Выращивание зеленых микроводорослей в фотобиореакторах колонки пузыря и Assay для нейтральные липиды

Здесь мы представляем протокол для создания лаборатории шкала пузырь столбец фотобиореакторах и использовать их для микроводорослей культуры. Он также предоставляет метод для определения темпов роста культуры и содержание нейтральных липидов.

Существует значительный интерес к изучению микроводорослей для инженерных приложений, таких как производство биотоплива, высокой стоимости продуктов и для обработки отходов. Как большинство новых разработок начинаются в лабораторном масштабе, существует необходимость для экономически эффективных методов для культивирования микроводорослей в духе воспроизводимость. Здесь мы общаемся эффективный подход к культуре микроводорослей в лабораторных фотобиореакторах и для измерения роста и липидный нейтральными содержание этой водоросли. Инструкции по настройке системы photobioreactor также включены. Хотя пример организмы являются видов хлореллы и Auxenochlorella, эта система может быть адаптирована к развивать широкий спектр микроводорослей, включая совместное культуры водорослей с не водоросли видов. Сначала фонда культуры выращиваются в бутылки производить посевным материалом для photobioreactor системы. Водоросли посевным материалом сконцентрированы и переданы фотобиореакторах для выращивания в пакетном режиме. Образцы собираются ежедневно для оптической плотности чтений. В конце пакетной культуры клетки собирают на центрифуге, промывают и лиофилизированный для получения окончательного сухого веса концентрации. Концентрация окончательный сухого веса используется для создания корреляции между оптической плотности и концентрации сухого веса. Модифицированный метод Folch впоследствии используется для извлечения общих липидов из лиофилизированной биомассы и экстракт assayed его нейтральной липидов содержимого с помощью Гонав пробирного. Этот assay были опубликованы ранее, но протокол шаги были включены здесь, чтобы выделить важнейшие шаги в процедуре, где часто возникают ошибки. Биореактор системы, описанные здесь заполняет нишу между простой настой выращивания и полностью контролируемые коммерческих биореакторов. Даже с только 3-4 биологического реплицирует за лечение, наш подход к культивирования водорослей приводит к жесткой стандартных отклонений в рост и липидного анализы.

Приложение микроводорослей в инженерии и биотехнологии привлекла большой интерес в последние годы. В настоящее время изучаются микроводорослей для использования в сточных вод лечения^1,2,3,4, биотоплива производство^5,6,7,8и производство пищевых добавок и других дорогостоящих продуктов^9,10. Водоросли также генетически изменяются большей скоростью в целях повышения их пригодности для конкретных инженерных приложений^11,12. Следовательно существует большой интерес к экспериментам с промышленно соответствующих организмов в контролируемых параметров. Цель этого метода является общаться эффективный подход к культуре микроводорослей в контролируемой лабораторной среде, а также для измерения роста и липидный нейтральными содержание этой водоросли. Улучшение роста ставок и содержание липидов нейтральных микроводорослей были определены как два основных узких мест к коммерциализации водорослей биотоплива¹³.

Широкий спектр подходов были использованы для культуры водорослей для экспериментальных целей. В общем эти подходы можно разделить между крупномасштабных выращивания и мелких Крытый культивирования. Выращивания в фотобиореакторах и открытых прудах подходит для экспериментов, направленных на расширение масштабов процессов, которые уже доказали в лабораторном масштабе (например, для проверки масштабов нового штамма высокой липидов водорослей)¹⁴. Однако крытый культивирования небольших уместно, при разработке новых или усовершенствованных водорослей штаммов или проведения экспериментов, направленных на понимание биологических механизмов. В этих последних случаях высокая степень экспериментальных управления требуется дразнить из тонкие изменения в биологических поведение. С этой целью стерильных культурах часто требуется для того, чтобы свести к минимуму комплекс биотические факторы, связанные с другими организмами (например бактерии, другие водоросли), которые неизбежно расти в крупномасштабных наружных систем. Даже при изучении взаимодействия среди водорослей и других организмов, мы обнаружили, что использование высоко контролируемых экспериментальных условиях полезно при изучении молекулярной обмен среди организмов^15,16,17.

В рамках категории мелких водорослей Крытый культивирования был использован целый ряд подходов. Вероятно наиболее распространенным подходом является для выращивания водорослей в колбах Эрленмейер шейкер таблицы под легкие банка^18,19. Путем пассивной диффузии через пены вилка в верхней части колбы происходит обмен кислорода и CO₂ . Некоторые исследователи улучшили эту структуру путем активного вентилирования флаконы²⁰. Другой подход заключается в том, чтобы культивировать водоросли в бутылки, смешанные перемешать бар и активного вентилирования. Несмотря на их простоту мы обнаружили, что использование настоев и бутылки часто приводит к непоследовательным результатам среди биологических реплицирует. Предположительно это из-за позиции эффекты - разные позиции получать различное количество света, которые также влияют на температуру внутренних реактора. Ежедневные вращения реакторов для новых позиций может помочь, но не облегчить проблемы, потому что некоторые этапы роста водорослей (например, рано экспоненциальное) более чувствительны к позиционной эффектов, чем другие (например, журнал фаза).

