr lipitler

Burada, laboratuvar ölçekli kabarcık sütun photobioreactors oluşturmak ve onları kültür mikroalg için kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca kültür büyüme oranı ve tarafsız lipid içeriğin belirlenmesi için bir yöntem sağlar.

Mikroalg üretim Biyoyakıt, yüksek değerli ürünler, gibi mühendislik uygulamaları için ve atıkları tedavisi için çalışmanın önemli ilgi vardır. En yeni araştırma çabalarının laboratuvar ölçekte başladığınızda, tekrarlanabilir bir şekilde mikroalg kültür için uygun maliyetli yöntemler için bir ihtiyaç vardır. Burada, biz kültür mikroalg laboratuvar ölçekli photobioreactors ve büyüme ve tarafsız lipid içeriğin bu alg ölçmek için etkili bir yaklaşım iletişim. Yönergeler de photobioreactor sistemi kurmak nasıl yer almaktadır. Örnek organizmalar Chlorella ve Auxenochlorellatür olmakla birlikte, bu sistem mikroalg yosun sigara-alg türleri ile ortak kültürleri de dahil olmak üzere, çok çeşitli yetiştirmek için adapte edilebilir. Hisse senedi kültürler ilk inoculum photobioreactor sistemi için üretmek şişelerde yetiştirilmektedir. Yosun inoculum konsantre ve photobioreactors ekimi toplu modunda aktarılır. Örnekleri her gün optik yoğunluk okumaları için toplanır. Toplu iş kültür sonunda hücreleri tarafından yıkanmış, santrifüj, hasat ve son Kuru ağırlık konsantrasyonu elde etmek için kuru dondurma. Son Kuru ağırlık konsantrasyon optik yoğunluk ve Kuru ağırlık konsantrasyonu arasında bir ilişki oluşturmak için kullanılır. Değiştirilmiş Folch yöntemi daha sonra toplam lipidler dondurularak biyokütle ayıklamak için kullanılır ve özü Mikroplaka tahlil kullanarak tarafsız lipid içeriğini denetlesinler. Bu tahlil daha önce yayımlandı, ancak protokol adımları burada kritik hataları sık sık oluştuğu yordamın adımlarını vurgulamak için dahil edildi. Burada açıklanan biyoreaktör sistemi basit şişesi yetiştirme ve ticari Biyoreaktörler tam kontrollü arasında bir niş doldurur. Hatta sadece 3-4 biyolojik ile tedavi çoğaltır, yosun kültür bizim yaklaşım büyüme ve lipid deneyleri sıkı standart sapmaları yol açar.

Mikroalg Mühendisliği ve Biyoteknoloji Uygulama son yıllarda büyük ilgi çekti. Mikroalg okudu kullanılmak üzere Atıksu Arıtma^1,2,3,4, biyoyakıt üretimi^5,6,7,8ve üretim nutraceuticals ve diğer değeri yüksek ürünler^9,10. Yosun da genetik olarak daha büyük oranlarda bir çaba onların zindelik belirli mühendislik uygulamaları^11,12geliştirmek için değiştirilen. Sonuç olarak, deneme büyük ilgi ile endüstriyel ilgili kontrollü ayarları organizmalarda vardır. Bu yöntemin amacı kültür mikroalg kontrollü laboratuvar ortamında etkili bir yaklaşım iletişim kurmak ve büyüme ve tarafsız lipid içeriğin bu alg ölçmek için var. Büyüme artırma oranları ve tarafsız lipid mikroalg içeriğini iki anahtar performans sorunlarını ticarileştirilmesi alg biyoyakıt¹³doğru olarak belirlenmiştir.

Çok çeşitli yaklaşımlar kültür algler için Deneysel amaçlar için kullanıldığını. Genel olarak, bu yaklaşımları büyük ölçekli açık ekimi ve küçük ölçekli kapalı ekimi arasında bölünmüş olabilir. Photobioreactors ve açık havuzlar açık ekimi için deneme amaçlı laboratuvar ölçekte (ölçek-up yeni yüksek-lipid zorlanma alg sınamak içinÖrneğin, ) zaten kanıtlanmış süreçleri kadar ölçekleme uygun¹⁴. Ancak, kapalı küçük ölçekli ekimi yeni veya geliştirilmiş yosun suşları geliştirilirken uygundur veya biyolojik mekanizmaları anlama deneyler yapmak amaçlı. Bu ikinci durumda, deneysel kontrol derecesini yüksek biyolojik davranışı ince değişiklikleri dışarı alay için gereklidir. Bu amaçla, axenic kültürlerin kez kaçınılmaz olarak büyük ölçekli açık sistemlerinde büyümeye diğer organizmalar (Örneğin bakteri, diğer algler) ile ilişkili karmaşık biyotik faktörler en aza indirmek için gereklidir. Alg ve diğer organizmalar arasındaki etkileşimler bile okurken, biz son derece kontrollü deneysel koşullar kullanımı organizmalar^15,16,17arasında moleküler değişimi incelerken yararlı bulduk.

Küçük ölçekli kapalı yosun ekimi kategori içinde yaklaşımlar bir dizi kullanılmıştır. Belki de en yaygın bir shaker tablo altında bir ışık banka^18,19Erlenmeyer şişeler içinde yosun büyümeye yaklaşımdır. Oksijen ve CO₂ Exchange tarafından pasif difüzyon balonun üstündeki bir köpük fiş aracılığıyla gerçekleşir. Bazı araştırmacılar bu kurulum şişeler²⁰etkin havalandırma yoluyla iyileştirilmiştir. Yosun heyecan bar ve etkin havalandırma tarafından karışık şişelerde yetiştirmek için başka bir yaklaşımdır. Onların basitliğine rağmen bulduk şişe ve şişe kez biyolojik çoğaltır arasında tutarsız sonuçlara yol açar. Muhtemelen bu pozisyon etkileri nedeniyle - farklı pozisyonlarda da iç Reaktör sıcaklığı etkiler ışık, farklı miktarda almak. Günlük rotasyon reaktörler yeni pozisyonlar için yardımcı olabilir ama sorun çünkü hafifletmek değil yosun büyümesini belirli aşamalarında (Örneğin, erken üstel) pozisyonel etkileri (Örneğin, log fazı) diğerlerine göre daha hassas.

