Bir Ex Vivo doku kültürü modeli Fibrovascular komplikasyon proliferatif diyabetik retinopati

Burada, proliferatif diyabetik retinopati Patofizyoloji üç boyutlu yerel doku karakterizasyonu ve ex vivo kültürü için hasta kaynaklı, cerrahi olarak eksize, fibrovascular dokuları kullanarak eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu ex vivo kültür modeli sınama veya yeni tedaviler geliştirmek için mükellef da.

Diabetik retinopati (DR) diyabet en yaygın mikrovasküler komplikasyon ve bir çalışma çağındaki erişkinlerde körlük neden olur. Diyabet ve oksijen kaynaklı retinopati geçerli hiçbir hayvan modelleri insan proliferatif diyabetik retinopati (PDR) tecelli tam menzilli ilerici değişiklikleri geliştirmek. Bu nedenle, hastalığın patogenezi ve patofizyolojisi anlayışı histolojik kesitler ve yalnızca ilgili patojenik etkenlere kararlı durum bilgi sağlayan yaklaşımlar vitreus örnekleri üzerinde büyük ölçüde güvendi. Kanıt artan dinamik hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matriks (ECM) etkileşimleri bağlamında üç boyutlu (3D) microenvironments yeni mekanik ve fonksiyonel çalışmalar geliştirilmesi için gerekli olduğunu gösterir tedavi stratejileri. Bu nedenle, cerrahi olarak PDR ile gözlerden eksize patolojik fibrovascular doku yıkıcı bu hastalığın hücresel ve moleküler mekanizmaları güvenilir bir şekilde çözmeye ve Roman klinik için potansiyel test etmek için yararlanılabilir ki biz olan müdahaleler. Bu sonlarına doğru biz ex vivo kültür insan PDR patofizyolojisi ilgili bir model olarak hizmet edecek cerrahi olarak eksize hasta kaynaklı fibrovascular doku (FT), 3D için yeni bir yöntem geliştirdi. FTs explants disseke ve ex vivo kültür ve 3D karakterizasyonu fibrin matris için gömülü. Bütün Dağı ayirt yerli FTs ve son nokta kültürlerin kapsamlı soruşturma doku kompozisyon ve 3D doku düzeyinde karakterizasyonu ortaya çıkarılması ilgili özellikleri için önemini vurgulayarak çok hücreli süreçlerin sağlar PDR patofizyolojisi. Bu model moleküler mekanizmaları, cep/doku süreç ve tedaviye yanıt-e doğru aynı zamanda yapılan değerlendirme PDR doku mimarisi ve microenvironment içinde dinamik biyokimyasal ve fiziksel etkileşimleri karmaşık bağlamında sağlayacaktır. Bu model PDR patofizyolojisi beyannamedir yana Ayrıca sınama veya yeni tedaviler geliştirmek için müsait olacak.

DR diyabet, son üç yılda¹büyük oranlarda ulaştı bir hastalık ciddi bir oküler komplikasyondur. Yirmi yıl sonra tanı, diyabet tip 1 ve tip 2 diyabet retinopati şeker hastalığı başına bir lider yapmak, mevcut belirtileri ile % 60 hastaların hemen hemen her hastada yaş yetişkin²çalışma körlüğü neden olur. Mikrovasküler dejenerasyon ve iskemik hasar düzeyine göre DR Proliferatif DR (non-PDR) ve Proliferatif DR (PDR) sınıflandırılır. Son aşama hastalığı, PDR, iskemi ve inflamasyon indüklenen neovaskülarizasyon ve fibrotik vitreus arayüzü ile karakterizedir. Tedavi edilmemiş koşullarında, bu işlemlerin körlüğü nedeniyle vitreus kanaması, Retina fibrozis, tractional Retina dekolmanı ve neovasküler glokom^3,4yol açar. Son gelişmeler rağmen mevcut tedavi seçenekleri sadece DR aşamaları Retina hasar zaten ortaya çıkan zaman Diyabetik Makula ödemi ve PDR, dahil olmak üzere, hedef. Ayrıca, DR hastaların büyük oranda gelişmiş tedaviler^4,5,6için acil bir ihtiyaç gösteren geçerli tedavi armamentarium yarar değil.

Tarihi için birden çok diğer benn vivo hastalık/gelişimsel modeller ve diyabetik hayvan modelleri geliştirilmiştir, ama hiç biri tam kapsamlı patolojik özellikleri insan PDR^7,8' gözlenen beyannamedir. Ayrıca, kanıt artan ECM kompozisyon yanı sıra mekansal düzenleme ve hücresel ve acellular microenvironment⁹arasındaki etkileşimi tedavi yanıt sıkıca bağlı olduğunuzu belirtir. Biz bu nedenle, genelde vitrektomi PDR¹⁰cerrahi yönetiminin bir parçası olarak gören gözlerinden eksize FT patolojik malzeme insan PDR klinik bir model geliştirmek üzere yola çıktı.