На противоположной стороне спектра технологической сложности являются полностью контролируемой коммерческих фотобиореакторах. Эти системы постоянно контролировать и корректировать условия в реакторе для оптимизации роста водорослей. Они имеют программируемые освещение, контроль в реальном времени температуры и контроля рН. К сожалению они являются дорогостоящими и обычно стоит несколько тысяч долларов в реактор. Большинство научных и технических журналов требуют биологических репликации результатов, требуя покупки нескольких биореакторов. Мы представляем здесь системы Реактор колонки пузыря, мосты разрыв между простой (колба) и сложные (полностью контролируемой биореакторе) подходит для выращивания водорослей лаборатории масштаба. Колонны пузырьковые использовать рост пузырьки газа для облегчения газообмена и смешивать реактора. Этот подход предоставляет некоторую степень контроля над освещением и температуры, но делает это в экономически эффективным способом. Кроме того мы нашли эту систему весьма последовательной результаты среди биологических реплицирует, сократить необходимое количество биологических реплицирует, необходимые для того, чтобы получить статистически значимые результаты, когда по сравнению с подходом колбу или бутылку. Мы также использовали эту систему успешно культивировать смеси водорослей и бактерий²¹. Помимо выращивания водорослей мы наметим процедура измерения содержания нейтральных липидов в культивированный водорослей. Последний метод был опубликован других²², но мы включают процедуры здесь предоставлять пошаговые инструкции о том, как успешно использовать его.

1. Установка столбца фотобиореакторах пузырь

1. Постройте набор вентилируемые крышки от пластиковые крышки, которые пришли с стеклянные бутылки 1 Л и гибридизации трубки (см. Рисунок 1 для схемы и фотографии). Конструкция крышки для увлажнителя, смешивая ловушки, каждый photobioreactor подъем воздуха и каждая бутылка реактора.
   1. ¼" отверстия в крышке: 2 отверстия необходимы для биореактора и увлажнитель крышки; 3 отверстия необходимо для смешивания ловушку.
   2. Скольжения ¼" кольцо через потоки 1/8" группа горе Луер примерки и вставьте это в ¼" отверстие в крышке (рис. 1A).
   3. Скольжения второй ¼" кольцо через потоки так, чтобы крышка зажата между двумя O-кольца. Скольжения контргайку на резьбу и затяните исправить Luer горе группа на месте.
   4. Защелкните стопорных колец на подвергаются мужчины Luer выходящий из крышки. Повторите шаги 1.1.2-1.1.4 для каждого отверстия в крышке.
   5. Для крышки, которые будут использоваться на пузырь столбец и бутылка реакторов, подключением 1/8" женский Luer Барб арматуры до 1,5" кусочки 1/8" ID ПВХ труб. Подключите их к каждому из подвергаются мужчины Luer фитинги на крышке.
   6. Подключение к свободный конец одной из 1/8" обратный клапан (указывая от крышки) штук.
      Примечание: Это будет служить в качестве выхлопной порт для биореактора.
   7. Подключите мужской Luer Барб, уместно второй кусок 1/8" НКТ, выходящий из крышки. Щелкните вращающейся стопорное кольцо на место и закрепите 0,2 мм воздушный фильтр к этому.
      Примечание: Это будет служить в качестве впускное отверстие для реактора.

Рисунок 1. Схема и фото для построения биореакторов. Схема (A) для строительства биореактор крышки (B) Фото крышки собрал биореактора и (C) Фото собраны крышки для увлажнителя. Обратите внимание, что увлажнитель фитинги следует покрытием в воды доказательство силиконовая обеспечить герметичное уплотнение с крышкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Соберите систему доставки воздуха (см. рисунок 2A и 2B схема и фото).
   1. Резьба NPT 1/8" приложите Барб фитинги для впуски и выпуски на задней части каждого ротаметрами.
      Примечание: 200-2500 см3/мин Расходомеры электронные для модуляции давления воздуха вверх по течению увлажнитель, Расходомеры электронные 100-1000 см³мин., бутылка реакторов, 50-500 см3/мин Расходомеры электронные предназначены для воздушных подъема биореакторов и 5-50 см³/ мин rotemeters предназначены для регулирования потока CO₂ . Рекомендуется к горе Расходомеры электронные к фиксированной поверхности (например пластиковый лист) так они не упасть во время операции.
   2. Выключите источник сжатого воздуха, а затем подключите ¼" ID гибкие ПВХ трубы к источнику сжатого воздуха с зажим шланга. Шаг вниз диаметр шланга 1/8" гибкие шланги ПВХ ID с помощью ¼" женский Барб фитинга и 1/8" мужской Барб фитинга.
   3. Подсоедините свободный конец трубки ID 1/8" входу ротаметр мин.³200-2500 см.
      Примечание: На выходе из этого ротаметр будет кормить увлажнитель бутылки через 1/8" ID трубы.
   4. Соедините трубы на входе вентилируемые крышку (использование женского Luer для Барб, уместно, чтобы сделать связь) 1/8». Затем подключите второй кусок 1/8" трубы внутри панель установки.
      Примечание: Эта часть будет висеть вниз в увлажнитель и пузырь воздуха через воду.
   5. Присоединение 1/8" женский Luer Барб арматуры на каждом конце кусок 1/8" ID трубы и использовать этот кусок для подключения на выходе из увлажнителя на входе смешивания ловушку.
   6. Таким же образом как 1.2.5 Подключите выход регулятора CO₂ на второй порт смешивания ловушку.
   7. Строительство коллектора, используя 1/8" труб и 1/8" многопортовые Барб (см. рис. 2 C) для подачи воздуха в банки ротаметрами.
      Примечание: Эти Расходомеры электронные будет использоваться для питания биореакторов. Избегайте создания более чем 6 Расходомеры электронные серии. Вместо этого используйте параллельные банки Расходомеры электронные для расширения системы. Убедитесь, что общий поток спроса на всех реакторов менее 2500 см3/мин (или иначе потребуются большие ротаметр вверх по течению от увлажнителя).
   8. Подключение розетки (3^rd порт) смешивания ловушки к недавно построенный ротаметр банки, используя 1/8" трубки и 1/8" женский Барб Luer.
   9. Подключение труб к розеткам каждого ротаметр в банке ротаметр для подачи воздуха в биореакторах достаточно длинный 1/8". Ярлык концы труб, а также Расходомеры электронные в банке.
   10. Применение воды доказательство силиконовая вокруг все порты на увлажнитель и смешивания ловушку крышками, чтобы убедиться, что они являются герметичность.