Teknolojik gelişmişliği spektrum karşı tarafta tam kontrollü ticari photobioreactors vardır. Bu sistemler sürekli olarak izlemek ve yosun büyümesini optimize etmek için reaktör koşullarda ayarlayın. Programlanabilir aydınlatma, gerçek zamanlı sıcaklık kontrolü ve pH kontrolü ellerinde. Ne yazık ki, onlar pahalı ve genellikle reaktör birkaç bin dolarlık mal. En bilimsel ve mühendislik günlükleri sonuçlarının birden çok Biyoreaktörler satın gerektiren biyolojik çoğaltma gerektirir. Burada basit (balon) ve sofistike (biyoreaktör) tam kontrollü arasındaki laboratuvar ölçekli yosun ekimi için yaklaşımlar bu köprü bir kabarcık sütun reaktör sistem mevcut. Kabarcık sütunları gaz kabarcıkları gaz alışverişini kolaylaştırmak ve reaktör karışımı kullanın. Bu yaklaşım bazı ışık ve sıcaklık kontrol sağlayan ama çok maliyet-etkili bir şekilde yapar. Ayrıca, biz biyolojik çoğaltır şişesi veya şişe yaklaşım karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için gerekli olan gerekli sayısını azaltarak biyolojik çoğaltır arasında son derece tutarlı sonuçlar için bu sistemi bulduk. Bu sistem de başarıyla karışımları yosun ve bakteri²¹yetiştirmek için kullandık. Yosun ekimi yanı sıra, kültürlü yosun tarafsız lipid içeriğindeki ölçmek için bir yordam anahat. İkinci yöntem olmuştur, ama başka bir yerde²²yayınlanan nasıl başarılı bir şekilde istihdam konusunda adım adım yönergeler sağlamak için yordam eklemeniz.

1. Kurulum kabarcık sütun Photobioreactors

1. 1 L cam şişeler ve hibridizasyon tüpler (şematik ve fotoğraflar için Şekil 1 bakınız) birlikte gelen plastik kapakları dan Bacalı kapakları kümesi oluşturun. Tuzak, her hava Asansör photobioreactor ve her şişe reaktör karıştırma nemlendirici için kapakları oluşturmak.
   1. Matkap ¼" kapak delik: 2 delik için biyoreaktör ve nemlendirici kapakları; ihtiyaç vardır 3 delik karıştırma tuzak için ihtiyaç vardır.
   2. Bir ¼" O-ring konu üzerinde bir 1/8" paneli monte radarı uydurma, kayma ve bu kapak (Şekil 1A) delinmiştir ¼" delik kaydırın.
   3. Kayma bir ikinci ¼" O-ring konu üzerinde böylece kapak iki O-halkalar arasında sandviç olduğunu. Konu üzerine bir locknut kayma ve panel montaj radarı yerde düzeltmek için sıkın.
   4. Kilit halkaları maruz erkek radarı kapak projelendirme üzerine oturtun. Adımları 1.1.2-1.1.4 her deliğin kapağı için yineleyin.
   5. Kabarcık reaktörler üzerinde sütun ve şişe, kullanılan kapaklar eklemek için 1/8" kadın radarı barb bağlantı parçaları için 1,5" için 1/8" kimliği PVC boru parçaları. Bunlar her birine kapağı üzerinde maruz erkek radarı bağlantı parçaları ekleyin.
   6. Bir kontrol vanası (uzak kapağı işaret) ücretsiz bir 1/8" için ucunu parçalar.
      Not: Bu biyoreaktör için egzoz bağlantı noktası olarak görev yapacak.
   7. Barb ikinci parçası 1/8" kapak projelendirme boru için uygun bir erkek radarı bağlayın. Yerine dönen kilit halkayı tıklatın ve 0.2 mm hava filtresi bu tutturmak.
      Not: Bu reaktör için giriş noktası olarak görev yapacak.

Şekil 1. Şematik ve Biyoreaktörler oluşturmak için fotoğraflar. (A)şematik biyoreaktör inşaatı için kapakları monte biyoreaktör kapak fotoğrafı (B) ve (C) için nemlendirici kullanılan birleştirilmiş kapak fotoğrafı. Nemlendirici bağlantı parçaları içinde bir hava sızdırmaz conta kapak ile emin olmak için su geçirmez silikon kaplı olması unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. Hava dağıtım sistemi montajı ( Şekil 2A ve 2B'yi bir şematik ve fotoğraf için bakınız).
   1. Giriş ve çıkışları her Rotametre arkasında için barb bağlantı parçaları için 1/8" NPT iş parçacığı ekleme.
      Not: 200-2500 cm³/min rotameters hava basıncı modülasyon, nemlendirici için akıntıya karşı 100-1000 cm³/min rotameters çoğu için şişe reaktörler, 50-500 cm3/min rotameters olan hava Asansör Biyoreaktörler ve 5-50 cm³için / Min rotemeters için CO₂ akışı düzenleme vardır. Bu Dağı rotameters sabit bir yüzeye (Örneğin plastik levha) için tavsiye edilir böylece onlar işlemi sırasında düşmemesi.
   2. Basınçlı hava kaynağı çeneni, ardından ¼" kimliği esnek PVC boru basınçlı hava kaynağı için bir hortum kelepçesi ile bağlayın. Hortum çapı 1/8" kimliği PVC esnek boru bir ¼" barb uygun ve bir 1/8" barb montaj için erkek kadın kullanarak adım.
   3. Ücretsiz 1/8" kimliği boru 200-2500 cm³/min Rotametre koya ucunu.
      Not: Bu Rotametre çıkış yolu ile 1/8" kimliği boru nemlendirici şişe besleyecek.
   4. 1/8" Bacalı kapak (kullanım barb bağlantıyı yapmak için uygun bir kadın radarı) için bir giriş için boru bağlayın. Sonra ikinci biteviye-in 1/8" paneli monte iç boru bağlanmak uygun.
      Not: Bu parça aşağı içine nemlendirici ve su balonu havada askıda kalacaktır.
   5. 1/8" eklemek bağlantı parçaları için bir parça kimliği boru 1/8" her iki ucuna barb ve çıkış yeri nemlendirici, karıştırma tuzak koya bağlanmak için bu parça için kadın radarı.
   6. 1.2.5 aynı şekilde, CO₂ regülatör priz karıştırma tuzak üzerinde ikinci bir bağlantı noktasına bağlayın.
   7. 1/8" kullanarak bir manifold oluşturmak boru ve 1/8" birden çok bağlantı noktalı barb ( 2 C rakamhava Rotametre bankalar beslemek için bakınız).
      Not: Bu rotameters Biyoreaktörler sağlamak için kullanılır. Serisi 6'dan fazla rotameters inşa kaçının. Rotameters paralel bankalar sistemi genişletmek için kullanın. Toplam akış isteğe bağlı tüm reaktörler için 2500 cm³/min daha az olduğundan emin olun (veya başka bir büyük Rotametre gerekli olacak nemlendirici, ters yönde).
   8. 1/8" Borulama ve bir 1/8" barb radarı kadın kullanarak yeni inşa edilmiş Rotametre bankalara karıştırma tuzak (3^rd bağlantı noktası) çıkış bağlayın.
   9. Yeterince uzun 1/8" her Rotametre Biyoreaktörler için hava sağlamak için Rotametre bankada Outlet boru bağlayın. Banka rotameters yanı sıra tüp ucunun etiketleyin.
   10. Tüm bağlantı noktaları etrafında su geçirmez silikon nemlendirici ve hava sıkı olduklarından emin olmak için tuzak kapağı karıştırma uygulayın.