Bu el yazması için 3D ex vivo kültür protokolünü açıklar ve cerrahi-varlığına, PDR karakterizasyonu hasta patolojik FT kaynaklı. Burada açıklanan yöntemi gösterdi yerli 3D PDR doku peyzaj başarılı deconstruction ve tekrarlama PDR patofizyolojisi anjiogenik ve fibrotik anormal gibi özelliklerinden son yayında kullanılan vasküler yapılar¹¹. Bu model ayrıca apoptozis ve yayılması gibi vasküler adacık oluşumu¹¹kolayca--dan ince histolojik kesitler, gibi dağınık şekilde takdir edemez roman özellikleri sınırlı saptandı. Vitreus sıvısı başarıyla başkaları tarafından kendi anjiogenik potansiyel değerlendirmek için 3D endotel küresel kültür ve angiostatic molekülleri¹²etkinliği üzerinde kullanılmıştır. PDR vitre uyarıcı kullanarak tahlil çimlenme vitro 3D lenfatik endotel hücre (LEC) küresel ile birleştirildiğinde, bizim model as için neovasküler doku içinde de yerel olarak ipuçları her iki çözünür vitreal katkısını faktörler ortaya Henüz kötü anlaşılır LEC katılımı PDR patofizyolojisi^3,11. PDR yönetiminde, vitreus cerrahi düzenli olarak gerçekleştirilen henüz zorlu işlemdir. Cerrahi cihazların ve teknikleri sofistike ve sürekli ilerleme görmek gibi fibrovascular proliferatif numune zamanında ve muhafazakar kaldırılması sadece vizyon sonucu artırır ama da için paha biçilmez doku materyalleri sağlar canlı insan dokusu microenvironment karmaşık translasyonel yönleriyle PDR patofizyolojisi ve tedavi yanıtlarının incelenmesi.

Bu araştırma Kurumsal değerlendirme Komitesi ve Helsinki Üniversitesi Hastanesi etik kurul tarafından kabul edildi. İmzalı onay her hastadan elde edildi.

1. hazırlık çözümler, medya & donanım

1. Hızlı işleme emin olmak için fibrovascular doku (FT) topluluğu önce aşağıdaki donanımları hazırlamak.
   1. Steril-otoklav iki mikrodiseksiyon cımbız.
   2. 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 1 önceden ağırlığını PBS (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M PO₄^-3) 900 ml deiyonize su ve erimesi için karıştırın tablet çözülerek hazırlayın. 1 L ve steril-otoklav hazır çözüm kadar su sesi ayarlayın. Mağazada RT.
   3. Yukarıda belirtilen çözüm ve ekipman tek kullanımlık steril neşter, steril 6 cm hücre kültür çanak ve beş steril 12-şey hücre kültür tabak bir sepette toplamak.
2. 6 mg/mL 5 mL HBSS, bir su banyosu için en az 1 h 37 ° C'de içine dalmış bir 50 mL tüp kullanarak de içine insan fibrinojen plazminojen tükenmiş 30 mg çözülerek fibrinojen çözüm içinde Hanks dengeli tuz çözüm (HBSS) hazırlayın.
   Not: Bu çözüm 7 h (maksimum 10 h) su banyosu (37 ° C) kullanmadan önce tutulabilir.
3. Eski hazırlamak vivo kültür % 5 fetal buzağı serum (FCS) veya % 5 insan serumu, %0,4 endotel hücre büyüme ek, 10 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü, 1 μg/mL hidrokortizon ve 50 μg/mL viomisin için piyasada bulunan ekleyerek orta endotel hücre büyüme orta ve su banyosu kullanımı kadar 37 ° C'de unutmayın. 4 ° C'de için bir ay kadar saklayın.

2. fibrovascular doku diseksiyon

1. Eksize fibrovascular doku (FT) insan denekler trans konjonktival microincision vitreus, 23 ya da 20 gauge üç-port pars plana vitrektomi PDR vitreus cerrahi yönetiminin bir parçası olarak tarafından ameliyat toplamak.
   Not: FT segmentasyon ve delaminasyon, microscissors ile seçin ve göz içi microforceps sonu sürükleyici ile vitreus kavite kaldırıldı deneyimli vitreus cerrah tarafından kesme kullanarak çıkardım. Aşırı kaygı sağlam, hasarsız FT optik sinir veya patolojik neovasküler doku en sık yerleştirildiği zamansal vasküler arcade dahil olmak üzere oküler yapılar zarar vermeden kaldırmak için alınması gerekir. Çıkarılan doku boyutunu değişkendir genellikle 3 ve 50 mm²arasında değişen.
2. 6 cm hücre kültür çanak veya 1,5 mL tüp 1 mL steril PBS ıslak buz üzerinde yerleştirilen içeren FT tutmak ve hemen işleme için laboratuvar araştırma için aktar.
   Not: Bu araştırma birimi (laboratuar imkanları) fiziksel küçük eksize ft aktarım süreleri en aza indirmek için (veya) Hastanesi ameliyathane yakın olduğunuzu esastır. Bu durumda transfer az 5 dakika sürer ve explants fibrin içinde genellikle cerrahi kaldırıldıktan sonra 1-1.5 saat (maksimum 2 h) katıştırılır. Daha uzun aktarım süreleri 3D kültür üzerine etkisini test edilmesi gerekir.
3. FT PBS 1 mL (RT, 25 ° C) Oda sıcaklığında içeren 6 cm hücre kültür tabağına koyun ve 5 x amacı ile bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak doku görüntüleri.
   Not: Resimler niteliksel değerlendirmesi ve belgeler için alındı. Doku boyutu, yoğunluk ve genel kompozisyon (Örneğin, vasküler yapılar) gözlemlemek mümkün.
4. FT² adet steril neşter ve mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak bir dik diseksiyon stereomicroscope altında ~ 1 mm kesti. PBS, mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak yerde içinde de sular altında doku, tutun ve açık kesim steril neşter kullanarak gerçekleştirmek. Bu yerel fibrovascular yapıları değiştirecek FT, yırtılma önlemek.
5. Her bireysel parça 1 mL steril PBS içeren 12-şey hücre kültür plaka bir kuyunun içine yerleştirin.
   Not: gerekirse, nazikçe keser gerçekleştirmeden önce mikrodiseksiyon Cımbız kullanarak FT levha üzerine yayıldı.

