Ein Ex-Vivo-Gewebekultur-Modell für fibrovaskulärem Komplikationen bei proliferativer diabetischer Retinopathie

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie mit Patienten abgeleitet, chirurgisch herausgeschnitten, fibrovaskulärem Gewebe für dreidimensionale nativen Gewebe Charakterisierung und Ex-Vivo-Kultur zu studieren. Diese ex-Vivo-Kultur-Modell ist auch für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden.

Diabetischer Retinopathie (DR) ist die häufigste mikrovaskuläre Komplikation des Diabetes und eines der führenden Ursachen für Erblindung im erwerbsfähigen Alter Erwachsene. Keine aktuellen Tiermodellen für Diabetes und Sauerstoff-induzierte Retinopathie entwickeln die Fullrange-progressive Veränderungen in menschlichen proliferative diabetische Retinopathie (PDR) manifestiert. Daher hat Verständnis für die Krankheit Pathogenese und Pathophysiologie stützte sich weitgehend auf den Einsatz von histologischen Abschnitte und Glaskörper Proben in den Ansätzen, die nur stationäre Informationen über die beteiligten pathogenen Faktoren. Erhöhung der Beweis zeigt an, dass dynamische Zell-Zell und Zelle-extrazelluläre Matrix (ECM) Interaktionen im Zusammenhang mit der dreidimensionalen (3D) Mikroumgebungen essentiell für die mechanistischen und funktionellen Studien zur Entwicklung der neu Behandlungsstrategien. Daher vermutet wir, dass die pathologische fibrovaskulärem Gewebe chirurgisch herausgeschnitten aus Augen mit PDR genutzt werden könnte, um zuverlässig die zellulären und molekularen Mechanismen dieser verheerenden Krankheit zu entwirren und das Potenzial für Roman klinischen testen Interventionen. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine neuartige Methode für 3D ex-Vivo-Kultur der chirurgisch herausgeschnitten Patienten abgeleitet fibrovaskulärem Gewebe (FT), die als ein Modell der menschlichen PDR Pathophysiologie dienen wird. Die FTs in Explantaten zerlegt und eingebettet in Fibrin-Matrix für ex-Vivo-Kultur und 3D Charakterisierung. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz der native FTs und Endpunkt Kulturen ermöglicht gründlichen Untersuchung der Zusammensetzung und mehrzelligen Prozesse, Hervorhebung der Bedeutung des 3D Gewebe-Ebene Charakterisierung für die Aufdeckung relevanten Merkmale der PDR Pathophysiologie. Dieses Modell ermöglicht die gleichzeitige Bewertung der molekularen, zellulären/Gewebe Prozesse und Behandlung Antworten im Zusammenhang mit komplexen dynamischen biochemischen und physikalischen Wechselwirkungen innerhalb der PDR Gewebearchitektur und Mikroumgebung. Da dieses Modell PDR Pathophysiologie rekapituliert, wird es auch zum Testen oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden zugänglich sein.

DR ist eine schweren okulären Komplikation bei Diabetes, eine Krankheit, die in den letzten drei Jahrzehnten¹enorme Ausmaße angenommen hat. Zwanzig Jahre nach Diagnose, praktisch jeder Patient mit Diabetes Typ 1 und 60 % der Patienten mit Typ 2 Diabetes vorliegenden Anzeichen von Retinopathie, machen Diabetes per se eine der führenden von Blindheit im Alter Erwachsene²arbeiten Ursachen. Nach dem Stand der mikrovaskuläre Degeneration und ischämischen Schäden ist DR in nicht-proliferative DR (PDR) und proliferative DR (PDR) eingeteilt. Die Ende-Stadium der Erkrankung, PDR, zeichnet sich durch Ischämie und Entzündung-induzierte Neovaskularisation und fibrotische Reaktionen an der vitreoretinalen Grenzfläche. In unbehandeltem Zustand werden diese Prozesse zur Erblindung aufgrund neovaskulären Glaukoms^3,4, Glaskörperhämorrhagie, Netzhaut Fibrose und Verwindungskräfte Netzhautablösung führen. Trotz der jüngsten Fortschritte gezielt aktuelle Behandlungsmöglichkeiten nur DR Bühnen, darunter diabetischen Makulaödems und PDR, wenn Netzhaut Schaden bereits folgte hat. Darüber hinaus profitiert ein großer Teil der DR-Patienten nicht von aktuellen Behandlung Rüstzeug, zeigt einen dringenden Bedarf an verbesserten Therapien^4,5,6.