Рисунок 2. Схема и фото для монтажа системы колонки пузыря. (A) схема аэрации системы (B) Фото увлажнитель, смешивая ловушку и ротаметр банка и (C) Фото многообразий, используется для подключения ротаметр банки вместе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. Настройка баки рыб, движение плиты и огни (рис. 3).
   Предупреждение: Эта система требует большое количество торговых точек и цепи, достаточный для поддержки всех компонентов. Избегайте, нанизывая вместе несколько разветвителей питания и удлинителей в цепочке моды, потому что это электрическим током. GFI тип розетки и удлинители поощряется использование высоко из-за наличия воды в системе.
   1. Организовать низкопрофильные магнитные мешалки на ровной поверхности, достаточно прочной, чтобы выдержать вес водой рыбы цистерны.
   2. Место небольшие деревянные или пластиковые блоками (немного выше, чем движение плиты) по периметру перемешать пластин для поддержки веса рыбы цистерны.
      Предостережение: Избегайте рыбы цистерны непосредственно на движение плиты как вес будет раздавить их.
   3. Место рыбы цистерны над перемешать пластины и поддержка блоков и заполнить цистерны с водой.
   4. Отрежьте кусок жесткой пластиковый лист надеть поверх бак рыб как крышкой. Вырежьте отверстия в этой оболочке скользить гибридизации трубы внутри и вне. Также вырежьте отверстие нагревательного бака рыб.
   5. Организовать флуоресцентный свет банки рядом с бак рыб для горизонтального освещения биореакторов. Подключите света банк света таймера, чтобы установить дневной/ночной цикл.

Рисунок 3. Система схема для бутылки биореакторов (слева) и пузырь столбца фотобиореакторах (справа). Эта цифра была изменена от Хиггинс и др. ¹⁷. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. Подготовка микроводорослей посевным материалом

1. Получите микроводорослей посевным материалом от крио сохранились, хромированный или жидкие культуры.
   Примечание: Рекомендуется, что до использования в качестве посевным материалом, чтобы обеспечить жизнеспособные клетки и что в результате культура является стерильных покрываемые криоконсервированных организмов. Агар среднего (например., ATCC #5 спорообразующих агар)²¹ является богатой средой, которая работает хорошо для оживления видов хлореллы и Auxenochlorella от крио хранения.
2. Подготовьте 2.4 L минеральные среды, которая подходит для видов конкретной микроводорослей.
   Примечание: Примеры включают N8 средних²³ видов хлорелла, N8-NH₄ средних²¹ видов Auxenochlorella. Использование средства, подходящие для водорослей штамм является одним из наиболее важных шагов в обеспечении надежной водорослей.
3. Аликвота 2.4 L минеральные среды одинаково в три стеклянные бутылки 1 Л, добавить движение баров на каждой бутылке и собрать вентилируемые крышки (рис. 1) для каждой бутылки. Дважды проверьте, что трубка аэрации на входе и каждая бутылка имеет бар переполох в нем.
4. Автоклав фондовых бутылки, с использованием жидкого стерилизации цикла (121 ° C) для 30 мин автоклава 100 мл деонизированной воды (dH₂O) и некоторые 1,5 мл пробирок в то же время, который позднее будет использоваться для покрытия. Разрешить средне прохладной ночи. Кроме того охладить реактор до комнатной температуры и затем проветрить за 2 ч до прививки.
5. В области биобезопасности кабинета (BSC) прививать микроводорослей из плиты или стерильных жидких культуры в складе бутылки. Используйте метод стерильных стерильных культурах в следующих шагах.
   1. Добавьте 20 мл газобетона dH₂O в стерильных 50 мл пластиковых пробирок. Используйте Стерильные одноразовые цикл 10 мкл подобрать несколько одного колоний от пластины из шага 2.1. Окунуть цикла в 50 мл трубки и вымыть клетки водорослей в 20 мл газобетона dH₂O. Встряхните Тюбик 50 мл для получения однородной микроводорослей решения.
   2. Пипетка 6 мл раствора микроводорослей в каждой акции бутылку с 10 мл стерильной Серологические Пипетки. Вихрем бутылка равномерно смешать микроводорослей в среду.
6. Используйте 2 мл стерильного Серологические Пипетки рисовать 1 мл пробы из каждой акции бутылку и передачи в стерильных 1.5 мл пробирок.
   Примечание: Micropipettes не рекомендуются для этот шаг из-за риска заражения. Затяните вентилируемые крышки на складе бутылки.
7. Место фондовых бутылки на движение плиты (~ 150 об/мин) и отрегулировать скорость потока воздуха, CO₂и уровня освещения в зависимости от вида. Вращение штока бутылка позиции каждый день.
8. Разбавьте 1 мл образцов, полученных во время шага 2.6 (100-кратного разбавления в стерильной воде обычно хорошо работает) и распространение пластину на богатые агар среднего.
   Примечание: Эти таблички может использоваться для проверки случаев загрязнения также служить в качестве источника будущего водорослей посевным материалом для дальнейших экспериментов.
9. Брать пробы из бутылок (в BSC) каждые два дня для проверки роста водорослей.
   Поместите образцы в 96-луночных микропланшетов в трех экземплярах (200 мкл) и измерения оптической плотности (OD) 550 Нм и 680 нм каждые два дня до од достигает 0,2-0,3 (который обычно требует 5-7 дней).
10. Остановить инкубации и место фондовых бутылки на скамейке за 24-48 ч до позволить клеток водорослей селиться под действием силы тяжести.
    Примечание: Поселились клетки будут далее использоваться для инокуляции фотобиореакторах колонки пузыря. Если более быстрый сбор клетки, клетки могут центрифугируется на не более чем 1000 x g для сбора клеток.

