증식 성 당뇨 망막 증에 Fibrovascular 합병증에 대 한 전 비보 조직 문화 모델

여기, 우리는 3 차원 기본 조직 특성화 및 전 비보 문화에 대 한 환자 파생, 수술 excised, fibrovascular 직물을 사용 하 여 증식 성 당뇨 망막 증의 병 태 생리학을 공부 하는 프로토콜을 제시. Ex vivo 문화 모델이 테스트 또는 새로운 치료법 개발에 대 한 의무가 이기도 합니다.

당뇨병 성 망막 증 (DR)은 당뇨병의 가장 일반적인 microvascular 합병증 그리고 최고의 중 하나 일 나이 성인 실명의 원인. 당뇨병과 산소 유도 된 망막의 없음 현재 동물 모델 개발 인간의 증식 당뇨 성 망막 증 (PDR)에 전체 범위의 진보적인 변화. 따라서, 질병의 병 인 및 병 태 생리학의 이해 조직학 단면도 유리 샘플만 포함 된 병원 성 요인에 정상 상태 정보를 제공 하는 방식에서의 사용에 크게 의존 했다. 증거를 증가 나타냅니다 동적 셀 및 3 차원 (3D) microenvironments의 맥락에서 세포-세포 외 기질 (ECM) 상호 작용의 개발 쪽으로 기계 및 기능 연구에 대 한 필수적인 새로운 치료 전략입니다. 따라서, 우리는 안정적으로이 치명적인 질병의 세포 및 분자 메커니즘을 해명 소설 임상에 대 한 가능성을 테스트 하 고 병 적인 fibrovascular 조직 수술 PDR와 눈에서 excised 활용할 수 가설 개입입니다. 이 끝 우리 수술 excised 환자 파생 fibrovascular 조직 (FT), 인간의 PDR 이상의 관련 모델 될 것입니다의 비보 문화 전 3D에 대 한 새로운 방법을 개발. FTs는 explants로 해 부하 고 ex vivo 문화 및 3D 특성에 대 한 섬유 소 매트릭스에 포함 된. 네이티브 FTs 및 끝점 문화 전체 마운트 면역 형광 수 조직 구성과의 잠복 관련 기능에 대 한 3 차원 조직 수준 특성의 중요성을 강조 하는 다세포 프로세스의 철저 한 조사 PDR 이상입니다. 이 모델은 동적 PDR 조직 아키텍처와 microenvironment 내 생 화 학적 및 물리적 상호 작용의 복잡 한 맥락에서 분자 메커니즘, 세포/조직 프로세스 및 치료 응답의 동시 평가 허용할 것 이다. 이후이 모델이 PDR 이상, 그것은 또한 새로운 치료법을 개발 또는 테스트에 대 한 의무가 있을 것입니다.

박사는 당뇨병, 지난 3 년간¹에서 거 대 한 비율에 도달 했습니다 질병의 심각한 안구 합병증. 20 년 후 일 나이 성인²실명의 원인 진단, 타입-1 당뇨병과 망막 질환, 당뇨병 라기보다 하나의 주요의 만들기의 유형 2 당뇨병 현재 징후와 환자의 60%와 거의 모든 환자. Microvascular 변성 및 허 혈 성 손상의 수준에 따라 박사는 비 증식 박사 (비 PDR) 및 증식 박사 (PDR)으로 분류 됩니다. 말기 질환, PDR, 허 혈 및 염증 유발 neovascularization 및 vitreoretinal 인터페이스에서 거리 응답 특징 이다. 치료 되지 않는 조건에서 이러한 프로세스는 유리 체 출혈, 망막 증, 망막 tractional 및 신생 녹 내장^3,4실명 이어질 것입니다. 최근 발전에도 불구 하 고 현재 치료 옵션 대상만 박사 단계, 망막 손상에는 이미 일어 났 죠 때 당뇨 황 반 부 종 및 PDR, 포함 한. 또한, 박사 환자의 큰 비율 현재 치료 armamentarium, 향상 된 치료^4,,56에 대 한 긴급 한 필요를 나타내는에서 혜택 하지 않습니다.

다른 여러 나n vivo 질병/개발 모델 및 당뇨병 동물 모델 개발 되었습니다 날짜, 하지만 그들 중 누구도 인간의 PDR^7,8관찰 pathologic 기능의 전체 범위. 또한, 증거를 증가 시키는 치료 응답 ECM 구성으로 공간 배열 및 세포질이 고 acellular microenvironment⁹사이의 상호 작용에 밀접 하 게 연결 되어 있는지 나타냅니다. 우리는, 그러므로, 일반적으로 vitrectomy PDR¹⁰의 외과 관리의 일환으로 진행 하는 눈에서 excised 피트 병 적인 소재를 활용 하 여 인간의 PDR의 임상 관련 모델 개발에 착수.

이 원고 vivo 문화 전 3D에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 수술 excised PDR의 환자-파생 된 병 적인 피트. 여기 설명 하는 방법은 네이티브 3D PDR 조직 풍경의 성공적인 해체 하 고 재현 부 PDR 이상 신생 등의 비정상적인 거리 응답의 특징의 최근 간행물에서 사용 되었습니다. 혈관 구조¹¹. 이 모델은 또한 소설 기능 수 없습니다 쉽게 평가 될 얇은 조직학 섹션에서와 같은 공간을 국한 apoptosis와 확산 뿐만 아니라 혈관 섬 형성¹¹을 공개 했다. 유리 같은 액체는 성공적으로 사용 되었습니다 다른 사람에 의해 3D 내 피 회전 타원 체 문화는 신생 잠재력을 평가 하 고 angiostatic 분자¹²의 효능에. 생체 외에서 3D 림프 내 피 세포 (LEC) 회전 타원 체 흥분 제 PDR 유리를 사용 하 여 분석 결과 돋 아와 결합 하면, 우리의 모델 두 성 vitreal의 기여 요인 as에 신생 조직 내에서 뿐만 아니라 로컬 단서 공개 아직 불완전 하 게 이해 LEC 참여 PDR 이상^3,11. PDR의 관리에 vitreoretinal 수술 정기적으로 수행이 아직 어려운 절차 이다. 수술 기기 및 기술을 볼 수 있습니다 지속적인 발전과 세련, fibrovascular 증식 견본의 보수와 적시 제거 뿐만 아니라 비전 결과 향상 하지만 또한 귀중 한 조직에 대 한 자료를 제공 합니다 살아있는 인간의 조직 microenvironment의 복잡 한 변환 측면에서 PDR 이상과 치료 응답의 조사.