Mehrere andere ichn Vivo Krankheit/Entwicklungsstörungen Modelle und diabetischen Tiermodell bisher entwickelt worden, aber keiner von ihnen rekapituliert das gesamte Spektrum der pathologischen Funktionen im menschlichen PDR^7,8beobachtet. Darüber hinaus deutet auf zunehmende Beweise Behandlung Antworten der ECM Zusammensetzung als auch die räumliche Anordnung und Interaktion zwischen der zellulären und azellulärer Mikroumgebung⁹eng verbunden sind. Wir wollten daher um eine klinisch relevante Modell der menschlichen Laos zu entwickeln, durch die Nutzung der FT pathologischen Materials, das häufig aus einer Vitrektomie im Rahmen des chirurgischen Managements von PDR¹⁰Augen herausgeschnitten wird.

Dieses Manuskript beschreibt das Protokoll für die 3D ex-Vivo-Kultur und Charakterisierung der chirurgisch herausgeschnitten, PDR Patienten gewonnenen pathologischen FT. Die hier beschriebene Methode hat in einer kürzlich erschienenen Publikation verwendet wurden, die erfolgreiche Dekonstruktion der native 3D PDR Gewebe Landschaft und Zusammenfassung der Merkmale des PDR Pathophysiologie einschließlich angiogenen und fibrotische Reaktionen die abnorme nachgewiesen vaskulären Strukturen¹¹. Dieses Modell zeigte auch, dass neue Features, die leicht von histologischen Dünnschliffe, wie räumlich geschätzt werden können nicht Apoptose und Proliferation sowie vaskuläre Inselchen Bildung¹¹beschränkt. Glasigen Flüssigkeit wurde erfolgreich von anderen 3D endotheliale Sphäroid Kulturen, seine angiogenen Potenzial zu bewerten und die Wirksamkeit von Angiostatic Moleküle¹²eingesetzt. In Kombination mit einer in-vitro- 3D lymphatische Endothelzellen (LEC)-Sphäroid sprießen Assay mit PDR Glaskörper als Stimulans deckte unser Modell der Beitrag der beiden lösliche Glaskörperblutung sowie lokale Hinweise innerhalb des neovaskulären Gewebes zur Faktoren noch schlecht verstandenen LEC-Beteiligung an PDR Pathophysiologie^3,11. Bei der Verwaltung der PDR ist vitreoretinalen Chirurgie routinemäßig durchgeführt und zugleich anspruchsvolle Verfahren. Wie chirurgische Instrumentierungen und Techniken kontinuierliche Weiterentwicklung und Raffinesse erleben, rechtzeitig und konservativen Entfernung von fibrovaskulärem proliferative Muster verbessert nicht nur die Vision Ergebnis, sondern auch von unschätzbarem Wert Gewebematerial für die Untersuchung der PDR Pathophysiologie und Behandlung Reaktionen in komplexen translationale Aspekte des lebender menschlicher Gewebe Mikroumgebung.

Diese Forschung wurde von der Institutional Review Board und Ethik-Ausschuß der Helsinki University Hospital genehmigt. Jeder Patient wurde unterschriebene Einverständniserklärung eingeholt.

1. Vorbereitung der Lösungen, Medien und Geräte

1. Bereiten Sie die folgende Ausrüstung vor der Entnahme des fibrovaskulärem Gewebes (FT), schnelle Bearbeitung zu gewährleisten.
   1. Steril-Autoklav zwei Mikrodissektion Pinzette.
   2. Bereiten Sie 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch auflösen 1 vorgewogene PBS Tablette (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO₄^-3) in 900 mL entionisiertem Wasser und unter Rühren auflösen. Passen Sie das Volumen des Wassers bis zu 1 L und steril-Autoklaven die fertige Lösung. Shop bei RT
   3. Die oben genannten Lösung und Ausrüstung in einem Korb, zusammen mit einem Einweg-steriles Skalpell, einer Kulturschale steril 6-cm-Zelle und fünf steril 12-Well Kultur Zellplatten zu sammeln.
2. Bereiten Sie eine 6 mg/mL Fibrinogen Lösung in Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS) durch Auflösen von 30 mg von Plasminogen-abgereicherte menschlichen Fibrinogen in 5 mL HBSS, mit einem 50 mL Schlauch eingetaucht in ein Wasserbad bei 37 ° C für mindestens 1 h.
   Hinweis: Diese Lösung kann vor Gebrauch im Wasserbad (37 ° C) für 7 h (maximal 10 h) gehalten werden.
3. Vorbereiten die Ex Vivo Kulturmedium durch Zugabe von 5 % fetalen Kälberserum (FCS) oder 5 % Humanserum, Endothelzellen Wachstum Zuschlag von 0,4 % 10 ng/mL rekombinanten menschlichen epidermalen Wachstumsfaktor, 1 μg/mL Hydrocortison und 50 μg/mL Gentamycin, im Handel erhältlich Endothelzellen Wachstumsmedium und halten Sie im Wasserbad bei 37 ° C bis zur Verwendung. Lagerung bei 4 ° C für bis zu einem Monat.