Şekil 2. Şematik ve kabarcık sütun sistemi montajı için fotoğraflar. Nemlendirici ve havalandırma sistemi (B) fotoğraf(a)şeması tuzak ve Rotametre banka ve (C) fotoğraf Rotametre bankalar birbirine bağlamak için kullanılan Manifoldlar, karıştırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. Balık tank ayarla, tabak ve ışıkları (Şekil 3) ilave edin.
   Dikkat: Bu sistem çok sayıda satış ve tüm bileşenleri desteklemek için yeterli devre kapasitesi gerektirir. Bu bir elektrik tehlikesi olduğu için birlikte birden çok anahtarlı uzatma kabloları ve uzatma kablosu bir zincirleme moda çekimi kaçının. GFI türü çıkışları ve anahtarlı uzatma kabloları içinde belgili tanımlık sistem son derece su varlığı nedeniyle teşvik edilmektedir.
   1. Düşük profilli manyetik karıştırıcı balık su dolu tank ağırlık tutabilecek kadar güçlü bir yüzeyin üzerinde düzenleyin.
   2. (Biraz karıştırın tabakları uzun olan) küçük ahşap veya plastik blok çevresinde balık tank ağırlığını desteklemek için heyecan plakaların yerleştirin.
      Dikkat: ağırlığı onları ezeriz gibi balık tank doğrudan heyecan tabaklarda yerleştirmekten kaçının.
   3. Balık tank karıştırın tabakları üzerinde koyun ve blok destek ve tankları su ile doldurun.
   4. Üstünde tepe-in akvaryum bir kapak olarak sığacak şekilde sert bir plastik levha bir parça kes. Hibridizasyon tüpler içeri ve dışarı kaydırmak için bu kapağı delik kesti. Ayrıca balık tank ısıtıcı için bir delik.
   5. Floresan ışık bankalar Biyoreaktörler yatay aydınlatma sağlamak için akvaryumun yanındaki Düzenle. Işık banka bir gün/gece döngüsü ayarlamak için hafif bir Zamanlayıcı takın.

Şekil 3. Sistem (solda) şişe Biyoreaktörler ve kabarcık sütun photobioreactors (sağda) için şematik. Bu rakam Higgins vd. değiştirildi ¹⁷. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. mikroalg Inoculum hazırlanması

1. Mikroalg inoculum soguk korunmuş, kaplama veya sıvı kültüründen elde edilir.
   Not: Bu cryopreserved organizmalar olarak inoculum hücreler uygun ve ortaya çıkan kültür axenic olduğundan emin olun kullanmak önce kaplama tavsiye edilir. Agar Orta (Örn., ATCC #5 agar sporulating)²¹ yaşında iyi Chlorella ve Auxenochlorella tür cryo-depolama canlandırılması için çalışır bir zengin Orta.
2. Belirli mikroalg türler için uygun olan mineral Orta 2.4 L hazırlayın.
   Not: N8 orta²³ Chlorella, N8-NH₄ orta²¹ Auxenochlorellatür için tür için örnekler. Bir orta için yosun zor uygun sağlam yosun büyüme sağlanması yönünde en önemli adımlardan birini kullanmaktır.
3. Eşit içine üç 1 L cam şişeler, mineral orta aliquot 2.4 L barlar her şişe karıştırın ve Bacalı kapakları (Şekil 1) araya her şişe için ekleyin. Bu havalandırma tüpü giriş yan ve her şişe üzerinde kontrol bir heyecan barı var.
4. Otoklav sıvı sterilizasyon kullanarak hisse senedi şişe (121 ° C) kaplama için kullanılan daha sonra aynı anda 30 dk. otoklav 100 mL deiyonize su (dH₂O) ve bazı 1,5 mL tüpler için döngüsü. Orta serin gece kalmak için izin verir. Alternatif olarak, oda sıcaklığında reaktöre serin ve aşılama öncesinde 2 h için havalandırmak.
5. Bir Biyogüvenlik içinde dolap (BSC), hisse senedi şişe mikroalg bir tabak veya axenic sıvı kültürü aşılamak. Aşağıdaki adımlarda axenic kültürleri korumak için steril tekniği kullanın.
   1. Autoclaved dH₂O 20 mL steril 50 mL santrifüj tüpü ekleyin. Steril bir 10 µL tek kullanımlık döngü tek sömürgeler kimden adım 2.1 tabaktan almak için kullanın. Döngü 50 mL tüp içine daldırma ve yosun hücreleri 20 mL autoclaved dH₂O. bir homojen mikroalg çözüm yapmak için Shake 50 mL tüp yıkayın.
   2. 6 mL mikroalg çözeltisi her hisse senedi şişe içine ile 10 mL steril serolojik pipet pipet. Mikroalg eşit olarak orta karıştırmak için şişe girdap.
6. 2 mL steril serolojik pipet 1 mL numune her hisse senedi şişe ve transfer steril 1,5 mL tüpler içine çizmek için kullanın.
   Not: Mikropipetler kirlenme riski nedeniyle bu adım için tavsiye edilmez. Hisse senedi şişe üzerinde Bacalı kapakları sıkın.
7. Hisse senedi şişe karıştırın tabakları (~ 150 devir/dakika) yerleştirin ve hava debisi, CO₂ve bu tür için uygun aydınlatma düzeyleri ayarlayın. Hisse senedi şişe pozisyon her gün döndürün.
8. Adım 2.6 sırasında elde edilen 1 mL numune seyreltik (steril su 100-fold seyreltme genellikle iyi çalışıyor) ve zengin agar orta tabağa yayıldı.
   Not: Bu plakaları kirlenme örneklerini de gelecek yosun inoculum için bir kaynak olarak hizmet olarak daha fazla deneyler için kontrol etmek için kullanılabilir.
9. Örnekleri mikroalg büyüme denetlemek için iki günde şişelerde (BSC) almak.
   96-şey Mikroplaka nüsha (200 µL) içinde gerçekleşti örnekleri ve ölçmek optik yoğunluk (OD) de 550 nm ve 680 nm iki günde OD kadar ulaşır 0.2-0.3 (ki genellikle 5-7 gün) gerektirir.
10. Kuluçka durdurmak ve bir banka için 24-48 h yosun hücreleri yerçekimi tarafından yerleşmek için izin vermek hisse senedi şişe yerleştirin.
    Not: Kapatılan hücreleri sonraki kabarcık sütun photobioreactors aşılamak için kullanılacaktır. Daha hızlı bir hücre toplama isterseniz, hücreler hücreleri toplamak için fazla 1000 x g centrifuged.