이 연구는 제도적 검토 보드와 헬싱키 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다. 서명 된 동의 각 환자에서 얻은 했다.

1. 솔루션, 미디어 및 장비 준비

1. 신속한 처리를 보장 하기 위해 fibrovascular 조직 (FT)의 컬렉션에 이전 다음 장비를 준비 합니다.
   1. 멸 균 압력솥 2 서의 핀셋
   2. 1 미리 무게 PBS 태블릿 (0.14 M NaCl, 0.0027 M KCl, 0.010 M 포₄^-3) 이온된 수와 해산 저 어 900 mL에 용 해 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1을 준비 합니다. 1 L 및 멸 균 압력솥 준비 솔루션 물 볼륨을 조정 합니다. 실시간에 저장소
   3. 위에서 언급 한 솔루션 및 단일-사용 무 균 메스, 살 균 6 cm 세포 문화 접시와 5 살 균 12-잘 세포 배양 배지는 바구니에 장비를 수집 합니다.
2. HBSS, 적어도 1 시간 동안 37 ° C에 물 목욕으로 몰입 50 mL 튜브를 사용 하 여의 5 mL로 플라스 미노 겐 고갈 인간의 fibrinogen의 30 mg를 용 해 하 여 6 mg/mL fibrinogen 솔루션에서 행 크 스 균형 소금 솔루션 (HBSS)을 준비 합니다.
   참고:이 솔루션 수 보관 7 h (최대 10 h)에 대 한 물 목욕 (37 ° C)에서 사용 하기 전에.
3. 전 준비 추가 하 여 5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 또는 5% 인간 혈 청, 0.4% 내 피 세포 성장 보충, 10 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자, 1 μ g/mL 날린, 그리고 상업적으로 사용 가능한 50 μ g/mL gentamycin vivo 문화 매체 내 피 세포 성장 매체 그리고 사용까지 37 ° C에 물 목욕에 계속. 한 달에 4 ° C에서 저장 합니다.

2. fibrovascular 조직 해 부

1. 수술 트랜스 conjunctival microincision vitreoretinal, PDR의 vitreoretinal 외과 관리의 일환으로 23 또는 20 게이지 3 포트 동위 플 vitrectomy에 의해 인체에서 excised 되었습니다 fibrovascular 조직 (FT)를 수집 합니다.
   참고: FT 세분화 및 박, 잘라 intraocular 끝 창과 microforceps와 유리 같은 구멍에서 제거와 microscissors, 필요 경험된 vitreoretinal 외과 의사에 의해를 사용 하 여 excised입니다. 극단주의 시 신경 또는 병 적인 신생 조직이 가장 일반적으로 위치한 일시적인 혈관 아케이드를 포함 하 여 눈 구조에 손상을 초래 하지 않고 그대로, 손상 되지 않은 피트를 제거로 이동 해야 합니다. 삭제 조직의 크기는 변수, 보통 3와 50 m m²까지인.
2. 6 cm 세포 문화 접시 또는 젖은 얼음에 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 FT를 유지 하 고 즉시 처리에 대 한 실험실 연구에 그것을 전송.
   참고: 연구 단위 (실험실 시설)는 물리적으로 병원 수술 실 (OR)에 가까운 작은 삭제 피트의 전송 시간을 최소화 하기 위해 필수적 이다. 이 경우 전송 5 분 미만 소요 하 고는 explants에에서 포함 된 섬유 소 내에서 일반적으로 1-1.5 h (최대 2 시간) 제거 수술 후. 3 차원 문화에 더 이상 전송 시간의 영향 테스트 해야 합니다.
3. 실 온 (RT, 25 ° C)에서 PBS의 1 mL를 포함 하는 6 cm 세포 문화 접시에 FT를 놓고 조직 5 배 목표는 거꾸로 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 이미지를 수집 합니다.
   참고: 이미지 문서에 대 한 질적 평가 획득 됩니다. 그것은 조직의 크기, 밀도 및 일반적인 구성 (예: 혈관 구조) 관찰 가능 합니다.
4. 잘라 FT ~ 1 mm를 직 립 해 부 stereomicroscope, 메 마른 메스와 서 핀셋을 사용 하 여 아래² 조각. 잘 서 트위터를 사용 하 여 장소에 PBS에 빠져들 조직 누른 분명 상처 소독 메스를 사용 하 여 수행 합니다. 이 네이티브 fibrovascular 구조를 변경할 것으로 FT, 찢 어 하지 마십시오.
5. 살 균 PBS의 1 mL를 포함 하는 12-잘 셀 문화 접시의 각 개별 조각을 넣으십시오.
   참고: 필요한 경우, 부드럽게 상처를 수행 하기 전에 기정 핀셋을 사용 하는 접시에 피트 확산.