3. döküm dik Fibrin jel damlacıkları yerli FT ve Ex Vivo kültür karakterizasyonu için

1. Steril-filtre bir 10 mL şırınga monte adım 1.2 0,22 mikron filtre ile hazırlanan hazır fibrinojen çözüm.
2. Hazırlama aliquots fibrinojen çözüm (1,5 mL tüp başına 25 μL) ve tutmak RT. Prepare fibrin için bir aliquot, jel / her FT parça diseksiyon sonra elde edilen ve fibrin test etmek için ilave aliquots birkaç jel oluşumu.
3. Prepare Trombin ve 400 μg/mL aprotinin, 4 adet/mL içeren HBSS bir çözüm ahiret TA çözüm aradı ve RT. hazırla gerektiğinde bağlı olarak diseksiyon sonra elde edilen parça sayısı kadar TA çözüm tutmak (25 μL TA çözüm kullanılan her biri için FT/fibrin jel) ve fibrin jel oluşumu test ve yeterli bir çözüm fibrin jel damlacıkları döküm boyunca kullanılabilir olmasını sağlayabilmek için ilave bir miktar (Örneğin, 250 μL).
   Not: aprotinin fibrin jel bozulma önlemek için hücresel proteaz FTs^13,14tarafından ifade tarafından eklenirken Trombin fibrin polimerizasyon için gereklidir.
4. Fibrin jel oluşumu zamanlaması test: 25 μL TA çözüm 3.2 adımda hazırlanan bölünmemeli 25 μL fibrinojen çözüme ekleyin ve başka bir pipet için 50 μL ayarla kullanarak, pipetting tarafından tüp içinde karıştırın ve bir 6 cm hücre kültür tabak içine dağıtmak , dik bir damlacık şekillendirme.
   Not: Fibrin jel oluşumu ~ 1 dk içinde gerçekleştirilmelidir. Bu 1,5 dakika sürer Trombin 3.3 adımda hazırlanan TA solüsyona konsantrasyonu daha fazla Trombin hisse senedi çözüm ekleyerek artırılabilir. Fibrin jel oluşumu içinde 1,5 dk oluşana kadar onda biri Trombin hisse senedi çözüm başlangıçta kullanılan hacmi, art arda, eklenebilir. Fibrin jel oluşumu için kültür, dimensionality üç kritik zamanı hızlı jel fibrin jel altına batan ve böylece hücre 2D plastik yüzeyi ile temas geliyor FT parça (içinde 1,5 dakika) oluşumunu önler Kültür plaka, 2D hücre adezyon ve akıbet yol açabilir.
5. Bir FT parça steril bir cımbız kullanarak 24-şey plaka bir şey merkezinde yer ve emiş gücü ft önlemek için 0,5-10 μL pipet ile pipetting tarafından herhangi bir aşırı PBS kaldırın. Doku için cımbız sopa durumda plaka üzerinde doku parçasının yerleşim yardım etmek için ek bir cımbız kullanın.
   Not: FT/fibrin jelleri 48-şey plaka üzerinde reaktifler kullanımını azaltmak için artığını. Ancak, bu alanı daha sınırlıdır ve temas iyi duvar gelirse fibrin yayılır gibi daha zor.
6. 25 μL fibrinojen çözüme adım 3.2 bölünmemeli 25 μL TA çözüm ekleyin ve başka bir pipet kullanarak tüp içinde 50 μL karışıma pipetting tarafından ayarlayın. Plaka üzerinde iyi yerleştirilmiş FT parça dağıtmak ve 3D çevre matris FT ila sağlayan dik damlacık içinde FT parça eklemek için pipet aşağı yukarı 2 - 3 kez.
   Not: FT pipetting sırasında emişli değil ve hiçbir hava kabarcıkları oluşmuş olun. Ayrıca 1,5 dk içinde fibrin jel oluşturacak gibi karıştırma, kader ve pipetting hızlı bir şekilde adım 3.4 test olarak gerçekleştirilmesini sağlamak. Fibrin jelleri 48-şey plaka üzerinde döküm gerekiyorsa, fibrinojen çözüm 20 μL ve 20 μL TA çözüm kullanın.
7. 3.5 ve 3.6 FT parçalar için yineleyin.
8. Plakayı %5 CO₂ile oksijen bir atmosferde 37 ° C'de bir hücre kültür Kuluçka kuluçka tarafından katılaşmaya fibrin jel izin.
9. 0.5-1 sonra fibrin jel tamamen tarafından özenle oluşturulmuş s, onay plaka devirme. Plaka, fibrin jel oluşumu tamamlandığını gösteren hareket ettirildiğinde jel hareket etmez zaman 3.10 adıma geçin.
10. 100 μg/mL aprotinin ile desteklenmiş FT/fibrin jel ile ex vivo kültür orta (600 μL/de 24-şey plaka) veya 300 μL/kuyuda 48-şey plaka yerleşimi. Orta yavaşça drop-wise kader tarafından pipette.
    Not: Burada, aprotinin fibrin jel bozulma önlemek için hücresel proteaz FTs^13,14tarafından ifade kullanılır. Ex vivo kültür orta Ayrıca VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ gibi rekombinant büyüme faktörleri ile takıma girebilir (bakınız Tablo reçetesi)¹¹.
11. Ex vivo kültür plaka FT geri 37 ° C, % 5 CO₂ hücre kültür kuluçka ve kültür istediğiniz zaman dönemi için (Örneğin, 2 - 18 gün, uzun kültür dönemleri test edilmesi gerekecektir) yerleştirin. Orta % 50'si ile taze ex vivo kültür orta yerine üç günde.

4. "Matrix" in görüntüleme

1. Ex vivo kültürler FT görüntülerini aynı gün (gün 0) elde etmek ve (Örneğin, her geçen gün) kümesi aralıklarla, 3D büyüme izleyebilmek için bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak.
   Not: elde edilen görüntüler için FT akıbet miktar iki dikey çapları toplam uzunluğu olarak karşıdan karşıya explant¹¹kullanılabilir.