2. fibrovaskulärem Gewebe Dissektion

1. Sammle das fibrovaskulärem Gewebe (FT), das herausgeschnitten worden von menschlichen Themen in der Trans-konjunktivale Microincision vitreoretinalen Chirurgie, von 23 oder 20 Gauge drei Anschlüssen Pars Plana Vitrektomie als Bestandteil der vitreoretinalen chirurgische Behandlung der PDR.
   Hinweis: Die FT ist mit Segmentierung und Delamination, schneiden, wenn nötig mit Microscissors und aus dem Glaskörper Hohlraum mit intraokularen Ende packenden Mikrozangen entfernt von erfahrenen vitreoretinalen Chirurgen herausgeschnitten. Äußerste Sorgfalt muss, intakt, unbeschädigte FT zu entfernen, ohne dass Schäden an okulären Strukturen einschließlich der Sehnerv oder zeitliche vaskulären Arcade-wo das pathologische neovaskulären Gewebe am häufigsten befindet werden. Die Größe der ausgeschnittenen Gewebe ist variabel, in der Regel zwischen 3 und 50 mm².
2. Halten Sie die FT in einem 6 cm Zelle Kulturschale oder 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL sterile PBS auf nassem Eis platziert, und übertragen Sie es sofort zum Labor für die Verarbeitung zu recherchieren.
   Hinweis: Es ist wichtig, dass die Forschergruppe (Laboreinrichtungen) physisch in der Nähe von Krankenhaus-OP-Saal (OR) sind die Transferzeiten von der kleinen ausgeschnittenen FT zu minimieren. In diesem Fall die Übertragung dauert weniger als 5 Minuten und der Explantate sind eingebettet in Fibrin in der Regel in 1-1,5 h (maximal 2 h) nach operativer Entfernung. Die Auswirkungen der längere Übertragungszeiten auf die 3D Kultur hätte geprüft werden müssen.
3. Legen Sie die FT in der 6-cm-Zelle Kulturschale mit 1 mL PBS bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C) und Abrufen von Bildern des Gewebes mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Objektiv 5 X.
   Hinweis: Bilder sind für die qualitative Bewertung und Dokumentation erworben. Es werden die Gewebe Größe, Dichte und allgemeine Zusammensetzung (z. B. vaskulären Strukturen) zu beobachten.
4. Schneiden Sie die FT in ~ 1 mm² Stück unter eine aufrechte Dissektion Stereomikroskop, ein steriles Skalpell und Mikrodissektion Pinzette. Halten Sie das Gewebe gut getaucht in PBS mit einer Pinzette Mikrodissektion und führen Sie klare Schnitten mit einem sterilen Skalpell. Vermeiden Sie reißen FT, die native fibrovaskulärem Strukturen verändern würde.
5. Platzieren Sie jedes einzelne Stück in einen Brunnen von einer 12-Well Kultur Zellplatte, enthält 1 mL sterile PBS.
   Hinweis: Bei Bedarf sanft verteilt die FT auf den Teller, einer Pinzette Mikrodissektion, vor der Durchführung von Schnitten.