3. kabarcık sütun Photobioreactors mikroalg tarımı

1. Biyoreaktör aşılama, önceki gün uygun ortam hazırlamak ve kabarcık sütun photobioreactor transfer 200 mL (veya istediğiniz birime) (hibridizasyon tüpler) tüpleri. Otoklav tüpleri ile medya ve Bacalı kapakları yerinde.
   Not: Eğer Atıksu otoklav boş bir büyüme aracı olarak kullanarak Biyoreaktörler ve (axenic kültür arzu edilirse) Atıksu steril süzülmüş ekleyin.
2. Kapatılan mikroalg hisse senedi bir vakum pompası kullanarak süpernatant kaldırarak konsantre. Her şişe daha az 100 mL orta terk ancak kapatılan yosun kaldırma kaçının.
   Not: Bu yordam bir BSC içinde yapmak ve steril tekniği uygulayın. Basit bir vakum aparatı vakum şişesi veya şişe kullanarak oluşturulabilir. Steril serolojik pipet tüp sonuna uygun.
3. Askıya alma ve yosun Bulamaç steril 50 mL santrifüj tüpleri için transfer. Daha fazla 5 min için 1000 x g, santrifüj yosun konsantre ol.
4. BSC, yosun konsantreleri 12 photobioreacters için ~ 80 mL toplam hacmi elde etmek için yeterli süpernatant kaldırın. Pelet vakumlama kaçının. Yosun konsantre steril bir kap (veya kullanılan alg stok şişe) aktarın.
5. Yosun Bulamaç 6 mL steril 10 mL serolojik pipet ile her photobioreactor içine ekleyin.
6. Steril filtre (0.2 mm şırınga veya vakum filtre) ve autoclaved olamaz herhangi bir diğer bileşikler (Örneğin vitamini stokları) uygun miktarda ekleyebilirsiniz.
7. Yosun orta karıştırmak için Biyoreaktörler girdap.
8. 2 mL örnek bir serolojik pipet ve 2 mL tüp transferi kullanarak her biyoreaktör çizmek. 2 mL örnek (BSC içinde) her 24 h kültür ilerlemesini izlemek için toplamak. Kontrol pH kullanmak için örnek şeritler test ve reaktör ile 3 M NaOH veya 3 M HCl gerektiği gibi ayarlayın.
9. Biyoreaktör kapakları sıkın ve tüm Biyoreaktörler balık tank su banyosu yerleştirin. Havalandırma, CO₂ve aydınlatma türler için uygun seviyeye ayarlayın. Biyoreaktör pozisyon (adım 3.8) örnekleme sonra her gün döndürün.
10. Nüsha her kültür örneğinin 200 µL 96 iyi Mikroplaka wells için geçerlidir. Ölçmek optik yoğunluk (OD) 550 nm ve 680 nm.
    1. Kültür dönemin son günü OD altında farklı seyreltme faktörler (Örneğin, 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x ve 32 x) hasat (adım 4) sonra OD ve gerçek kuru ağırlığı arasında bir ilişki kurmak için ölçmek.
11. 2 mL örnek tüp 12.000 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
12. Süpernatant 0.2 µm steril olmayan şırınga filtre ve süpernatant (ve gerekirse Pelet) Hayır saklamak-20 ° C uzun vadeli depolama ve medya bileşiminde değişiklikler daha sonraki analiz için daha yüksek.

4. hasat ve donma kurutma Microalgal biyokütle

1. Yosun kültürü her biyoreaktör dereceli silindir (Örneğin, bir biyoreaktör orta o aslında içerdiği 200 mL den 160 mL) ile sabit bir hacim ölçmek ve santrifüj şişe aktarın. DH₂O her ölçüm arasında ile mezun silindir durulayın.
2. 5 dakika süreyle 4696 x g, santrifüj süpernatant atmak dikkatle dışarı vakumlama tarafından.
3. Granül etiketli 50 mL tüpler için transfer. Santrifüj şişe dH₂O ile ve transfer içeriği 50 mL tüpler için durulayın. Toplam boru birim 45 mL aşmaz olun.
4. Yosun granül tuzları kaldırmak için dH₂O ile yıkayın.
   1. 4696 x g 5 min için de 50 mL tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   2. 40 mL dH₂O her 50 mL tüp ekleyin; girdap karıştırmak için. Tekrar 4696 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   3. 4.4.2 tekrar adımları yineleyin.
5. Etiket ve bir 4-ondalık denge üzerinde boş 15 mL santrifüj tüpleri tartmak (kapak ve tüp etiket ve onları birlikte tartmak). Yosun kültür başına bir tüp tartın. İki kez hata en aza indirmek için her 15 mL tüp tartın.
6. Son yıkama sonra süpernatant atın ve dH₂O 7.5 mL her 50 mL tüp ekleyin. Girdap ve transfer yosun çamurlar içine önceden ağırlığını 15 mL tüpler. 50 mL tüpler ek dH₂O ile durulayın ve sıvı 15 mL tüpler için transfer. 15 mL tüpler toplam hacminin 12 mL aşmasını önlemek.
7. 4696 x g 5 min için de 15 mL tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak. Granül-80 ° c en az 30 dk içinde dağılması için hazırlık için tüplerini dondur.
8. Dondurma kuru gecede veya kurutulmuş kadar.
9. Tartmak ve freeze kurutulmuş 15 mL tüpler yosun ile kayıt.