3. Выращивание микроводорослей в фотобиореакторах колонки пузыря

1. За день до прививки биореактора, подготовить соответствующие средства массовой информации и передачи 200 мл (или желаемый объем) для столбца photobioreactor пузырь трубки (гибридизации трубки). Автоклавные трубки с средствами массовой информации и вентилируемые крышки на месте.
   Примечание: Если использование сточных вод в качестве среднего роста, автоклав пустой биореакторов и добавить стерильной фильтрации сточных вод (по желанию стерильных культуры).
2. Концентрат фондовой поселились микроводорослей, удалив супернатанта, с помощью вакуумного насоса. Оставляют меньше чем 100 мл среды в каждой бутылке, но избежать удаления поселились водоросли.
   Примечание: Проведение этой процедуры внутри BSC и следовать стерилизации. Простой Вакуумный аппарат может быть построено с помощью термос или бутылку. Вставьте стерильную серологические пипетки на конце трубы.
3. Приостановить и передаче суспензии водорослей стерильные 50 мл пробирок. Центрифуга на 1000 x g 5 минут, чтобы еще больше сконцентрировать водорослей.
4. В BSC удалите достаточно супернатант для достижения общего объема ~ 80 мл водорослей концентратов для 12 photobioreacters. Избегайте пылесосить, гранулы. Передать водорослей концентрат стерильный контейнер (или складе бутылка используется водорослей).
5. Добавьте 6 мл суспензии водорослей в каждой photobioreactor с 10 мл стерильной Серологические Пипетки.
6. Стерильные фильтр (0,2 мм шприц или вакуум фильтр) и добавить соответствующие суммы любых других соединений (например , запасы витамина) которые не могут быть газобетона.
7. Вихрем биореакторов смешивать водорослей в среду.
8. Нарисуйте образец 2 мл от каждого биореакторе с использованием Серологические Пипетки и передачи в 2-мл пробирку. Соберите образец 2 мл (в BSC) каждые 24 ч для мониторинга прогресса культуры. Проверьте образец для с помощью рН тест-полоски и отрегулировать реактора, при необходимости с 3 M NaOH или 3 М HCl.
9. Завинтите крышки биореактора и поместите все биореакторов в ванну водой бак рыб. Отрегулируйте аэрации, CO₂и освещение на соответствующий уровень для видов. Вращайте биореактор позицию каждый день после взятия проб (шаг 3,8).
10. Применить 200 мкл пример каждой культуры в трех экземплярах для скважин 96 хорошо микроплиты. Измерение оптической плотности (OD) 550 Нм и 680 нм.
    1. В последний день периода культуры Измерьте ОД под разрежения различных факторов (например, 1 x, 2 x, 4 x, 8 x, 16 x и 32 x) установить взаимосвязь между ОП и фактической сухого веса после сбора урожая (шаг 4).
11. Центрифуга 2-мл пробирку образца на 12000 g x 5 мин.
12. Фильтра супернатант через 0,2 мкм фильтром нестерильных шприцев и хранить супернатант (и Пелле, если это необходимо) не выше-20 ° C для длительного хранения и позднее анализ изменений в составе средств массовой информации.

4. урожай и сублимационной сушки биомассы микроводорослей

1. Измерить фиксированный объем культуры водорослей от каждого биореактор с мензурку (например, 160 мл от биореактор что первоначально содержится 200 мл среды) и передачи в центрифуге бутылки. Промойте мерного цилиндра с dH₂O между каждым измерением.
2. Центрифуги на 4,696 x g 5 мин отбросить супернатант пылесосом тщательно его вне.
3. Передать брикеты метками 50 мл трубки. Промойте центрифуги бутылки с dH₂O и передачи содержимого 50 мл трубки. Убедитесь, что объем всего трубки не превышает 45 мл.
4. Вымойте водорослей окатышей с dH₂O для удаления солей.
   1. Центрифуга 50 мл трубки на 4,696 g x 5 минут и удалить супернатант.
   2. Добавьте 40 мл dH₂O каждый Тюбик 50 мл; Вихрь смешивать. Центрифуга снова на 4,696 g x 5 минут и удалить супернатант.
   3. Повторите шаг 4.4.2.
5. Этикетки и весить пустой 15 мл пробирок на баланс 4-десятичное (этикетке трубки и крышкой и взвесить их вместе). Весят одна трубка культуры водорослей. Вес каждого 15 мл дважды, чтобы свести к минимуму ошибки.
6. После последнего вымыть удалить супернатант и добавить 7,5 мл dH₂O каждый Тюбик 50 мл. Вихрь и передачи суспензии водорослей в предварительно весил 15 мл пробирок. Промойте трубы 50 мл с дополнительным dH₂O и переноса жидкости для 15 мл пробирок. Избегайте, превышающих 12 мл общего объема в 15 мл пробирок.
7. Центрифуга для 15 мл пробирок на 4,696 g x 5 мин и сцеживаться супернатант. Замораживание труб с окатышей на-80 ° C для по крайней мере 30 минут в рамках подготовки для.
8. Замораживание сухой на ночь, или пока не сушат.
9. Весят и записывать лиофилизированный 15 мл пробирок с водорослями.