3. 네이티브 피트 및 전 비보 문화 특성에 대 한 수직 섬유 소 젤 방울 주조

1. 멸 균 필터 10 mL 주사기로 탑재 0.22 μ m 필터 단계 1.2 준비 준비 fibrinogen 솔루션.
2. Fibrinogen 솔루션 (1.5 mL 튜브 당 25 μ)와 실시간 준비 섬유 소에 대 한 약 수에 계속 준비 aliquots 젤 / 모든 포트 조각 해 부, 후 고는 섬유 소를 테스트 하기 위한 추가 aliquots의 몇 젤 형성 있습니다.
3. 준비 HBSS 트 롬 빈과의 aprotinin, 400 μ g/mL의 4 단위/mL를 포함 하는 솔루션 여기서 따 솔루션, 불리고 많은 TA 솔루션은 절 개 후 얻은 조각 수에 따라 필요에 따라 실시간 준비에서 유지 (25 μ 따 솔루션의 각 사용은 FT/fibrin 젤), 그리고 섬유 소 젤 형성을 테스트 하 고 충분 한 해결책은 섬유 소 젤 방울의 전체에 대 한 추가 금액 (예를 들어, 250 μ).
   참고: 트 롬 빈이 aprotinin FTs^13,14에 의해 표현 하는 세포질 프로 테아 제에 의해 섬유 소 젤의 저하를 방지 하기 위해 추가 하는 동안 중 합 섬유 소에 대 한 필요 합니다.
4. 섬유 소 젤 형성의 타이밍 테스트: 25 μ 따 솔루션 aliquoted 25 μ fibrinogen 솔루션 단계 3.2에서에서 준비의 추가 하 고, 50 μ로 설정 하는 또 다른 피 펫을 사용 하 여, 믹스 pipetting으로 튜브에 6 cm 세포 문화 접시에 분배 직 립 방울 형성.
   참고: 섬유 소 젤 형성 일어나 야 한다 ~ 1 분. 이 분 이상 경우에, 단계 3.3에서에서 준비 타 솔루션에서 트 롬 빈의 농도 더 트 롬 빈 재고 솔루션을 추가 하 여 늘릴 수 있습니다. 트 롬 빈 재고 솔루션의 처음 사용 된 볼륨의 10 분의 1 추가할 수 있습니다, 반복적으로, 1.5 분 이내 발생 하는 섬유 소 젤 형성 때까지. 섬유 소 젤 형성 시간은 문화의 3 차원에 대 한 중요 한 빠른 젤으로 (1.5 분) 이내 형성 방지 섬유 소 젤의 바닥에 침 몰 하 고 따라서 셀의 2D 플라스틱 표면 만남에서 피트 조각 문화 플레이트, 2D 세포 접착 및 파생물 이어질 수 있습니다.
5. 살 균 족집게를 사용 하 여 24-잘 접시의 한의 센터에 피트 한 조각 놓고 FT에 흡입 힘을 피하기 위해 0.5-10 μ 피 펫과 pipetting으로 어떤 초과 PBS를 제거 합니다. 경우에는 조직은 트위터에, 추가 트위터를 사용 하 여 조직 조각 접시에 배치 원조.
   참고: FT/섬유 소 젤 또한 시 약의 사용량을 줄이기 위해 48-잘 접시에 캐스팅 될 수 있습니다. 그러나, 이것은 더 많은 도전으로 공간은 더 제한 된 섬유 소는 잘 벽에 접촉으로 오는 경우 확산 됩니다.
6. 25 μ fibrinogen 솔루션 단계 3.2에서 aliquoted TA 솔루션의 25 μ를 추가 하 고 다른 피 펫을 사용 하 여 설정 관에서 50 μ 믹스 pipetting. 잘, 접시에 배치 피트 조각에 분배 고 2-3 위 피 펫 FT에 3D 주변 매트릭스를 제공 하는 직 립 방울 내 피트 조각을 포함 하기 위하여.
   참고: 확인 FT pipetting 동안 발음 하지 아무 공기 방울 형성 된다. 또한 그 혼합, 분배 및 pipetting 수행 됩니다 신속 하 게 섬유 소 젤 1.5 분 이내 양식 것 이다 단계 3.4에서에서 테스트 확인 합니다. 48-잘 접시에 섬유 소 젤을 캐스팅 하는 경우 fibrinogen 솔루션의 20 μ와 타 솔루션의 20 μ 대신 사용 합니다.
7. 모든 포트 조각에 대 한 3.5-3.6 단계를 반복 합니다.
8. 5% CO₂습도 분위기에서 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 접시를 배양 하 여 응고 섬유 소 젤을 허용 합니다.
9. 0.5-1 h, 체크 섬유 소 젤 완전히에 의해 신중 하 게 형성 되는 접시를 기울이기. 접시를 기울이면, 나타내는 섬유 소 젤 형성 완료 되는 젤이 움직이지 않는 때 3.10 단계로 진행 합니다.
10. 오버레이 FT/섬유 소 젤와 ex vivo 문화 매체 (600 μ/24-잘 접시에 잘) 또는 300 μ/48-잘 접시에 잘 100 μ g/mL aprotinin 보충. Drop-wise 분배 하 여 매체를 부드럽게 플라스틱.
    참고: 여기, aprotinin 사용 됩니다 섬유 소 젤의 저하를 방지 하기 위해 FTs^13,14에 의해 표현 하는 세포질 프로 테아 제에 의해. ex vivo 문화 매체 또한 보완 될 수 있습니다 VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ 등 재조합 성장 인자와 함께 (참조 테이블의 재료)¹¹.
11. 원하는 시간 동안 (예를 들어, 2 월 18 일, 기간 테스트할 필요가 있을 것 이다 더 이상 문화) 37 ° C, 5% CO₂ 셀 문화 인큐베이터 및 문화에 다시 비보 문화 접시 전 피트를 놓습니다. 3 일 마다 신선한 ex vivo 문화 매체와 매체의 50%를 교체 합니다.

4. "매트릭스"에서 영상

1. (0 일) 같은 날 비보 문화 전 피트의 이미지를 수집 하 고 설정 된 간격 (예: 매일)를 사용 하 여 거꾸로 epifluorescence 현미경, 3D 성장에 따라.
   참고: 가져온 이미지 사용할 수 있습니다 두 개의 수직 직경의 총 길이로 피트 파생물의 정량화에 대 한 explant¹¹에서.