5. yerel FT ve Ex Vivo kültür son nokta

Not: FT/fibrin jelleri (ex vivo kültürler FT) istediğiniz zaman aralığının ex vivo kültürlü veya yerel FT karakterizasyonu¹¹için aynı gün (yerel FT) sabit.

1. Kültür orta yerine 1 mL/4% paraformaldehyde RT. 1 h için PBS çözümünde de, yerel FT veya FT ex vivo kültürler sabitleyin 0.5-1 yerli FT/fibrin jel için tamir sonra eski ilavesi s vivo kültür orta (fibrin jel-değil var batırılmış ortamda, fiksasyon onlara zarar verir).
   Not: paraformaldehyde aşındırıcı, zehirli ve kanserojen olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
2. PBS içinde FT/fibrin jel ile üç 5 dk yıkama durulama (2 mL/de).
3. PBS yerine 2 mL/de %0,02 sodyum azid içeren PBS ve daha fazla işleme kadar 4 ° C'de sabit fibrin jelleri saklayın. FT/fibrin jelleri depoda kuru değil emin olmak için parafin film ile plakalarının.
   Not: Sodyum azid zehirli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.

6. bütün-Mount ayirt boyama

Not: Bu protokol 5 gün süren ve gece incubations ile kesintiye belirtilen yerde. Herhangi bir noktada jelleri kuru fibrin izin vermeyin. Tüm adımlar RT aksi belirtilmedikçe gerçekleştirilir.

1. Aşağıdaki çözümleri boyama Protokolü başlamadan önce hazırlayın.
   1. Sonrası fiksasyon çözüm: eşit miktarda aseton ve metanol karıştırılarak 50: 50 aseton: metanol çözüm hazırlamak (Örneğin, 50 mL). -20 ° C'de mağaza Bu çözüm en son gün boyama önce hazırlamak. Bu çözüm geri-20 ° C'de depolanan ve sonraki stainings için kullanılabilir.
      Not: Bu çözüm duman başlıklı aseton ve metanol yanıcı ve sağlık için tehlikeli olduğu gibi hazır olun.
   2. Çözüm engelleme: % 15 fetal Sığır serum (FBS), % 0.3 Oktil fenol ethoxylate çözümünde PBS ilk ekleyerek 15 oranında hazırlamak FBS PBS için. Oktil fenol ethoxylate ekleyin ve çözülmeye karıştırın. 4 ° C'de mağaza
      Not: Bu çözüm içinde büyük miktarda peşin, 15 mL aliquotes-20 ° C'de depolanan ve boyama Protokolü başlatıldığında gün kullanmadan önce çözdürülen hazırlanabilir. Taze hazırlanmış veya taze çözdürülen aliquote boyama her iletişim kuralı için kullan.
   3. Çözüm yıkama: 1 litre PBS için 995.5 mL Oktil fenol ethoxylate 4.5 mL ekleyerek % 0.45 Oktil fenol ethoxylate takıma PBS hazırlamak. Çözülmeye karıştırın. Mağazada RT.
2. Dikkatle plaka üzerinden damlacıkları paslanmaz çelik kare uçlu bir spatula kullanarak kaldırın. Damlacık ilk ayırmanız kenarları merkezi kaldırma önce ve 12-şey plaka PBS 1 mL içeren bir kuyu için transfer.
   Not: Bu plaka biçimde sonrası fiksasyon, yıkama ve engelleme adımları gerçekleştirin.
3. Damlacıkları ile 1 mL buz gibi 50: 50 aseton: metanol çözeltisi ~ 1 dk (damlacıkları kenarlığını beyaz dönecek) sonrası tamir et.
   Not: aseton ve metanol sağlığı için tehlikeli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
4. 3-5 yıkar 2 ml (rehidrasyon tamamlandığında damlacıkları PBS çözümde batacağı) PBS ile durulayın.
   Not: sonrası fiksasyon sonra plastik yapışkan oldukları gibi pipet ucu damlacıkları dokunmaktan kaçının. Boyunca protokolünün, engelleme ve bu zarar ya da tamamen yok damlacıkları gibi çözümleri emme, yıkama alıyorum sonrası düzeltme, antikor, kaçının. Bunun yerine, plaka eğilme ve bir 500-5000 μL pipet kullanarak çözümler dikkatli bir şekilde çıkarın.
5. Engelleme çözüm 21,000 x g ve 4 ° C de 15 dakika santrifüj kapasitesi enkaz kaldırmak için.
   Not: Çözüm bölünmemeli 1,5 mL tüpler Santrifüjü için olabilir. Kullanılmayan çözüm 4 ° C'de saklanır ve tüm ilgili sonraki adımlar için kullanılır.
6. 500 μL damlacıkları kuluçkaya RT. 2 h için çözüm engelleme
   Not: kullanılan çözüm engelleme sesi azaltmak için plaka üzerinde bir destek yatırılabilir ve çözüm/damlacık kadar az 300 μL kullanılabilir.
7. (En az 30 μL/damlacık) birincil antikor karisimin çözüm ve santrifüj 21.000 x g de 15 dk ve 4 ° c için engelleme uygun seyreltme hazırlamak
8. (U) yuvarlak içine damlacıkları transfer-alt 96-şey plaka yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak ve en az 30 μL/damlacık gecede 4 ° C'de birincil antikor karışımı ile kuluçkaya
9. Ertesi gün, transfer, çözüm/iyi, yıkama içeren 2 mL 12-kuyuya damlacıkları plaka durulama üç 5 dk ile ilk ve o zaman ile dokuz 30 dk yıkar yıkar. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
10. Ertesi gün, üç kez PBS ile durulayın ve (U) yuvarlak içine damlacıkları transfer-alt 96-şey plaka.
11. Yıkama sırasında çözüm ve 21,000 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapatmaktır fluorophore Birleşik uygun ikincil antikor karışımı (seyreltilmiş 1:500, en az 30 μL/damlacık) hazırlamak
12. Damlacıkları bir yuvarlak aktarmak (U)-alt 96-şey plaka yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak ve ikincil antikor karışımı RT, ışıktan korunan 4 h için en az 30 μL ile kuluçkaya.
    Not: tüm sonraki incubations ve ışıktan korunan çamaşır adımları gerçekleştirin.
13. Damlacıkları 2 mL çözüm/iyi yuvarlak uçlu bir spatula, durulama üç 5 dk yıkama ile ilk kullanarak yıkama ve daha sonra dört 30 dk yıkama ile içeren 12-şey plaka içine aktarın. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
14. Ertesi gün, beş 30 dk yıkama ile jelleri ve sonra üç kez PBS ile yıkayın. Son yıkama (2 mL), gece 4 ° C'de bırakın
15. Ertesi gün, damlacıkları bir yuvarlak aktarmak (U)-alt 96-şey plaka RT. az 30 dakika boyunca 10 μg/mL ile Höchst nükleer leke (en az 30 μL/damlacık) kuluçka tarafından yuvarlak kenarlı spatula ve counterstain çekirdeği kullanarak
    Not: 4' ile desteklenmiş orta montaj, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) counterstaining çekirdeği için alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, bu adımı ve adımı 6,16, doğrudan adıma 6.17 devam atlanır.
16. Damlacıkları PBS/iyi yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak 2 mL içeren 12-şey plaka aktarmak ve üç kez PBS ile durulayın.
17. Mikroskop bir slayda damlacıkları aşağıdaki gibi bağlayın:
    1. Bir kare şeklindeki 22 x 22 mm coverglass kenarlarında hızlı sağlamlaştırma montaj orta dar bir tabaka uygulayın ve ~ 1 dakika kurumaya bırakın. Bu adımı her damla için ayrı ayrı, montaj orta aşırı sertleşme önlemek için uygulayın.
       Not: hızlı sağlamlaştırma montaj orta sağlığı için tehlikeli olduğu gibi duman mahallede bu adımı gerçekleştirin.
    2. 2 mL deiyonize su içeren bir 12-şey kalıbının kuyuya daldırma tarafından damlacığı durulayın ve yuvarlak uçlu bir spatula kullanarak bir mikroskop slayt aktarın. Fazla suyu emici kağıt küçük bir parça kullanarak kaldırın.
    3. 15 μL damlacığı sağlamlaştırma antifade montaj ortamına dağıtmak.
       Not: Eğer Höchst nükleer leke kullanılan değil, alternatif olarak, 4', içeren orta montaj 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanılabilir.
    4. Yavaşça mikroskobik slayt üzerinde damlacık karşısında hızlı sağlamlaştırma montaj orta ile kapak cam getirin ve yerleşmek izin.
       Not: Hızlı sağlamlaştırma orta mikroskobik slayt için sopa ve damlacık tutmak.
18. 6.17 bütün damlacıklar için yineleyin. İki damlacıkları her mikroskop slaytta bağlayın.
19. Slaytlar RT ~ 2 h için kurumasına ve gecede 4 ° C'de saklamak izin. Slaytları yatay olarak yerleştirilmiş ve ışıktan korunan emin olun.
20. Görüntü lekeli yerli veya son nokta FT ex vivo kültürler confocal mikroskop ya da bir optik parça işlevi ve 20 x veya 40 x amacı ile donatılmış bir dik epifluorescence mikroskop kullanarak. Doku büyük bir bölgeyi hemen yakalama kiremit işlevini kullanın.