5. липидов извлечение с помощью метода изменения Folch²⁴

1. Весят из 20 мг лиофилизированных водорослей биомассы в 2 мл колпачок полипропиленовые трубы (проверка производителя метка чтобы убедиться, что продукт подходит для экстракции шарик).
2. Добавьте 1,5 мл растворителя Folch (2:1 хлороформ/метанола) в каждой 2-мл пробирку (который содержит 20 мг лиофилизированных водорослей). Наливайте ~0.5 мл цирконий/кремнезема бусины (0.5 мм) в каждую пробирку, до тех пор, пока уровень жидкости в трубе достигает 2 мл.
   Предупреждение: Обрабатывают хлороформом и метанола в зонта и избегать вдыхания паров или контакт с кожей.
3. Однородный образцы водорослей в бисерная мельница для 20 s со скоростью 6,5 м/с. Передача трубок для льда для 30 s для охлаждения образцов. Повторите пять раз для полного извлечения липидов.
4. Через шприц 5 мл, содержащего диск сетки проволока из нержавеющей стали (#60 меш) штамма из бисера, сбора фильтрата в 15 мл фильтр огневки.
5. Вымойте бусины с 1,5 мл растворителя Folch, проталкивая жидкость с шприц при необходимости. Повторите это мыть два раза и собирать все фильтрата в 15 мл трубки, уступая окончательный объем примерно 6 мл.
6. Добавьте 1,2 мл 0,9% раствора NaCl Folch экстракт в 15 мл (w/v) и вихревой хорошо перемешайте.
   Примечание: При необходимости, более Folch растворителя может использоваться для мытья бусины (использование 0,2 x объем всего мыть 0,9% раствор NaCl побудить разделение фаз).
7. Центрифуга для 15 мл пробирок на 6000 x g для 5 минут записи нижней хлороформ (зеленый) фаза тома ближайших 0,1 мл, с использованием линий на стороне 15 мл. Передача этапа снизу к стеклянный флакон (с крышкой) с помощью стеклянной пипетки Пастера.
8. Храните липидов при-20 ° C или (-80 ° C, если планируется использовать этот экстракт для анализа жирных кислот).

6. нейтральная Assay липидов с помощью метода Гонав (адаптировано из Хиггинс et al. 2014²²)

1. Подготовка запасов решений. Подготовка 10 мл 1 мг/мл растительного масла стандарта в хлороформе и хранить при температуре от-20 ° C.
   Примечание: Любое растительное масло может использоваться в этот assay, потому что он не чувствителен к типам жирных кислот. Подготовка 10 мл 200 мкг/мл раствора красный Нила в диметилсульфоксида (ДМСО) и хранить в темноте при комнатной температуре.
2. Блок предварительного подогрева сухого Гонав до 55 ° C в зонта. Хотя это Отопление, разбавить экстракты липидов и растительное масло стандартные 3 раза с метанолом.
   Примечание: Этот разрежения могут быть изменены на основании содержания липидов морских водорослей, но этот уровень хорошо работает для большинства хлореллы.
3. Для каждого образца, разбавленным добавьте 80 мкл 96 хорошо полипропиленовые Гонав в составленном.
   Предупреждение: Использование вспененный пластик не рекомендуется для использования с органическими растворителями.
4. Для пустых растворителя применяются 80 мкл 2:1 метанол/метилхлороформа в составленном. Для стандартов добавьте 10, 30, 60, 90 и 120 мкл разбавленного растительного масла в составленном.
5. Место микроплиты в сухой блок отопителя при 55 ° C для 20-30 мин, пока испарится весь растворитель. В то время как растворитель испаряется, подготовить рабочие Нила Красного раствора (необходимо 200 мкл 1 мкг/мл раствора на пластины хорошо). В качестве примера двенадцать образцов и полный набор стандартов требует 16 мл раствора 1,0 мкг/мл; Подготовка путем растворения 80 мкл акций 200 мкг/мл (в ДМСО) в 16 мл dH₂O.
6. Удалите микроплиты из блока Отопление и Остудите до комнатной температуры. 30 мкл изопропиловый спирт для каждой скважины и смешивать, закупорить вверх и вниз. Обеспечить все каналы пипеткой перемешивания раствора и resuspending липиды, уступая однородная зеленая жидкость.
7. Добавьте 200 мкл Нила красный раствора (1 мкг/мл) в каждый хорошо, Пипетка, вверх/вниз 10 раз перемешать. Инкубируйте пластину для 5 мин при комнатной температуре. Во время ожидания, подготовьте раствор отбеливателя 50%, смешивая отбеливатель (6% гипохлорита) с dH₂O. 20 мкл за также необходимы. Подготовка 3 мл 50% отбеливателя является достаточным для 12 образцов и полный набор стандартов.
8. Добавить 20 мкл раствор отбеливателя для каждого Гонав хорошо и Пипетка вверх и вниз 5 раз, чтобы перемешать. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре.
9. После 30 мин, читать флуоресценции в образцах каждые 5-10 мин на 530 Нм возбуждения/575 Нм выбросов с автоматической отсечки равным 570 Нм до тех пор, пока сигнал от водорослей образцов стабилизируется. Как правило 60 мин всего инкубаторов является достаточным.
10. Создайте Калибровочная кривая для стандартов растительного масла (в диапазоне от 0-40 нг/скважины).
    Примечание: Линейный подходят хорошо работает для низкого (< 30 нг/хорошо) концентрации нефти и полином подходят может использоваться, если стандартом превышает 30 нг/хорошо. Используйте этот корреляции для количественного определения нейтральных липидов в скважинах образца.