5. 네이티브 피트 및 전 비보 문화 끝점

참고: FT/섬유 소 젤 원하는 기간 (ex vivo 문화 FT)에 대 한 비보 전 경작 하거나 네이티브 피트 특성화¹¹같은 날 (네이티브 FT)에 고정 될 수 있습니다.

1. 네이티브 피트 또는 vivo 문화 전 피트 1 mL/PBS 솔루션, 실시간에서 1 시간에에서 4 %paraformaldehyde 문화 매체를 대체 하 여 수정 네이티브 FT/섬유 소 젤, 0.5-1 수정 전 추가 후 h 비보 문화 매체 (섬유 소 젤 하지 중간에 배어 되어 있다, 고정 됩니다 손상 그들).
   참고: paraformaldehyde 이다 부식성, 독성 및 발암 성 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
2. PBS에와 3 5 분 세척 FT/섬유 소 젤을 씻어 (2 mL/음).
3. 2 mL / 0.02% 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS의 PBS를 장착 하 고 추가 처리까지 4 ° C에서 고정된 섬유 소 젤을 저장. FT/섬유 소 젤 저장소에 건조 하지 않습니다 보장 하기 위해 파라핀 영화와 함께 접시를 봉인.
   참고: 나트륨 아 지 드는 독성 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.

6. 전체-마운트 면역 형광 염색

참고:이 프로토콜 5 일을 지속 하 고 밤새 외피와 함께 중단 될 수 있습니다 어디에 표시. 섬유 소를 젤 어느 시점에서 건조 하지 마십시오. 모든 단계는 명시 되지 않는 한 RT에서 수행 됩니다.