5. lipid ayıklama bir değişikliğin Folch yöntemi²⁴ kullanarak

1. 20 mg 2 mL vidalı kapak polipropilen boru (ürün boncuk çekimi için uygun olduğundan emin olmak için onay üretici etiket) içine kurutulmuş yosun biyokütle tartın.
2. Folch solvent (2:1 kloroform/metanol) 1,5 mL (kurutulmuş yosun 20 mg içeren) her 2 mL tüp ekleyin. 2 mL sıvı düzeyi tüp ulaşana kadar ~0.5 mL zirkon/silika boncuk (0.5 mm) her tüpün içine dökün.
   Dikkat: kloroform ve metanol duman başlıklı işlemek ve duman nefes önlemek veya ilgili kişi cilt.
3. Alg örnekleri 20 boncuk fabrikasında homojenize s 6,5 m/s Transfer tüplere 30 için buz hızında örnekleri sakinleşmesini s. Tam lipidler ayıklamak için beş kez daha tekrarlayın.
4. Homogenate filtrate 15 mL tüp içinde toplama boncuklar, dışarı zorlanma bir paslanmaz çelik tel kafes disk (#60 mesh) içeren bir 5 mL şırınga aracılığıyla filtre.
5. Boncuk Folch solvent, gereken şırınga sıvı itme 1,5 mL ile yıkayın. Bu yıkama iki kez daha tekrarlayın ve son hacmi yaklaşık 6 mL verimli 15 mL Tüp, tüm filtrate toplamak.
6. 1.2 mL % 0,9 (w/v) NaCl çözüm 15 mL tüp Folch ayıklamak için ve girdap karıştırın ekleyin.
   Not: gerekirse, daha fazla Folch solvent boncuk (kullanım %0,2 0,9 NaCl çözüm faz ayrımı ikna etmek için toplam yıkama hacmi x) yıkamak için kullanılabilir.
7. 6.000 x g 5 dk. kayıt yakın 0.1 mL 15 mL tüp tarafında hatlarını kullanarak alt kloroform (yeşil) faz birime de 15 mL tüpler santrifüj kapasitesi. Bir cam Pasteur pipet kullanarak alt aşamaya bir cam şişe (kapaklı) aktarın.
8. -20 ° C'de lipid depolamak veya (varsa-80 ° C bu özü yağ asidi analiz için kullanmayı planlıyor).

6. nötr Lipid Mikroplaka yöntemiyle tahlil (Higgins vd. 2014²²) adapte

1. Hisse senedi çözümleri hazırlayın. 10 mL 1 mg/mL bitkisel yağ standardında kloroform hazırlamak ve -20 ° C'de depolayın
   Not: herhangi bir bitkisel yağ, yağ asitleri, türleri için duyarlı olmadığından bu tahlil kullanılıyor olabilir. 10 mL 200 µg/mL dimetil sülfoksit (DMSO) Nil kırmızı çözümde hazırlamak ve karanlık oda sıcaklığında saklayın.
2. Bir duman başlıklı 55 ° C bloğuna kuru Mikroplaka ön ısı. Bu Isıtma iken, lipid özleri ve bitkisel yağ standart 3-fold seyreltik metanol ile.
   Not: Bu seyreltme algler lipid içeriğine göre değiştirilebilir, ancak bu seviyede de çoğu Chlorellaiçin çalışır.
3. Seyreltilmiş her örnek için bir 96 de Polipropilen Mikroplaka quadruplicate içinde 80 µL ekleyin.
   Dikkat: Polistren plasticware kullanımı organik çözücüler ile kullanmak için tavsiye edilmez.
4. Boş çözücü için 80 µL 2:1 metanol/kloroform quadruplicate içinde geçerlidir. Standartları, 10, 30, 60, 90 ve 120 µL quadruplicate içinde standart seyreltilmiş bitkisel yağ ekleyin.
5. Tüm çözücü buharlaşıp vardır kadar 20-30 dk 55 ° C'de bir kuru blok ısıtıcı Mikroplaka yerleştirin. Çözücü buharlaşarak iken, çalışma hazırlamak Nil kırmızı çözüm (1 µg/ml solüsyon plaka iyi ücret, gerek 200 µL). Örneğin, on iki örnekleri ve standartlara tam bir set gerektirir 1.0 µg/mL solüsyon 16 mL; 16 mL dH₂O. (içinde DMSO) 200 µg/mL stokunun 80 µL çözülerek hazırlamak
6. Mikroplaka Isıtma bloğundan kaldırmak ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın. İzopropil alkol 30 µL her şey için ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Tüm pipet kanallar çözüm karıştırma ve homojen bir yeşil sıvı verimli lipidler, resuspending emin olun.
7. Her şey, pipet için Nil kırmızı çözüm (1 µg/mL) 200 µL yukarı/aşağı karıştırmak için 10 kez ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için plaka kuluçkaya. Beklerken, bir % 50 çamaşır suyu çözüm çamaşır suyu (%6 hipoklorit) karıştırılarak₂O. 20 µL iyi başına ihtiyaç vardır dH ile hazırlayın. 3 mL % 50 çamaşır suyu hazırlanması 12 örnekleri ve standartlar tam bir dizi için yeterlidir.
8. Çamaşır suyu çözüm 20 µL her Mikroplaka de ekleyin ve iyice karıştırın için 5 kere yukarı ve aşağı pipet. Oda sıcaklığında 30 dk kuluçkaya.
9. 30 dakika sonra floresans örneklerde her 5-10 dk 530 nm uyarma/575 nm Emisyon, 570'ayarla otomatik kesim ile okumak kadar alg örnekleri sinyalini stabilize nm. Tipik olarak, toplam kuluçka 60 dk yeterli olur.
10. (0-40 ng petrol/iyi aralığında) bitkisel yağ standartları için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
    Not: Bir doğrusal inşaat düşük için de uygun (< 30 ng/iyi) yağ konsantrasyonu ve uygun bir polinom standart 30 ng/iyi geçmesi durumunda kullanılabilir. Bu korelasyon örnek Wells tarafsız lipid ölçmek için kullanın.