PDR fibrovascular doku özellikleri ve protein ifade daha derin bir anlayış esas olarak vitreus örnekleri ve ince histolojik FT bölümleri^3,15,16,17güvendi. Cerrahi olarak eksize yararlanmak için biz yola 3D doku organizasyon ayrıntılı incelenmesi ve PDR, çok hücreli fizyopatolojik süreçleri için bir yöntem geliştirmek için hasta patolojik FTs ex vivo kültür ve 3D karakterizasyonu için türetilmiş. Taze FTs araştırma laboratuvarı için transfer ve Şekil 1' deki şematik iş akışı gösterildiği gibi işlenebilir.

FTs diseksiyon niteliksel değerlendirmesi ve belgeler (Şekil 2) için önce yansıması. Şekil 2' de gösterildiği gibi FTs boyutu, yoğunluk ve bereket vasküler yapıların büyük arası hasta varyasyon görüntüler. Bazı dokularda, gevşek hücreleri, muhtemelen inflamatuar/bağışıklık hücreleri veya kırmızı kan hücreleri, farklı çaptaki geçirgen vasküler yapılar da kolayca olabilir yanı sıra (Şekil 2) ayırt. Diseksiyon sonra bir karar elde edilen explants sınırlayıcı sayısı aşağı akım kullanımı hakkında girdi kimliğini belirtir. Explants bir kısmını fibrin matris içinde gömülü ve fibrin jel oluşumu sonra kalan explants ex vivo kültür ayrı tabakta (Şekil 1) tabi iken sabit. Taze FTs da başarıyla ultrastructural karakterizasyonu için elektron mikroskobu tarafından kullanılmıştır. Örnekleri de konvansiyonel transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ultrathin bölümlerinin veya seri blok yüz tarama elektron mikroskobu (SBF-SEM)^3,11işlenmiş olabilir.