1. 얼룩 프로토콜을 시작 하기 전에 다음과 같은 솔루션을 준비 합니다.
   1. 후 고정 솔루션: 같은 양의 아세톤과 메탄올을 혼합 하 여 50: 50 아세톤: 메탄올 솔루션을 준비 (예를 들어, 50 mL). -20 ° c.에 게 하루 전에 얼룩에 최신이 솔루션을 준비 합니다. 이 솔루션은-20 ° C에 다시 저장할 수 있습니다 하 고 후속 stainings에 사용할 수 있습니다.
      참고: 아세톤과 메탄올은 인화성 및 건강에 유해 증기 두건에서이 솔루션을 준비 합니다.
   2. 차단 솔루션: 준비 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 0.3 %octyl 페 놀 ethoxylate 솔루션 PBS에서 첫 번째 추가 15% FBS PBS에. Octyl 페 놀 ethoxylate를 추가 하 고 해산 저 어. 4 ° c.에 게
      참고:이 솔루션 준비 수 있습니다 될 큰 금액에서 사전에-20 ° C에서 15 mL aliquotes에 저장 하 고 얼룩 프로토콜을 시작 하는 날에 사용 하기 전에 해 동. 갓 또는 갓 해 동 aliquote를 사용 하 여 각 얼룩 프로토콜에 대 한.
   3. 세척 솔루션: 0.45 %octyl 페 놀 ethoxylate ethoxylate octyl 페 놀의 4.5 mL PBS의 995.5 mL에 추가 하 여 보충 하는 PBS의 1 리터를 준비. 분해를 저 어. 실시간에 저장소
2. 스테인리스 스틸 광장 예리하게 주걱을 사용 하 여 접시에서 신중 하 게 방울을 들어올립니다. 센터, 운동 하기 전에 가장자리에서 먼저 드롭릿에 분리 하 고 PBS의 1 mL를 포함 하는 12-잘 접시의 전송.
   참고:이 판 형태로 후 정착, 세척 및 차단 단계를 수행 합니다.
3. 후에 방울 1 mL ~ 1 분 (작은 물방울의 테두리 흰색 바뀝니다) 얼음 처럼 차가운 50: 50 아세톤: 메탄올 솔루션을 수정.
   참고: 아세톤과 메탄올은 건강에 유해 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
4. 2 ml PBS (방울 싱크대 것입니다 PBS 솔루션에 완료 되 면 재)의 3-5 세척 린스 합니다.
   참고: 포스트 고정 후 그들은 플라스틱 끈 적으로 피 펫 팁과 방울을 만지지 마십시오. 프로토콜을 통해 발음 후 수정, 항 체를, 및이 손상 될 수 있습니다 또는 작은 물방울을 완전히 파괴, 흡입 하 여 솔루션을 세척 하지 마십시오. 대신, 접시를 기울기 고 신중 하 게 500-5000 μ 피 펫을 사용 하 여 솔루션을 제거 합니다.
5. 21000 x g와 4 ° C에서 15 분 동안 차단 솔루션 파편을 제거 하기 위해 원심.
   참고: 솔루션 원심 분리에 대 한 1.5 mL 튜브에 aliquoted 수 있습니다. 사용 하지 않는 솔루션 4 ° C에 저장 하 고 모든 관련 후속 단계에 사용할 수 있습니다.
6. 500 μ에 물방울을 품 어 실시간에서 2 h에 대 한 솔루션을 차단
   참고: 사용 하는 솔루션을 차단의 볼륨을 줄이기 위해 접시 기울이면 수 있습니다 지원에 고 솔루션/드롭릿은의 약간 300 μ를 사용할 수 있습니다.
7. 솔루션 및 원심 분리기 21000 x g 15 분 및 4 ° c.에 대 한 차단에 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체 혼합물 (적어도 30 μ/드롭릿은) 준비
8. 라운드 (U)으로 작은 물방울 전송-라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 96 잘 접시를 바닥 및 4 ° c.에 하룻밤 1 차적인 항 체 혼합물의 적어도 30 μ/드롭릿은 함께 품 어
9. 다음 날, 전송 12-잘으로 물방울 접시 세척 솔루션/잘 포함 2 mL에 린스 3 5 분 첫 번째 그리고 9 30 분 세척을 씻어. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
10. 다음 날, PBS로 3 번을 씻어 하 고 라운드 (U)으로 작은 물방울 전송-96 잘 접시 바닥.
11. 세척, 동안 차단 솔루션 및 21000 x g와 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기에 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 혼합물 (희석된 1: 500, 적어도 30 μ/드롭릿은) 준비
12. 라운드로 작은 물방울 전송 (U)-라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 96 잘 접시를 바닥 및 4 h RT, 빛 으로부터 보호에 대 한 2 차 항 체 혼합물의 적어도 30 μ와 품 어.
    참고: 모든 후속 외피와 세척 단계 빛 으로부터 보호를 수행 합니다.
13. 솔루션/잘 라운드 모서리 주걱, 3 5 분 세척과 린스를 먼저 사용 하 여 세척의 그리고 4 개의 30 분 세척 2 mL를 포함 하는 12-잘 접시에 방울을 전송 합니다. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
14. 다음 날, 5 30 분 세척으로 젤과 PBS 가진 다음 3 번 씻어. 밤새 4 ° c.에 마지막 세척 (2 mL)를 두고
15. 다음 날에는 라운드로 작은 물방울 전송 (U)-실시간에 30 분 동안 10 μ g/mL Hoechst 핵 얼룩 (적어도 30 μ/드롭릿은)와 함께 배양 하 여 라운드 모서리 주걱 counterstain 핵을 사용 하 여 96 잘 접시 바닥
    참고: 중간 보충 4'를 탑재, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 핵 counterstaining에 대 한 대 안으로 사용할 수 있습니다. 어떤 경우에,이 단계와 단계 6.16는 생략, 직접 단계로 6.17 진행.
16. 2 mL의 PBS/라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 포함 된 12-잘 접시에 작은 물방울 전송 및 PBS로 세 번 씻어.
17. 다음과 같이 현미경 슬라이드에 방울을 탑재.
    1. 사각형 모양의 22 x 22 mm coverglass의 가장자리에 빠른 경화 설치 매체의 좁은 레이어를 적용 하 고 ~ 1 분 동안 건조 하자. 이 단계를 수행이 각 강하 개별적으로 설치 매체의 과도 한 경화를 방지 하려면.
       참고: 빠른 경화 설치 매체는 건강에 유해 증기 두건에서이 단계를 수행 합니다.
    2. 이온된 수의 2 개 mL를 포함 하는 12-잘 접시의 우물에 담거 서는 물방울을 헹 구 고 라운드 모서리 주걱을 사용 하 여 현미경 슬라이드에 전송. 흡수 성 종이의 작은 조각을 사용 하 여 초과 물을 제거 합니다.
    3. 분배는 물방울에 비 경화 antifade 장착 매체의 15 μ.
       참고: 또는, Hoechst 핵 얼룩 사용 되지 않은 경우 4'를 포함 하는 매체를 장착 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 사용할 수 있습니다.
    4. 부드럽게 커버 유리는 물방울 이상의 현미경 슬라이드를 직면 하 고 빠른 경화 설치 매체와 놓고 정착 하자.
       참고: 빠른 경화 매체 현미경 슬라이드에 충실 하 고 자리에는 작은 물방울을 유지 것입니다.
18. 모든 작은 물방울에 대 한 6.17 단계를 반복 합니다. 각 현미경 슬라이드에 두 방울을 탑재 합니다.
19. 슬라이드 RT에서 ~ 2 시간 건조 하 고 하룻밤 4 ° C에서 저장 하자. 슬라이드는 수평으로 위치 하 고 빛 으로부터 보호 확인 하십시오.
20. 이미지 스테인드 네이티브 또는 ex vivo 문화 confocal 현미경 또는 광학 단면 함수 및 20 x 40 x 목표를 갖춘 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 끝점 피트. 타일 함수를 사용 하 여 조직의 더 큰 영역을 한 번에 캡처.

PDR fibrovascular 조직 속성 및 단백질 식의 이해 유리 샘플 및 얇은 조직학 피트 섹션^3,15,,1617에 주로 의존 하고있다. 방법을 개발 3D 조직 조직의 철저 한 조사와 PDR의 다세포 physiopathological 프로세스에 대 한 밖으로 설정 우리 수술 삭제, 활용 하 하 환자-파생 병 적인 FTs 3D 특성화 고 vivo 문화 예. 신선한 FTs 연구 실험실으로 전송 하 고 도식 워크플로에서 그림 1에서 볼 수 있듯이 처리 됩니다.

FTs는 질적 평가 설명서 (그림 2)에 대 한 해 부 하기 전에 몇 군데 있습니다. 그림 2에서처럼 FTs 크기, 밀도 및 혈관 구조의 큰 간 환자 편차를 표시 합니다. 일부 조직, 느슨한 셀, 아마도 염증/면역 세포, 적혈구에 (그림 2)를 구별 뿐만 아니라 다른 구경의 안타 혈관 구조는 쉽게 하실 수 있습니다. 해 부, 후 결정 획득된 explants의 제한 번호의 다운스트림 사용에 만들어질 필요가 있다. explants의 일부 섬유 소 매트릭스에 포함 하 고 나머지 explants vivo 문화 (그림 1) 별도 접시에 전을 대상이 될 수 있는 하는 동안 섬유 소 젤 형성 후 고정. 신선한 FTs는 또한 성공적으로 이용 되어 ultrastructural 특성에 대 한 전자 현미경에 의해. 샘플 하나 ultrathin 섹션의 기존 전송 전자 현미경 (TEM) 또는 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 (SBF-SEM)^3,11처리 될 수 있습니다.