Bu yordamı bir zaman ders OD 550 nm (Şekil 4A) yosun optik yoğunluk veri verir. Optik yoğunluk ve Kuru ağırlık veri-ebilmek var olmak konsantrasyon korelasyon (Şekil 4B). Bu son Kuru ağırlık yosun konsantrasyon freeze-drying adım sonra hesaplayarak gerçekleştirilir. Daha sonra optik yoğunluğu (örnekleme son gününde gerçekleştirilen) kültür seri seyreltme ve gerçek Kuru ağırlık konsantrasyonları ile ilişkili olabilir. Yüksek hücre konsantrasyonu için ikinci bir sipariş polinom korelasyon kullanılabilir, ancak düşük hücre konsantrasyonu için doğrusal bir ilişki kullanılabilir. Her kültür koşul için ayrı bir ilişki oluşturmak için tavsiye edilir. Son olarak, korelasyon saat ders optik yoğunluk veri bir kuru ağırlık büyüme eğrisi (Şekil 4 c) elde etmek için uygulanabilir. Bu örnek deneyde Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341²⁵) dört koşullar altında kültürlü: taze N8-NH₄ orta²¹, bakteri Azospirillum ile ortak kültüründe yetiştirilen axenic denetim kültürler brasilense, orta 50 mg/L indol-3-asetik asit ile desteklenmiş ve üzerinde harcanan A. brasilenseüzerinden orta. A. brasilense indol-3-asetik asit, bir bitki büyüme hormonu, ayrıca bazı mikroalg büyüme teşvik teşvik üretmek için bilinir. Ancak, 50 mg/L, IAA tedavi tamamen A. protothecoides büyüme inhibe. Sonuç olarak, optik yoğunluk veri kullanılabilir ancak alg miktarı doğru Kuru ağırlık konsantrasyonu elde etmek yetersizdi. Bu durumda, denetim kültür için korelasyon uygulanabilir veya optik yoğunluk veri doğrudan bildirilebilir. Çünkü her iki 550 OD veriler toplanmıştır nm ve 680 nm absorbans, her iki veri kümesi OD ve kuru ağırlığı arasındaki korelasyon için kullanılabilir. Genellikle, çünkü neredeyse tamamen klorofil²⁶, absorbans dışlar OD 550 böylece klorofil içeriği değişikliklerden önyargı baskılayarak kullanılır. Buna ek olarak, OD 680 klorofil absorbans içerir ve yüksek oranda OD 680/550 algler yüksek klorofil içeriği gösterir. Şekil 4 d on iki yosun kültürler kabarcık sütun photobioreactors içinde büyüyen bir dizi gösterir. Bile sadece üç biyolojik çoğaltır ile tedavi başına, sıkı standart sapmalar, bırakmak için tedaviler arasında farklılıklar için yüksek hassasiyet elde edildi.

Şekil 4. Yosun büyümesini kabarcık sütun photobioreactors içinde sonuçlanır. (A) optik yoğunluk (550 nm) Auxenochlorella protothecoides (UTEX 2341) büyüme eğrisini gösterir 120 saat geç Logaritmik büyüme girerek kültürler. Denetim kültürler üzerinde taze N8-NH₄ orta yetiştirilmiştir, tedavi 1 ortak kültürleri A. protothecoides ve taze N8-NH₄ ortamda, tedavi 2 yetiştirilen Azospirillum brasilense axenic A. protothecoides yetiştirilen 50 mg/L indol-3-asetik asit (IAA) ve tedavi 3 N8-NH₄ orta axenic A. protothecoides A. brasilenseharcanan ortamından üzerinde yetiştirilen olduğunu. Harcanan orta için 96 saat üstünde 2 g/L malik asit ile desteklenmiş N8-NH₄ orta A. brasilense kültür tarafından hazırlanmıştır. Hücreleri çıkarıldı ve orta amonyum ile başlangıç seviyesine geri yüklemek için yeniden desteklenmiştir, pH ayarlandı ve orta steril filtre uygulanmış (0,2 mikron) vardı. 50 mg/L IAA tedavi tamamen yosun büyümesini inhibe unutmayın. (B) korelasyon OD 550 nm ve ikinci bir sipariş polinom uyum kullanarak son Kuru ağırlık konsantrasyonu arasında eğrileri. Yok yosun kültür dönemin sonunda hasat çünkü hiçbir bağlantı 2 tedavisi için gösterilir. Polinom korelasyon optik yoğunluk verilere uygulanması (C) ile Kuru ağırlık toplama y ekseni üzerinde bir büyüme eğrisi verir. Denetim kültür korelasyon OD veri tedavi 2 için uygulandı. Hata çubukları standart sapmalar 3 biyolojik dayalı çoğaltır vardır. Kabarcık sütun photobioreactors kısa bir süre sonra kültür aşı (D) fotoğraf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tarafsız lipid veriler Şekil 5olarak iki örnek deneyler için gösterilir. Bu tahlil de tarafsız lipid içerik, özellikle triacyglycerol (TAG) içeriği ile ilişkilendirmek için gösterilmiştir. Bu tarafsız lipid tahlil (Şekil 5A) karşılaştırarak karşılık gelen bir ince tabaka Kromatografi plaka (Şekil 5B) görülebilir. Aynı eğilim ikinci denemede (Şekil 5C ve 5 D) görülebilir. Tüm bu deneyler, kanola yağı bir standart olarak kullanılmış ve floresan ve kanola yağı kitle iyi arasında doğrusal korelasyon (R² 0,98 ilk deneme için ve ikinci 0,99) sonuçlandı. Tüm örneklerini düşük lipit içeriğiniz varsa, o zaman en yüksek nokta veya iki standart kesilmesine olduğunu unutmayın. Bu korelasyon tarafsız lipid (µg) her yosun örnek Wells miktarını hesaplamak için kullanılabilir. Petrol kitle olabilir sonra bir konsantrasyon Mikroplaka için de uygulanan lipid özü dönüştürülmüş. Bu değer kullanılan seyreltme faktörü ile çarpılır (Örneğin, 3 x) orijinal Folch tarafsız lipid içeriğini özleri elde etmek için. Bu konsantrasyon sonra (4 mL yakın olmalıdır) özü hacmi ile çarpılır ve sonra yosun biyokütle lipid çıkarılması (yakın 20 mg olmalıdır) için kullanılan toplam kütlesi bölünür. Mikroalg tarafsız lipid içeriğini sonucudur.