Sabit fibrin jelleri birkaç hafta için depolanan ve bütün Dağı ayirt^18,19tarafından lekeli. Lekeli örnekleri aynı şekilde karanlıkta 4 ° C'de saklandığında stabildir. Epifluorescence mikroskop optik bir parça işlevi, dağınık odak ışık kaldırmak için yararlı ile donatılmış ile kalın FT/fibrin jelleri zaman verimli yansıması. Bu yöntem ile görüntülemede yapıları iyi görselleştirme sağlar. Alternatif olarak, confocal mikroskobu, daha fazla zaman talep, izin verebilir rağmen ince ayrıntıları yakalama. Karakterizasyonu taze fibrin gömülü ve sabit, kültürsüz, yerli FTs bütün Dağı ayirt tarafından sağlayan vasküler yapılar, birden çok hücre tipleri ve 3D PDR doku içinde karşılıklı kendi düzenleme karakterizasyonu ¹¹manzara. Örneğin, CD31 antikorlar endotel görüntülemek için kullanılan ve lenfatik benzeri endotel yapıları (Şekil 4)¹¹NG2 Lyve1 antikorlar yeni görselleştirmek iken perisitlerden (Şekil 3) görüntülemek için keşfetti. Birden fazla kombinasyon antikorların çeşitli yapıları ve hücre tipleri ( Tablo malzemelerigörmek) görselleştirmek için kullanılabilir; Örneğin, ERG da anormal PDR neovasculature bir discontinuos ifade deseni olan endotel görselleştirebilirsiniz. (Örneğin, CD31 ve Lyve1) membran marker ile lekeli vasküler yapılar kantitatif korunması ve yoğunluğu için Angiotool, NIH Ulusal Kanser Enstitüsü¹¹'^{geliştirilen ücretsiz kaynak yazılım kullanarak analiz edilebilir, 20}. 3D birimleri ayrıca veri kümesi elde edilen (bkz: Video 1) oluşturulabilir. Bir antikor bütün Dağı ayirt için uygun değilse, fibrin damlacıkları alternatif olarak parafin içinde gömülü, ince bölümlerine kesebilir ve immünhistokimya tarafından analiz. Bu durumda RT, 1 h yerine 4 ° C'de gecede fiksasyon damlacıkları faydalanın

Ex vivo kültür hücresel outgrowths zaten iki gün (Şekil 5) sonra geliştirme fibrin gömülü FTs gelişimini sürdürmektedir. Ex vivo kültür, beri içinde vivo geçici ECM simgeliyor için matris serum fibrinojen sızan PDR neovessels ile doğrudan temas vasküler sızıntı sitelerdeki Trombin bölünme Kaiserliche Marine gibi vitro fibrin jel kullanılır fibrotik ortamın^15,21,22iltihaplı.

PDR ile karakterize bir anjiogenik ve fibrotik yanıt mikrovasküler komplikasyon FT explants kültür bu hücresel repertuarında korumak, hem de verimli kültür media¹¹' e eklendi eksojen uyaranlara yanıt var... Şekil 6'daki temsilcisi verileri PDR ex vivo kültürler tarafından yapılan yansıyan fibrotik yanıt TGFβ bağlı iken CD31 pozitif endotel ve damarlara muhafaza edilmesi VEGFA, yanıt olarak çimlenme indüklenen gösterir NG2 pozitif perisitlerden/SMCs. Birkaç eksojen uyaranlara test edilebilir ve onların içinde vivo vitreal bereket ölçümleri tarafından haberdar olduğunda burada gelişmiş PDR ex vivo kültür model olamaz roman microenvironment ve içerik bağımlı PDR patolojik mekanizmaları ortaya çıkarabilir Sabit doku malzeme içinde görüntülenir.