고정 된 섬유 소 젤 몇 주 동안 저장 하 고 전체-마운트 면역 형광^18,19스테인드 수 있습니다. 얼룩진된 샘플 마찬가지로 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 때 안정 되어 있다. 두꺼운 FT/섬유 소 젤 epifluorescence 현미경 광학 단면 기능, 흩어져 밖으로의 초점 빛을 제거 하는 데 유용을 탑재 시간 효율적으로 몇 군데 있을 수 있습니다. 이 방법으로 영상 구조 좋은 시각화를 제공합니다. 또는, confocal 현미경 검사 법, 미세한 세부 사항 캡처 수 있습니다 더 많은 시간이 요구, 비록. 특성의 갓 섬유 소 포함 고정, 전체 마운트 면역 형광에 의해 미, 네이티브 FTs 수 혈관 구조, 여러 세포 유형 및 3D PDR 조직 내의 그들의 상호 합의의 특성 ^11을풍경입니다. 예를 들어 CD31 항 체 endothelium을 표시 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 Lyve1 항 체를 새로 구상 하는 동안 pericytes (그림 3)를 표시 하려면 NG2 발견 림프 같은 내 피 구조 (그림 4)¹¹. 항 체의 여러 조합은 사용하실 수 있는 시각화 여러 구조와 세포 유형 ( 재료의 표참조); 예를 들어 르 그 또한 비정상적인 PDR neovasculature에 discontinuos 식 패턴을가지고 있는 피를 시각화할 수 있습니다. 막 표시 (예, CD31 및 Lyve1)와 함께 묻은 혈관 구조 수 양적 분석 보존 및 밀도 대 한 Angiotool, NIH 국립 암 연구소¹¹,^{에 의해 개발 된 무료 소스 소프트웨어를 사용 하 여 20}. 3D 볼륨은 데이터 집합 획득된 (비디오 1참조)에서 렌더링할 수 있습니다. 항 체 전체 마운트 면역 형광 검사에 적합 하지 않으면 섬유 소 방울 수 또는 수 파라핀에 포함 된, 얇은 섹션을 잘라내어 immunohistochemistry 분석. 이 경우에 방울 실시간에서 1 시간 대신 4 ° C에서 하룻밤 고정에서 혜택

비보 전 문화는 이미 이틀 (그림 5) 후 셀룰러 outgrowths 개발, 섬유 소 포함 FTs의 성장을 격려. 생체 외에서 섬유 소 젤 매트릭스에 새 PDR neovessels와 직접 접촉에서 혈관 누설의 사이트에서 혈 청 fibrinogen의 트 롬 빈 분열 후 형성 하는 ex vivo 문화, 이후 그것은 생체 조건 임시 ECM 대표에 대 한 사용 되는 거리 환경^15,,2122염증이.

PDR은 신생 및 거리 응답 특징 microvascular 합병증 그리고 피트 explants 문화,이 세포 레 퍼 토리를 유지 뿐만 아니라 문화 미디어¹¹에 추가 하는 외 인 자극에 효율적으로 대응. 그림 6 의 대표적인 데이터 표시 그 PDR ex vivo 문화 유도 TGFβ 유도 거리 응답 파생물 반영 하는 동안, VEGFA에 CD31-긍정적인 endothelium 및 맥 관 구조 보존의 돋 아 NG2 긍정적인 pericytes/SMCs입니다. 여러 외 인 자극은 시험 될 수 있다 하 고, ex vivo 문화 모델 개발된 여기 PDR 소설 microenvironment 및 컨텍스트 종속 PDR 병 적인 메커니즘 수 없는 계시 할 수 있다 때 그들의 생체 조건 vitreal 풍부의 측정에 의해, 고정된 조직 자료에 시각.

그림 1입니다. 비보 전 PDR fibrovascular 조직 문화 모델. Explants에의 해 부 및 3 차원 특성화 및 비보 전 문화에 대 한 섬유 소를 포함 하는 피트의 절단에 대 한 vitreoretinal 수술 (동위 플 vitrectomy)에서 워크플로의 도식 적인 표현입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 갓 해 부 이전 PDR fibrovascular 조직 excised. 절 개 전에 찍은 갓 삭제 FTs의 contast 현미경 단계. FTs는 크기, 밀도 및 혈관 구조의 풍부한 매우 다양. 화살표는 서로 다른 구경의 혈관 구조를 나타냅니다. 부분적으로 투명 한 운용 다른 구경의 두 개별 용기를 강조 한다. 이미지는 5 배, 0.15 수 가늠 구멍 (NA), 목표는 거꾸로 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 전체-마운트 네이티브 PDR fibrovascular 조직 면역 형광 검사. 출신의 Epifluorescence 현미경 사진 PDR 피트 전체 마운트 면역 형광에 의해 스테인드. CD31 (A, 녹색) 시각화 NG2 동안 피 (B, 빨간색) 시각화 불규칙 한 신생 구조 내에서 pericytes. 병합 된 이미지 (C)에 표시 됩니다. DAPI (파랑) counterstain 핵을 시각화. 이미지 광학 단면 기능 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 촬영 되었고 컴퓨터 제어 1.3 메가 픽셀 흑백 CCD 카메라와 이미지 수집 소프트웨어, 40 x, 1.4 나, 석유 목표를 사용 하 여 결합. 9 광 섹션 이미지 프로세싱 소프트웨어 ImageJ를 사용 하 여 결합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4입니다. 전체-마운트 네이티브 PDR fibrovascular 조직 면역 형광 검사. 출신의 Epifluorescence 현미경 사진 PDR 피트 전체 마운트 면역 형광에 의해 스테인드. CD31 (A, 녹색) Lyve1 동안 endothelium 시각화 (B, 빨간색) 새로 발견된 된 림프 같은 내 피 구조를 시각화. 병합 된 이미지 (C)에 표시 됩니다. Hoechst 33342 (블루) counterstain 핵을 시각화. 이미지 광학 단면 기능 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 촬영 되었고 컴퓨터 제어 1.3 메가 픽셀 흑백 CCD 카메라와 이미지 수집 소프트웨어, 20 배, 0.8 나, 목표를 사용 하 여 결합. 4 개의 광학 섹션 이미지 프로세싱 소프트웨어 ImageJ를 사용 하 여 결합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5입니다. PDR fibrovascular 조직 성장의 비보 전. 단계 대조 현미경 사진 표시 시간 포인트 (일)에 2 피트 ex vivo 문화. FTs 성장 비보 문화, 전 이미 2 일 후 세포 outgrowths 개발. 이미지를 거꾸로 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 5 배, 0.15 나 목적으로 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6입니다. 전체-마운트 PDR fibrovascular 조직 ex vivo 치료 (CTRL), 또는 VEGFA 또는 TGFβ의 존재에 있는 경작의 면역 형광 검사. 피트의 Epifluorescence 현미경 사진 ex vivo 치료 (CTRL) 또는 VEGFA 또는 TGFβ의 존재에 9 일 동안 배양 하 고 이후 전체 마운트 면역 형광에 의해 스테인드. CD31 (녹색) 시각화 endothelium NG2 (빨간색)는 pericytes을 시각화 하는 동안. DAPI (파랑) counterstain 핵을 시각화. TGFβ 유도 거리 응답 하는 동안 VEGFA는 맥 관 구조를 안정화 합니다. 이미지 광학 단면 기능 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 촬영 하 고 컴퓨터 제어 1.3 메가 픽셀 흑백 CCD 카메라와 이미지 수집 소프트웨어, 20 배, 0.8 나, 목표를 사용 하 여 결합 했다. 9 광 섹션 이미지 프로세싱 소프트웨어 ImageJ를 사용 하 여 결합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