Şekil 5. Chlorella sorokiniana (UTEX 2714) kültürleri elde edilen tarafsız lipid veriler. (A)tarafsız lipid içeriği (% Kuru ağırlık) yosun içinde 1'hangi yosun deneme için yetişkin için 120 saat. Denetim kültür axenic ve taze N8 orta²³kültürlü, tedavinin 1 C. sorokiniana , ortak bir kültür olduğunu ve A. brasilense taze N8 orta, tedavi 2 50 mg/L ile IAA takıma taze N8 orta vardı ve tedavi 3 geçti A. brasilenseortamından. Harcanan orta hücreleri, kayıp nitrat, pH, ayarlama ilave kaldırma kodlamayla A. brasilense N8 Orta 2 g/L malik asit ile desteklenmiş 96 saat tarafından hazırlanan ve steril Orta (0,2 mikron) süzme. A. protothecoidesfarklı olarak, 50 mg/L IAA C. sorokiniana büyümesini inhibe değil. (B) TLC plaka görüntü deneme 1 gösteren göreli etiketi bereket için. (C) tarafsız lipid içeriği (% Kuru ağırlık) için aynı tedavi 1 ancak hücreleri denerken vardı denemede 2 algae büyüme 72 saat sonra hasat. (D) TLC plaka görüntü deney 2 gösteren göreli etiketi bereket için. Hata çubukları standart sapmalar 3 biyolojik dayalı çoğaltır vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ayrıca, varyasyon (ne demek bölünmüş Standart sapma) katsayısı hesaplamak için iyi bir yöntemdir ham floresans ölçümler arasında tarafsız lipid tahlil tüm teknik çoğaltır. Teknik çoğaltır yordamda belirtildiği gibi quadruplicate Mikroplaka yapılmıştır varsayarsak, varyasyon katsayısı genellikle % 10 fazla olmamalıdır. Varyasyon yüksek katsayıları zavallı (özellikle eklenmesi izopropil alkol sırasında) karıştırma sonucudur ve çok kanallı pipet potansiyel olarak yanlış kullanımı genellikle.

Yosun kültür zaman en önemli faktör bir organizma veya grup organizmalar özel ihtiyaçlarını anlaşılmasıdır. Yetiştirme sistemi burada anlatılan yosunlar ama belirli abiyotik faktörler (sıcaklık, medya, pH, ışık şiddeti, CO₂ düzeyi, havalandırma oranı) geniş bir kültür için kullanılabilir yosun organizma ihtiyaçlarına ayarlanması gerekir. Not burada açıklanan parametreleri tarım Chlorella ve Auxenochlorellaiçin kullanıldı. Yüksek besin, ışık ve sıcaklık düzeyleri²⁷dayanıklı oldukları için bu organizmaların endüstriyel ilgi vardır. Ancak, ışık düzeylerini floresan ampuller kaldırılması azaltılabilir ve gündüz/gece döngüsü mevsimsellik temsil etmek için ayarlanabilir. Aynı şekilde, su ısıtıcıları yukarı veya aşağı denetimini su banyo sıcaklığı sistemdeki kapatılabilir. Burada açıklanan sistem böyle bir özelliği istihdam değil iken, balık tank su banyoları bir düşük maliyetli soğutma sistemi ile Oda sıcaklığının altında sakin mümkündür. Bir kova su küçük buzdolabında yerleştirin ve değişken hız için pompa pompa su soğuk su kova akvaryuma kullanın ve geri. Daha hızlı pompa hızı daha soğuk balık tank su deposu haline gelecektir.

Yosun yetiştirme sistemi genellikle tutarlı sonuçlar sağlar, ancak düşünülmesi gereken birkaç önemli uyarılar vardır. İlk olay havalandırma sistemi basınç ani kaybı deneyimleri oluşan su Sifonlama olduğunu (Örneğin, şişmiş bir uydurma veya bir hava kompresör hatası). Nemlendiriciler içinde olduğunu basınç nemlendirici su Rotametre ile de dahil olmak üzere boru aracılığıyla geriye itecektir. Bir akış yukarı tuzak ya da geri tepme önleyici yüklemek yardımcı. Atmosferik basınç çalıştığından Sifonlama Biyoreaktörler kendilerini etkilemez olduğunu unutmayın. Boru ve bağlantı parçaları rutin muayene sistem arızaları hafifletmeye yardımcı olabilir. Diğer bir önemli faktör düzenli olarak inceleyin ve hava filtreleri değiştirin ve Biyoreaktörler vanaları kontrol etmektir. Otoklav devir izin verilen sayıda üreticinin tavsiye izleyin emin olun. Bakım axenic kültürlerin deney için kritik öneme sahiptir, bu özellikle önemlidir. Son olarak, bu satın almak ya da bir autoclavable raf su banyoları, basınçlı kap ve Biyogüvenlik kabini arasında Biyoreaktörler, güvenli taşıma için inşa önerilir. Paslanmaz çelik tel raf bu amaca hizmet edebilir.

Burada açıklanan biyoreaktör sistemi bazı sınırlamaları vardır. Steril tekniği kullanarak bir Biyogüvenlik kabini reaktörlerde işlemek için gereken temel bir kısıtlamadır. Reaktörleri kültür bulaşıcı olmadan bir Biyogüvenlik örnek için kabine reaktör geçmek Kullanıcı gerektiren bir anti-Sifonlama örnekleme bağlantı noktası yok. Reaktörleri da manuel pH okuma ve insan hatası için potansiyel tanıttı ayarı gerektirir.