Şekil 1. Ex vivo PDR fibrovascular doku kültürü modeli. Explants içine onun diseksiyon ve fibrin üç boyutlu karakterizasyonu ve ex vivo kültür içine gömme FT eksizyon vitreus cerrahisi (pars plana vitrektomi) akışına şematik gösterimi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Taze diseksiyon önce PDR fibrovascular dokuları eksize. Taze eksize FTs diseksiyon önce alınan faz contast filmler. FTs boyutu, yoğunluk ve bereket vasküler yapıların çok değişkendir. Ok uçları farklı çaptaki damar yapıları gösterir. Kırmızı kısmen saydam çizgi iki bireysel gemi farklı çaptaki vurgulamaktadır. Görüntüleri bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak 5 x, 0.15 sayısal diyafram (NA), hedef alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Bütün monteli ayirt bir yerel PDR fibrovascular dokusunun. Epifluorescence test bir yerli, PDR FT tarafından bütün Dağı ayirt lekeli. CD31 (A, yeşil) görüntüler endotel NG2 ise (B, kırmızı) perisitlerden düzensiz neovasküler yapıları içinde görüntüler. Birleştirilmiş görüntüler (C) gösterilir. DAPI (mavi) counterstain çekirdeği görüntüler. Görüntü bir dik epifluorescence mikroskobu ile optik parça işlevi kullanılarak yapılan ve 40 x 1.4 NA, petrol amacı istimal bir bilgisayar kontrollü 1.3 megapiksel tek renkli CCD kamera ve görüntü edinme yazılımı ile kombine. Dokuz optik bölümleri görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanarak kombine edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4. Bütün monteli ayirt bir yerel PDR fibrovascular dokusunun. Epifluorescence test bir yerli, PDR FT tarafından bütün Dağı ayirt lekeli. CD31 (A, yeşil) görüntüler endotel Lyve1 ise (B, kırmızı) yeni keşfedilen lenfatik benzeri endotel yapıları görüntüler. Birleştirilmiş görüntüler (C) gösterilir. Höchst-33342 (mavi) counterstain çekirdeği görüntüler. Görüntü bir dik epifluorescence mikroskobu ile optik parça işlevi kullanılarak yapılan ve bir bilgisayar kontrollü 1.3 megapixel tek renkli CCD kamera ve görüntü alma yazılımı, 20 x, 0.8 NA, amacı istimal ile birlikte. Dört optik bölüm görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanarak kombine edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5. Ex vivo büyüme PDR fibrovascular dokuların. Faz kontrast filmler iki FT ex vivo kültürler noktalarda belirtilen süre (gün). FTs ex vivo kültür, hücresel outgrowths zaten iki gün sonra geliştirme büyür. Görüntüleri bir 5 x, 0.15 NA, amacı ile bir ters epifluorescence mikroskop kullanarak alındı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6. Bütün monteli ayirt PDR fibrovascular dokuların ex vivo (CTRL) tedavi edilmediği veya VEGFA veya TGFβ varlığını kültürlü. Epifluorescence test ft ex vivo (CTRL) tedavi edilmediği veya VEGFA veya TGFβ 9 gündür kültürlü ve daha sonra bütün Dağı ayirt tarafından lekeli. NG2 (kırmızı) perisitlerden görüntüler süre CD31 (yeşil) endotel görüntüler. DAPI (mavi) counterstain çekirdeği görüntüler. Fibrotik yanıt TGFβ bağlı iken VEGFA damarlara stabilize. Görüntüleri bir dik epifluorescence mikroskobu ile optik parça işlevi kullanılarak yapılan ve bir bilgisayar kontrollü 1.3 megapixel tek renkli CCD kamera ve görüntü alma yazılımı, 20 x, 0.8 NA, amacı istimal ile birlikte. Dokuz optik bölümleri görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanarak kombine edilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1. yerel FT inşası 3B cilt lekeli bütün Dağı ayirt tarafından. CD31 (yeşil), Lyve1 (kırmızı). Höchst-33342 counterstain (mavi) çekirdeği görüntüler. Görüntü bir dik epifluorescence mikroskobu ile optik parça işlevi kullanılarak yapılan ve bir bilgisayar kontrollü 1.3 megapixel tek renkli CCD kamera ve görüntü alma yazılımı, 20 x, 0.8 NA, amacı istimal ile birlikte. 3B cildi yeniden yapılanma ve video işleme gerçekleştirilen ticari bir yazılım kullanarak. Videonun bir bölümü Gucciardo ve ark. izni ile yayımlanmaktadır ¹¹. bu videoyu izlemek için buraya lütfen tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

İlgili doku microenvironment güvenilir işlevsel hücre ve moleküler mekanik sonuçları için önemi göz önüne alındığında, bu doku ortamı sağlamak uygun deneysel modelleri bulmak için zorunludur. Burada açıklanan ex vivo PDR kültür modeli fibrin gömülü FTs için PDR patofizyolojisi mekanizmalarının incelenmesi PDR klinik örnekler yerel, karmaşık ve çok hücreli bağlamında verir.

Kritik iletişim kuralına uygun fibrin jel oluşumu, FT ve boyama sırasında yeterli çamaşır konumlandırma adımlardır. Çoğunlukla Trombin aktivitesi konsantrasyon ve sıcaklık, etkilenen, fibrin jel oluşumu bağlıdır beri Trombin miktarı fibrin jel hazırlık her toplu iş için ayarlanması gerekir. Fibrin jel oluşumu FT explants 2D büyümesini engellemek, ancak aynı zamanda FT damlacıkları ortasına dikey ve yatay olarak konumlandırma izin vermek için yavaş vermek hızlı olmalıdır. FT damlacığı kenarında bulmak için olur durumda ek pipetting FT merkezi yerleştirme yardımı olabilir. Bu hala damlacıkları kenarında kalır veya 2D olarak büyümek FTs dışlanması gerekecektir. Yeterli boyama ve önleme sırasında yıkama kurutma damlacıkları boyama optimize etmek ve arka plan sinyal en aza indirmek için sırayla kritik. Aktarım süreleri de kritik olabilir. Biz FTs kadar iki saat sonra vitrektomi katıştırılmış için ve bu eski etkilemez mi vivo büyüme. Daha uzun aktarım süreleri kültür başarı etkisini test edilmesi gerekir.

Bu iletişim kuralı FT gömmek için alternatif matrisleri kullanarak değiştirilmiş olabilir. İn vivo, PDR neovessels doğru vitreus korteks kollajen²³' zengin büyümek. Ancak, fibrinojen, dahil olmak üzere vasküler sızıntı serum bileşenleri, vitre yakın sayede fibrotik yanıt başlatılır damarları içine geçiyoruz. Bu nedenle, tüp bebek fibrin pıhtısı kullanılmıştır burada eski için PDR^15,21,22iltihaplı fibrotik ortamda kurulan geçici ECM simgelemek için vivo kültür. Alternatif olarak, fibrin pıhtısı laminin ve kılcal çimlenme istikrar değiştirmeye fibronektin ile takviye veya explants-var olmak embedded içinde tip ı kollajen ve en fibrotik microenvironments simgelemek için diğer karışık matrisler neovasküler dokular. Bu matrisler genellikle 3D kültür için uygundur ve test edilecek bütün Dağı ayirt ama PDR FTs üzerindeki etkileri kalır ve 3D matris oluşumu dikkat edilmesi gereken noktalar zamanlaması için 2D önlemek için sınırları içinde kalmak için yapılması gerekecektir büyüme^18,19. Ne zaman bir sınırlama hastane araştırma biriminin fiziksel yakınlık gösteren, uzun aktarım süreleri takım çalışması ile telafi; TA çözüm hazırlık, fibrinojen steril-filtrasyon ve fibrin jel oluşumu test FT aktarım sırasında gerçekleştirilir. Fibrin jelleri bile 1 saat sonra oluşturmuyorsa, fibrinojen veya TA eriyik hazırlığı ile ilgili bir sorun oluşmuş olabilir. Bu durumda, FT/fibrin jelleri kullanılamaz.