비디오 1. 네이티브 피트의 3D 볼륨 재구성 전체 마운트 면역 형광에 의해 스테인드. CD31 (녹색), Lyve1 (빨간색). Hoechst 33342 counterstain (블루) 핵을 시각화. 이미지 광학 단면 기능 직 립 epifluorescence 현미경을 사용 하 여 촬영 되었고 컴퓨터 제어 1.3 메가 픽셀 흑백 CCD 카메라와 이미지 수집 소프트웨어, 20 배, 0.8 나, 목표를 사용 하 여 결합. 3D 볼륨 재구성 및 비디오 렌더링 상용 소프트웨어를 사용 하 여 수행 되었다. 비디오의 일부는 Gucciardo 그 외 여러분 에서 허가로 증 쇄 ¹¹. 하시기 바랍니다 여기를 클릭 하십시오가이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)

신뢰할 수 있는 기능 셀 및 분자 기계 결과 대 한 관련 조직 microenvironment의 중요성을 고려 하면이 조직 환경을 제공 하는 적절 한 실험 모델을 찾을 수 필수적입니다. 여기 설명 비보 전 PDR 문화 모델을 섬유 소 포함 FTs PDR 임상 샘플의 네이티브, 복잡 하 고 다세포 컨텍스트에서 PDR 이상의 메커니즘의 조사 수 있습니다.

프로토콜 내에서 중요 한 단계는 적절 한 섬유 소 젤 형성, FT는 착 색 하는 동안 적절 한 세척의 위치. 섬유 소 젤 형성 농도 및 온도 의해 영향을 트 롬 빈 활동에 주로 달려 있기 때문에 트 롬 빈 양의 섬유 소 젤 준비의 모든 일괄 처리에 대 한 조정 될 필요가 있다. 섬유 소 젤 형성 피트 explants의 2D 성장을 방지 하지만 또한 가로 및 세로로 작은 물방울의 센터에 피트의 위치 수 있도록 충분히 천천히 충분히 빨리 해야 합니다. FT는 물방울의 가장자리에 발생 하는 경우에서 추가 pipetting 센터 피트의 배치 원조 수 있습니다. FTs는 여전히 작은 물방울의 가장자리에 남아 또는 그 차원에서 성장 제외 해야 합니다. 적절 한 세척 얼룩이 지 고 피하는 동안 작은 물방울의 건조가 차례로 얼룩을 최적화 하 고 배경 신호를 최소화 합니다. 전송 시간이 중요 한 될 수 있습니다. 최대 FTs를 포함 우리 vitrectomy 후 두 시간 및이 전에 영향을 주지 않았다 vivo 성장. 긴 전송 시간 문화 성공에 미치는 영향 테스트 해야 합니다.

이 프로토콜은 피트 포함에 대 한 대안 매트릭스를 사용 하 여 수정 될 수 있습니다. Vivo에서, PDR neovessels 성장 유리 체 피 질 쪽으로 풍부한 콜라겐²³. 그러나, 혈관 누설 혈 청 구성 요소, fibrinogen를 포함 하 여 시 거리 응답 시작 되 면 혈관에 가까운 근접에서 유리에 분해. 따라서, 생체 외에서 섬유 소 혈전 이용 되었다 여기 전 대 한 임시 ECM을 typify 위하여 vivo 문화 형성 PDR^15,,2122의 염증이 거리 환경에서. 또는, 섬유 소 혈전 laminin와 모세 혈관, 돋 아의 안정성을 변경할 fibronectin 보충 수 또는 explants는 포함 될 수 내 콜라겐과 다른 혼합된 행렬에서 가장 거리 microenvironments를 typify 타입 신생 조직입니다. 이러한 매트릭스는 일반적으로 3 차원 문화에 적합 하 고 전체 마운트 면역 형광 검사 하지만 PDR FTs에 그들의 효과를 테스트할 수 남아 3D 매트릭스 형성의 타이밍에 고려 2D를 방지 하기 위한 제한 내로 유지 하기 위해 필요 합니다. 성장^18,19. 팀 작업;와 긴 전송 시간을 보상 수 병원 연구 단위의 물리적 근접 한계를 나타내는 경우 TA 솔루션 준비, fibrinogen 살 균 여과 및 섬유 소 젤 형성 테스트 피트 전송 하는 동안 수행할 수 있습니다. 1 시간 후에 섬유 소 젤을 형성 하지 않는다, fibrinogen 또는 TA 솔루션 준비에 문제가 생겼다 수 있습니다. 이 경우에, FT/섬유 소 젤을 사용할 수 없습니다.