Burada açıklanan biyoreaktör sistemi basit şişesi yetiştirme ve tam kontrollü Biyoreaktörler arasında bir niş doldurur. Biyoreaktör sistem, şişeleri kullanılarak ulaşılabilir olduğundan daha tutarlı sonuçlar için bir ihtiyaç için geliştirilmiştir. Verileri bu sistem ne zaman uygun şekilde işletilen istikrarlı büyüme sonuçlar üretir gösterir. Not gazlı şişe yordamı alg stok tarımı için istihdam edildi, ancak bu sadece deneme için inoculum üretmek için yapılmıştır. Bu hisse senedi şişe aşı için havuza alınmış ve bu nedenle değişkenlik reaktörler arasında bir sorun değil çünkü kabul edilebilir.

Gibi pek çok yosun araştırmacı hem büyüme hem de tarafsız lipid içerik izleme ilgilendi, bu parametrelerin her ikisi de ölçme bizim yaklaşım dahil ettik. Optik yoğunluk büyüme ölçmek için standart bir uygulamadır ve sadeliği içinde benzersiz olduğunu. Ancak, Kuru ağırlığı ve optik yoğunluk arasında korelasyon zaman içinde değişim ve kültür koşullara bağlıdır. Bu deneysel her toplu iş içinde her deneysel tedavi korelasyon denklemi üretmek için tavsiye edilir. Bu önerilen yordamda mümkündür çünkü freeze kurutulmuş yosun her kültür deneyden sonra elde edilir. Bir kritik optik yoğunluk yaklaşımın optik yoğunluk ve kuru ağırlığı arasındaki toplu iş büyüme boyunca sabit tutan kabuldür. Bu varsayım sapmalar küçük olduğu sürece sonuç makul doğru olacaktır. Göreceli doğruluğu sıfır zamanda hesaplanan yosun Kuru ağırlık konsantrasyon karşılaştırarak tespit edilebilir. Kültürler de karışık ve pipetting varsayarak doğru tüm kültürlerin aynı ilk aşılama yoğunluğu olmalıdır. Arka plan absorbans orta yüksek olduğunda optik yoğunluk yaklaşım da meydan okunabilir (bazı wastewaters ile çalışırkenyani ). Her OD okuma (aşı önce) absorbans orta çıkarma ile bu sorunu yardımcı olabilir.

Lipidler ayıklama Kuru Yosun dan köklü Folch yaklaşım^21,24şöyle; Ancak, önemli hususlar vardır. Farklı alg türleri farklı hücre duvarları tokluk değişen derecelerde ile var. Burada kullanılan zirkon/silika boncuk keskin ve güçlü, polisakkarit hücre duvarları delmek için tasarlanmıştır. Daha yumuşak bir boncuk türü (Örneğin, cam) veya daha az sayıda boncuk bozulma döngüleri yosun zayıf hücre duvarları ile kullanılabilir. Ancak, kural çıkarma sonra elde edilen hücre Pelet bütün klorofil ayıklandı gösteren pigment, ücretsiz olması gerektiği gibi. Lipid ayıklama adım sırasında hata en yaygın kaynaklarından biri olan yanlış donma kurutma nedeniyle oluşur. Önce tamamen kuru örnek donma kurutma makinesi erirse, sonuç çok sert, karanlık, balmumu Pelet olacaktır. Donma kurutma makinesi vakum koşullar altında lysed hücreleri sonucudur. Pelet kuru ağırlığı elde etmek için ağırlığını koydu, ama balmumu parçacıklar Folch solvent yıkmak değil gibi lipid çıkarma için kullanılamaz. Her zaman kurutma verimi yumuşak, toz halinde örnekleri dondur emin olmak için tüm örnekleri-80 ° c donma ve derhal donma kurutma makinesi aktarmak için esastır. Ayrıca, parafilm (içinde dürttü bir delikle) gevşetti tüp kapakları yerine kullanarak önce Bu Tammy'nin nem sürekli olarak alınan örneğin kaldırılabilmesi için sağlayacaktır.

Bu yordamda açıklanan tarafsız lipid tahlil daha önce yayımlanmış ve alternatif lipid deneyleri²²bir tartışma içerir. Ancak, bazı önemli iyileştirmeler için bu yordamı yayın beri yapılmıştır. En önemlisi, Nil kırmızı çözüm konsantrasyonu 0,5 µg/mL 1 µg/mL artış olmuştur. Bu değişikliğin etkisini daha yüksek sinyal şiddeti, geliştirilmiş tekrarlanabilirlik ve bir sinyal düşüş kuluçka dönemi sırasında zamanla ortadan kaldırılması oldu. Tahlil sonuçları de nitel ince tabaka Kromatografi karşılaştırır sonuçlar gösterir. Bu tahlil geliştirilmiştir ve onun uygulanabilirliği için önemli ölçüde farklı kompozisyon türleri tespit Chlorella ve Auxenochlorella çeşitli tür kullanarak doğrulanmış. Tüm yeşil pigment açık ya da çok soluk sarı örnekleri için önde gelen çamaşır suyu kuluçka sırasında tahlil tamamen kaldırılmalıdır. Ayrıca Not genellikle (olarak kahverengi renk yeşil bir değişiklik tarafından gösterilen) bozulmuş lipid özler bu tahlil doğru sonuçlar sunmak başarısız. Böylece lipid örnekleri hiçbir depolamak için şarttır karanlıkta-20 ° C daha yüksek.

Burada alg kültür için sunulan yöntemleri, büyüme ölçme ve nötr lipitler miktarının alg mühendislik uygulamaları çeşitli için yararlıdır, ama özellikle araştırma biyoyakıt üretimi için uygundur. Bu yöntemler, yosun büyüme inhibisyon wastewaters²⁸ gibi organizma etkileşim büyüme üzerine etkileri ve mikroalg kompozisyonu üzerinde çalışmaya da kullanılmaktadır.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu araştırma için destek USDA Ulusal Enstitüsü Gıda ve tarım ambarı projesi ALA0HIGGINS ve Provost, ahlak bozukluğu başkan için araştırma ve Samuel Ginn kolej mühendislik Auburn Üniversitesi ofisleri tarafından sağlandı. Destek de NSF tarafından sağlanan CBET 1438211 verin.