Bu yaklaşım, sınırlamaları gibi her eski vivo yaklaşım, değişken birincil doku numune intra sabırlı ve arası hasta doku heterojenite yanı sıra, bireyler arasında kalitededir. Diyabetik hastalar söz konusu olduğunda, bu değişkenliği parçası vaskülarizasyon ve süresi türü sistemik tedavi ve diyabet hastalığı, metabolik durum, genetik/epigenetik faktörler gibi çeşitli faktörlere bağlı fibroz ölçüde içerir. Kurtarılan cerrahi PDR FT boyutunu da her örnek için soruşturma olması koşulların sayısını belirlemede bir sınırlayıcı faktördür. Karşılıklı mekansal bilgi sağlarken, Bütün Dağı ayirt özellikleri/işaretleri damlacık başına sadece sınırlı bir miktarda incelenmesi sağlar. Bir uzlaşma, fibrin damlacıkları alternatif olarak parafin içinde gömülü, ince bölümlerine kesebilir ve immünhistokimya tarafından analiz.

Modelleri birçok özelliği erken evre DR geliştirmek ancak kapsamlı bir şekilde böylece PDR hastalığı mekanizmaları^7,8çalışmaların engelleyen insan PDR içinde meydana gelen progresif değişiklikleri özetlemek başarısız diyabetik fare mevcut. O-sizlik çekmek daha fazla insan hastalık²⁴eğitim önemini vurgulayan makula, Ayrıca, fare göz insan gözünden temelde farklı olmamasıdır. Cerrahi PDR FTs daha önce de atılan veya kullanılan parafin kesitler, transmisyon elektron mikroskobu, seri blok yüz tarama elektron mikroskobu, RNA sıralama veya 2D kültür Disosiye hücreleri^{3,25 toplu} . Burada açıklanan modeli 3D bu değerli cerrahi malzeme karakterizasyonu, hem de PDR patofizyolojisi incelenmesi yerli hastalıklı doku microenvironment verir. Vitreus sıvısı kullanımı ile birleştirildiğinde, bu model Ayrıca soruşturma hücresel ve acellular PDR microenvironment katkı sağlar. Kültürler verimli bir şekilde bFGF, VEGFA gibi vitre büyüme faktörleri tespit yanıt beri VEGFC ve böylece recapitulating PDR patofizyolojisi, bu PDR ex vivo kültür modeli özelliklerini TGFβ, sınama ve yeni PDR tedaviler ^{geliştirmek için mükellef 11}. Bu modelde anti-VEGFA kılcal çimlenme engelledi ve kapiller regresyon, anti-VEGFA tedavi^26,27beklenen klinik sonuçlar ile tutarlı yanıt belirtileri indüklenen. Bu nedenle, bu model de anti-VEGFA ve kortikosteroid tedavisi de dahil olmak üzere geçerli tedavilerin etkileri daha iyi anlamak için kullanılabilir.

Canlı hücre görüntüleme araçları, burada açıklanan ile ex vivo kültür modeli vasküler regresyon, çimlenme ve hücresel plastisite gibi işlemlerin gerçek zamanlı soruşturma izin vermek için hızlandırılmış mikroskobu tabi. Tüp bebek ve içinde vivo modelleri, hem de klinik veri ile birleştirildiğinde, bu ex vivo PDR modeli hasta yanıt işaretleyicileri tanımlama belirli setlerinde dayalı soruşturma yardımcı olacaktır, tıp Avenue için bir adım daha kişiselleştirilmiş. Hastaya özgü yanıt ve/veya Yanıt özgü işaretleri tanımlayan mikrovasküler karmaşık bir etkileşimi ile multifaktöriyel bir hastalıktır, PDR durumunda özellikle ilgili nörodejeneratif, metabolik, epigenetik genetik / immünolojik ve inflamasyon ile ilgili faktörler, böylece giderek daha çok disiplinli çabaları için geliştirilmiş tedavi hedefleme ve hastalık yönetimi geliştirme gerektiren. Bütün Dağı ayirt yanı sıra, kültürlü vivo FTs Ayrıca fibrin plasmin/nattokinase tedavi tarafından alındı olabilir ve transcriptomic ve proteomik tabi eski²⁸inceliyor. Ex vivo çalışmalar fibrovascular dokuların orak hücre retinopati, ağır vakalarda gibi diğer oküler koşullarında, geliştirilen için model burada açıklanan uygunluğu da gelecekte keşfedilmeyi.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yazarlar en tıbbi ve cerrahi retina meslektaşları, hemşireler ve diyabetik birim ve vitreus cerrahi birimi Oftalmoloji departmanı, Helsinki Üniversitesi Hastanesi aktif istihdam katıldığınız için tüm personel için minnettarız hastaların. Biomedicum moleküler görüntüleme birimi görüntüleme özellikleri için teşekkür ederiz. Anastasiya Chernenko mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışmada Finlandiya Akademisi (KL), Helsinki Üniversitesi (KL), Sigrid Juselius Vakfı (KL), K. Albin Johansson Vakfı (KL), Finlandiyalı Kanser Enstitüsü (KL), Karolinska Institutet (KL), Finlandiyalı göz Vakfı (SL), göz gelen hibe tarafından desteklenen ve Doku Bankası Vakfı (SL), Mary ve Georg C. Ehrnrooth Vakfı (SL) ve HUCH klinik araştırma hibe sonra TYH2016230, SL (TYH2018127), doktora programı Biyomedikal (EG) yanı sıra diyabet araştırma Vakfı (SL, KL, AK, örneğin).