이 접근의 한계 처럼 모든 전 비보 접근, 개인 뿐만 아니라 내 환자와 환자 간 조직이 기본 조직 표본의 변수 품질. 당뇨 환자 경우이 다양성의 일부 vascularization와 질병, 대사 상태, 유전/epigenetic 요인, 당뇨병과 조직 치료의 종류의 기간 같은 수많은 요인에 따라 달라 지는 섬유 증의 정도를 포함 한다. 복구 수술 PDR 피트의 크기는 각 표본 조사 될 수 있는 조건의 수에 제한 요소 이기도 합니다. 상호 공간 정보 제공, 전체 마운트 면역 형광 검사 제한 된 양의 기능/드롭릿은 당 마커 조사 수 있습니다. 타협로 섬유 소 방울 수 또는 수 파라핀에 포함 된, 얇은 섹션을 잘라내어 immunohistochemistry에 의해 분석.

기존 당뇨병 마우스 모델 초기 단계 박사의 많은 기능을 개발 하지만 인간의 PDR, 따라서 PDR 질병 메커니즘^7,8의 연구를 방해에서 발생 하는 진보적인 변화를 종합적으로 정리 하지. 또한, murine 눈은 근본적으로 다른 사람의 눈에 더 인간의 질병²⁴공부의 중요성을 강조 하는 황 반 부족. 수술 PDR FTs가도 무시 이전, 또는 RNA 시퀀싱 또는 해리 셀^{3,25의 2D 문화 대량 파라핀 섹션, 전송 전자 현미경 검사 법, 직렬 블록 얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사 법 사용} . 여기 설명된 모델 기본 질병 조직 microenvironment에서이 귀중 한 수술 재료의 3 차원 특성 뿐만 아니라 PDR 이상 조사를 수 있습니다. 유리 같은 액체의 사용과 함께,이 모델 또한 하면 모두 휴대 하 고 acellular PDR microenvironment의 기여의 조사. 문화에 효율적으로 응답 bFGF, VEGFA, 같은 유리 체에서 감지 된 성장 요인 VEGFC 및 TGFβ, 따라서 업과 PDR 이상, ex vivo 문화 모델이이 PDR의 기능 이므로 테스트 또는 새로운 PDR 치료 ^{개발에 대 한 의무가 11}.이 모델에서 안티 VEGFA 모 세관 돋 아 방해 하 고 모 세관 회귀의 표시는 안티 VEGFA 치료^26,27의 예상된 임상 결과와 일치 하는 응답을 유도. 따라서,이 모델 또한 더 나은 안티 VEGFA 및 코르 티 코 스테로이드 치료를 포함 하 여 현재 치료의 효과 이해 하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 셀 이미징 계측, 여기 설명된 된 비보 전 문화 모델 혈관 회귀, 돋 아과 세포가 소성 같은 프로세스의 실시간 조사에 있도록 시간 경과 현미경을 받게 될 수 있습니다. 생체 외에서 그리고 vivo에서 모델 뿐만 아니라 임상 데이터와 결합 하면, ex vivo PDR 모델이 마커를 식별의 특정 세트에 따라 환자 응답을 조사에 도움이 될 것입니다, 그리고 한 걸음 더 가까이 위한 애비뉴 맞춤 의학. 환자 관련 응답 또는 응답 관련 마커를 식별 하는 것입니다 microvascular의 복잡 한 상호 작용으로 multifactorial 질병 인 PDR의 경우 특히 관련 된 신경, 대사, 유전/후, 면역학, 그리고 염증 관련 요인, 따라서 향상 된 치료 대상 및 질병 관리의 개발에 대 한 점점 더 다양 한 노력을 필요로. 전체-마운트 면역 형광 검사, 외 ex vivo 교양 FTs 수 또한 plasmin/낫 또 키나 제 치료는 섬유 소에서 검색 하 고 transcriptomic 및 proteomic 들어서는²⁸분석. 낫 세포 망막의 심한 경우에와 같은 다른 눈 조건에서 개발 된 fibrovascular 직물의 vivo 연구 전 여기 설명 된 모델의 적합성 또한 미래에 탐험 수 있습니다.

저자는 공개 없다.

저자는 대부분의 의료 및 외과 망막 동료, 간호사와 당뇨병 단위 및 Vitreoretinal 수술 장치 안 과학의 부, 헬싱키 대학 병원 채용에 적극적으로 참여에서 전체 직원에 감사 환자. 영상 시설에 감사 Biomedicum 분자 이미징 장치 하 고. 우리는 우수한 기술 지원을 위한 아나 체르넨코 감사합니다. 이 연구는 핀란드 아카데미 (KL), 헬싱키의 대학 (KL), Sigrid Juselius 재단 (KL), K. 알 요한슨 재단 (KL), 핀란드 암 연구소 (KL), 카롤 린스 카 Institutet (KL), 핀란드 눈 재단 (SL), 눈에서 교부 금에 의해 지원 되었다 고 조직 은행 재단 (SL), 메리와 게오르그 C. Ehrnrooth 재단 (SL), 및 HUCH 임상 연구 보조금 (TYH2016230, SL 후 TYH2018127), 의학 (예)의 박사 프로그램 뿐 아니라 당뇨병 연구 재단 (SL, kl 기를, AK, EG).