Эта процедура дает время курса водорослевого оптической плотности данных од 550 Нм (рис. 4A). Оптической плотности и сухой вес концентрации, данные могут быть связаны (рис. 4В). Это достигается путем первого расчета концентрации водорослей окончательный сухого веса после Плаурайта шаг. Далее можно соотнести оптической плотности культуры серийный разрежения (выполняется в последний день отбора проб) и концентрации фактических сухого веса. Для низких клеток концентрации линейной корреляции может использоваться в то время как второй порядок полинома корреляции могут использоваться для более высокие концентрации клеток. Рекомендуется создать отдельный корреляции для каждого состояния культуры. Наконец корреляции может применяться к данным оптической плотности времени курс для получения кривой роста сухого веса (рис. 4 c). В этом примере эксперимент, Auxenochlorella protothecoides (²⁵Ютекс 2341) был культивированный под четыре условия: стерильных управления культур, выращенных на свежие N8-NH₄ средних²¹, Сопредседатель культуры с бактериями облегчает brasilense, в среде дополнена 50 мг/Л индол-3-уксусной кислоты и провел на средних с A. brasilense. A. brasilense , как известно, производят индол-3-уксусной кислоты, роста растений, содействии гормона, что также способствует росту в некоторых микроводорослей. Однако на уровне 50 мг/Л, IAA лечения полностью препятствует A. protothecoides роста. Следовательно оптической плотности данных был доступен, но количество водорослей было недостаточным для получения точного сухого веса концентрации. В этом случае могут быть применены корреляции для управления культуры или оптической плотности данных может быть передана непосредственно. Потому что ОД данные были собраны на обоих 550 Нм и 680 нм поглощения, либо набор данных может использоваться для корреляции между ОП и сухого веса. Как правило ОД 550 используется потому, что он почти полностью исключает поглощения хлорофилл²⁶, таким образом подавления смещения от изменений в содержание хлорофилла. В отличие от OD 680 включает поглощения хлорофилла и высокое соотношение ОД 680/550 свидетельствуют о высокой хлорофилла в водорослях. Рисунок 4 d показывает набор двенадцать культур водорослей, растущих в фотобиореакторах колонки пузыря. Даже с только три биологических реплицирует за лечение были достигнуты туго стандартных отклонений, позволяя для высокой чувствительности различия между процедурами.

Рисунок 4. Рост водорослей результаты в фотобиореакторах колонки пузыря. (A) оптической плотности (550 Нм) кривая роста Auxenochlorella protothecoides (Ютекс 2341) показывает культур, введя конце логарифмического роста на 120 часов. Управления культуры были выращены на свежие N8-NH₄ средних, лечение 1 Сопредседатель культуры а. protothecoides и облегчает brasilense вырос на свежие N8-NH₄ средних, лечение 2 стерильных A. protothecoides выросла N8-NH₄ средних дополнена индол-3-уксусной кислоты 50 мг/Л (IAA) и лечение 3 — стерильных A. protothecoides , выращенных на отработанного среднего от A. brasilense. Отработавшего среднего был подготовлен культивирования A. brasilense 96 часов на N8-NH₄ средних дополнена яблочнокислая кислота 2 г/Л. Клетки были удалены и носитель был повторно дополнениями с аммония восстановить его первоначальный уровень, рН была скорректирована, и средство было стерильного отфильтрованного (0,2 мкм). Обратите внимание, что 50 мг/Л IAA лечения полностью препятствует росту водорослей. (B) корреляции кривых между од 550 Нм и окончательный сухого веса концентрации с использованием второй порядок полинома fit. Никакой корреляции показана для лечения 2, потому что без водорослей могут быть собраны в конце периода культуры. (C) применение полиномиальной корреляции данных оптической плотности дает кривая роста концентрации сухого веса на оси y. Корреляции культуры управления был применен к ОД данные для лечения 2. Планки погрешностей, стандартных отклонений, основанный на 3 биологических реплицирует. (D) Фото фотобиореакторах колонки пузыря вскоре после прививки культуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Для двух экспериментов пример на рис. 5показана липидный нейтральными данных. Было показано, что этот assay хорошо коррелируют с содержание нейтральных липидов, а особенно triacyglycerol (TAG). Это можно увидеть, сравнивая пробирного нейтральных липидов (Рисунок 5A) к соответствующим пластины хроматографии тонким слоем (Рисунок 5B). Та же тенденция можно увидеть во втором эксперименте (рис. 5 c и 5 D). Во всех этих экспериментов рапсовое масло используется в качестве стандарта и привели к линейной корреляции (R² 0,98 за первый эксперимент и 0.99 для второго) между флуоресценции и рапсовое масло массы в колодец. Обратите внимание, что если все образцы имеют содержание низкой липидов, затем наивысшей точки или два на стандарт может быть удален. Это соотношение может использоваться для вычисления количества нейтральных липидов (мкг) в каждом из водорослей образца скважин. Затем нефть массы могут быть преобразованы в концентрации в экстракте липидов, применяется к микроплиты хорошо. Это значение умножается на коэффициент разбавления используется (например, 3 x) для получения нейтрального липидов содержание оригинального Folch экстрактов. Эта концентрация затем умножается объем экстракт (должно быть близко к 4 мл) и затем делится на общей массы водорослей биомассы, используемой для извлечения липидов (должна быть близка к 20 мг). Результатом является нейтральной липидов содержание микроводорослей.

Рисунок 5. Липидный нейтральными данные получены из культур хлорелла sorokiniana (2714 Ютекс). (A) содержание нейтральных липидов (% сухого веса) для водорослей в эксперимент 1 в котором водоросли были выращены на 120 часов. Культура управления была стерильных и культивировали свежие N8 средних²³, лечение 1 совместно культура C. sorokiniana и A. brasilense на свежие N8 носителе, лечение 2 был свежий среднего N8 с 50 мг/Л МАА и лечения 3 было потрачено Средний с A. brasilense. Отработавшего среднего был подготовлен культивирования A. brasilense 96 часов в среде N8, дополнена яблочнокислая кислота 2 г/Л, удаление клеток, дополняющего потеряли нитрат, корректировки рН и стерильной фильтрации среднего (0,2 мкм). В отличие от A. protothecoides50 мг/Л МАА не подавляют рост C. sorokiniana . (B) TLC пластины изображение эксперимент 1 показаны относительные тег изобилия. (C) содержание нейтральных липидов (% сухого веса) для водорослей в эксперименте 2 который же лечения как эксперимент 1 но клетки были собраны после 72 часов роста. (D) TLC пластины изображение для эксперимента 2 показаны относительные тег изобилия. Планки погрешностей, стандартных отклонений, основанный на 3 биологических реплицирует. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Кроме того, это хорошая практика, чтобы вычислить коэффициент вариации (стандартное отклонение, деленное на среднее) сырье флуоресценции чтений во всех технических реплицирует в assay нейтральных липидов. Предполагая, что в микроплиты в составленном как указано в процедуре были проведены технические реплицирует, коэффициент вариации обычно не должна превышать 10%. Высокие коэффициенты вариации обычно являются результатом плохого смешивания (особенно во время добавления изопропиловый спирт) и потенциально неточное использование многоканальных дозаторов.

Самым важным соображением при культивировании водорослей является понимание конкретных потребностей организма или группы организмов. Водоросли выращивания системы, описанные здесь могут быть использованы для культуры широкий спектр водорослей, но конкретные абиотические факторы (температура, СМИ, рН, интенсивность света, CO₂ уровня, аэрации ставка) должны быть приспособлены к потребностям организма. Обратите внимание, что параметры, описанные здесь использовались для выращивания хлореллы и Auxenochlorella. Потому что они терпимы к высокой питательной, света и температуры уровнях²⁷промышленный интерес представляют эти организмы. Однако уровень освещенности можно сократить за счет удаления флуоресцентных ламп и дневной/ночной цикл может быть скорректирована представлять сезонности. Аналогичным образом нагреватели воды может быть включен вверх или вниз элемента управления ванны температура воды в системе. В то время как система, описанная здесь не используют такую возможность, это возможно для охлаждения ванны водой бак рыб ниже комнатной температуре через систему охлаждения лоу кост. Место ведро воды в небольшой холодильник и использовать воду для насос переменной скоростью из ведра холодной воды для бак рыб и обратно. Насосных быстрее, станет холоднее водохранилище бак рыб.

Хотя система выращивания водорослей обычно предоставляет согласованные результаты, существует несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, вода сифонирования, что происходит в случае, что аэрационная система испытывает внезапной потери давления (например, выдувные установки или сбою компрессор воздуха). Давление, которое находится в увлажнители будет толкать увлажнитель воды обратно через трубку, в том числе через ротаметрами. Установка вверх ловушку или обратный превентор может помочь. Обратите внимание, что сифонирования не окажет воздействия биореакторов, сами, потому что они работают при атмосферном давлении. Профилактический осмотр трубопроводов и арматуры могут помочь облегчить сбоев системы. Еще одним важным соображением является регулярно инспектировать и заменить воздушные фильтры и клапаны на биореакторов. Не забудьте следовать рекомендациям производителя на количество допустимых циклов автоклава. Это особенно важно, если обслуживание стерильных культур имеет решающее значение для эксперимента. Наконец мы рекомендуем вам приобрести или построить Автоклавируемая Подставка для безопасной транспортировки биореакторов между водяные бани, автоклавы и биобезопасности кабинета. Нержавеющей стальной решетке может служить этой цели.

Биореактор системы, описанные здесь, имеет несколько ограничений. Основным ограничением является необходимость обрабатывать реакторов в кабинете биобезопасности, используя стерильную методику. Реакторы отсутствие анти сифонирования выборки порт, требуя от пользователя для перемещения реактора к биобезопасности кабинет образца не загрязняя культуры. Реакторы также требуют ручной pH чтение и перестройки, которая вводит потенциал человеческой ошибки.

Биореактор системы, описанные здесь заполняет нишу между простой настой культивирования и полностью контролируемые биореакторов. Биореактор система была разработана в ответ на потребность в более устойчивые результаты, чем были достижимы с помощью бутылки. Данные показывают, что эта система генерирует результаты последовательного роста при нормальной эксплуатации. Обратите внимание, что газированных бутылки были заняты в процедуре для выращивания водорослей акций, но это было сделано только производить посевным материалом для эксперимента. Это приемлемо, поскольку запасов бутылки были объединены для прививки и следовательно изменчивости среди реакторов не является проблемой.

Как многие исследователи водорослей заинтересованы в мониторинг роста и содержание нейтральных липидов, мы включили наш подход к измерению обоих этих параметров. Использование оптической плотности для измерения роста является стандартной практикой и не имеет аналогов в своей простоте. Однако корреляции между сухого веса и оптической плотности меняться со временем и зависит от условий культуры. Рекомендуется производить уравнение корреляции для каждого экспериментального лечения в течение каждого опытной партии. Это возможно в рамках предлагаемой процедуры, потому что лиофилизированный водоросли будут получены после каждой культуры эксперимент. Критического подхода оптической плотности предполагается, что корреляция между оптической плотности и сухой вес держит постоянное течение пакетного роста. До тех пор, как отклонения от этого предположения являются небольшими, результат будет достаточно точной. Относительная точность могут быть оценены путем сопоставления концентрации сухого веса вычисляемый водорослей во время ноль. Предполагая, что культуры были хорошо смешанных и дозирования была точной, все культуры должны иметь одинаковую плотность первоначальный прививка. Оптическая плотность подход также может быть оспорено, при высокой оптической плотности фона среды (т.е. при работе с определенным сточных вод). Вычитание среднего поглощения (перед прививкой) от каждого чтения ОД может помочь с этой проблемой.

Извлечение липидов из сухих водорослей придерживается устоявшихся подход Folch^21,24; Однако существуют важные соображения. Видов различных водорослей имеют различные клеточные стенки с различной степенью вязкости. Цирконий/кремнезема бусины, используемый здесь остры и предназначены для прокалывания сильный, полисахарид клеточной стенки. Мягкий шарик тип (например, стекла) или меньше шарик нарушения циклов может использоваться на водоросли с слабее клеточной стенки. Однако правило является, что результирующий Пелле клеток после экстракции должны быть свободны от пигмента, указав, что все хлорофилла было извлечено. Одним из наиболее распространенных источников сбоя на этапе извлечения липидов происходит из-за неправильного Замораживание сушки. Если образец тает в замораживании сушилки до того, как он полностью высохнет, результат будет очень трудно, темные, восковой Пелле. Это результат клеток, которые лизированы условиях вакуума заморозки сушка. Гранулы могут быть весил для получения сухого веса, но он не может использоваться для извлечения липидов, как восковые частицы не сломать в Folch растворителя. Чтобы убедиться, что что сублимационной сушки всегда дает мягкий, порошкообразных образцы, важно заморозить все образцы до-80 ° C и незамедлительно передавать их замораживание сушки. Кроме того с использованием парафина (с отверстием ткнул в нем) вместо крышки ослабил трубки обеспечит что влаги может непрерывно удалены из образца до того, как он тает.

Assay нейтральных липидов, описанные в этой процедуре был опубликован ранее и включает обсуждение альтернативных липидного анализы²². Однако некоторые важные улучшения были внесены в процедуры после опубликования. Прежде всего концентрация Красного раствора Нила было увеличено с 0,5 мкг/мл до 1 мкг/мл. Эффект этого изменения является более высокой интенсивности сигнала, улучшенная воспроизводимость и устранение сигнал снижение со временем во время инкубационного периода. Результаты показывают, что assay сравнивает также результаты от качественного тонким слоем хроматографии. Этот assay был разработан и проверен с помощью различных видов хлореллы и Auxenochlorella , поэтому его применимость к видов значительно различного состава не было определено. Все зеленый пигмент полностью исключить из анализа во время инкубации отбеливатель, приводит примеры, которые ясно или очень бледно желтый. Также, обратите внимание, что липидов экстрактов, которые обычно являются деградированных (как указано на переход от зеленого до коричневого цвета) не в состоянии поставить точные результаты в этот assay. Таким образом важно, чтобы хранить образцы липидов в не выше-20 ° C в темноте.

Методы, представленные здесь для культивирования водорослей, измерение роста и количественного определения нейтральные липиды являются полезными для различных инженерных приложений водорослей, но особенно подходят для исследований в области производства биотоплива. Эти методы используются также для изучения торможение роста водорослей на сточные воды²⁸ , а также последствия взаимодействия организма на рост и состав микроводорослей.

Авторы не имеют ничего сообщать.

USDA национального института продовольствия и сельского хозяйства Hatch проекте ALA0HIGGINS и отделениями университета Оберн Провост, вице-президент по исследованиям и Самуэль Ginn инженерного колледжа была оказана поддержка для этого исследования. Поддержка была также оказана NSF Грант CBET-1438211.