3. Casting aufrecht Fibrin Gel Tröpfchen für die Charakterisierung von Native FT und Ex-Vivo-Kultur

1. Steril-Filter die bereit Fibrinogen-Lösung in Schritt 1.2 mit einem 0,22-μm-Filter montiert in einer 10 mL Spritze vorbereitet.
2. Prepare Aliquote der Fibrinogen-Lösung (25 μL pro 1,5 mL-Tube) und halten Sie bei RT. Prepare ein Aliquot für Fibrin gel / jedes FT Stück erhalten, nachdem das sezieren, und ein paar zusätzliche Aliquote zum Testen des Fibrins gel-Bildung.
3. Bereiten Sie eine Lösung mit 4 Einheiten/mL Thrombin und 400 μg/mL Aprotinin, HBSS jenseits TA Lösung genannt, und halten Sie bei RT. Prepare so viel TA-Lösung je nach Bedarf, abhängig von der Anzahl der Stücke nach Dissektion erhalten (25 μL der TA-Lösung wird verwendet für jede FT/fibrin-Gel), und einen zusätzlichen Betrag (z. B. 250 μl) zum Testen der Fibrin-Gelbildung und um sicherzustellen, dass genügend Lösung in Gießen von Fibrin Gel Tröpfchen verfügbar ist.
   Hinweis: Thrombin ist erforderlich für Fibrin Polymerisation, während Aprotinin, um Abbau von Fibrin Gels zu verhindern durch zelluläre Proteasen, ausgedrückt durch das FTs^13,14hinzugefügt wird.
4. Testen Sie das Timing der Gelbildung Fibrin: 25 μL der TA-Lösung für die regelmÄÑig 25 μL Fibrinogen Lösung vorbereitet im Schritt 3.2 hinzufügen und mischen in der Röhre durch pipettieren und verzichten in der Kulturschale 6 cm Zelle mit einem anderen Pipette legen Sie auf 50 μL, , eine aufrechte Tröpfchen bilden.
   Hinweis: Das Fibrin Gelbildung in ~ 1 min erfolgen. Wenn dies mehr als 1,5 min dauert, kann die Konzentration von Thrombin in der TA-Lösung im Schritt 3.3 vorbereitet durch Zugabe von mehr Thrombin-Stammlösung erhöht werden. Ein Zehntel der ursprünglich verwendeten Volumen von Thrombin-Stammlösung können hinzugefügt werden, wiederholt, bis das Fibrin Gelbildung innerhalb 1,5 min auftritt. Die Gelbildung Fibrin ist entscheidend für die Dreidimensionalität der Kultur, verhindert schnelle Gel (innerhalb 1,5 Minuten) FT Stück sinken auf den Boden des Fibrin Gels, und kommen so in Kontakt mit der 2D Kunststoffoberfläche der Zelle Kultur-Platte, die 2D Zelladhäsion und Auswuchs führen kann.
5. Legen Sie ein FT-Stück in der Mitte des einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit einer sterilen Pinzette und entfernen Sie alle überschüssigen PBS Pipettieren mit einer 0,5-10 μl Pipette Saugkraft auf die FT zu vermeiden. Im Fall des Gewebes klebt an der Pinzette, eine zusätzliche Pinzette verwenden, um die Platzierung des Stückes Gewebe auf der Platte zu unterstützen.
   Hinweis: FT/Fibrin Gele können auch auf 48-Well-Platte zu verringern die Verwendung von Reagenzien gewirkt werden. Dies ist jedoch schwieriger, wenn der Raum begrenzt ist und Fibrin wird bei Kontakt mit der Wand gut verteilt.
6. Die 25 μL Fibrinogen Lösung regelmÄÑig im Schritt 3.2 25 μL der TA-Lösung hinzu, und 50 μL Mix in der Röhre festgelegten mit einem anderen Pipette pipettieren. Verzichten auf das FT-Stück auf der Platte gut aufgestellt und Pipette nach oben und unten 2 - 3 Mal um die FT-Stück in das aufrecht Tröpfchen, der FT eine 3D umgebende Matrix bereitzustellen sind.
   Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die FT nicht beim Pipettieren abgesaugt wird und dass sich keine Luftblasen bilden. Achten Sie auch mischen, Befreiung und Pipettieren schnell ausgeführt werden wie das Fibrin innerhalb 1,5 Minuten Gelbildung, wie in Schritt 3.4 getestet. Wenn Fibrin Gels auf 48-Well-Platte gießen, verwenden Sie stattdessen 20 μL der Fibrinogen-Lösung und 20 μL der TA-Lösung.
7. Wiederholen Sie die Schritte 3.5 und 3.6 für die FT-Stücke.
8. Ermöglichen Sie die Fibrin-Gele durch Inkubation der Platten in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂zu festigen.
9. Nach 0,5-1 kippen h, Check, die das Fibrin Gel sorgfältig komplett durch entsteht der Plattenrandes. Fahren Sie mit Schritt 3.10, wenn das Gel nicht bewegt, wenn die Platte gekippt wird, darauf hinweist, dass das Fibrin Gelbildung abgeschlossen ist.
10. Überlagern der FT/Fibrin Gels mit ex-Vivo-Nährmedium (600 μl/Well in 24-Well-Platte) oder 300 μl/Well in 48-Well-Platte mit 100 μg/mL Aprotinin ergänzt. Pipette das Medium leicht durch drop-wise Dispens.
    Hinweis: Hier, Aprotinin dient zum Abbau von Fibrin Gels zu verhindern durch zelluläre Proteasen, ausgedrückt durch das FTs^13,14. Der ex-Vivo Nährmedium kann zusätzlich mit rekombinanten Wachstumsfaktoren wie VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ ergänzt werden (siehe Tabelle der Materialien)¹¹.
11. Setzen Sie die FT ex Vivo Kultur Platte wieder in 37 ° C, 5 % CO₂ Zelle Kultur Inkubator und Kultur für den gewünschten Zeitraum (z.B.2 - 18 Tage, mehr Kultur, die Perioden geprüft werden müssen). Ersetzen Sie alle drei Tage 50 % des Mediums mit frischen ex Vivo Kulturmedium.

4. "in Matrix" Imaging

1. Abrufen von Bildern von der FT ex Vivo Kulturen am selben Tag (Tag 0) und in festgelegten Intervallen (z. B. jeden zweiten Tag), mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop, um die 3D Wachstum folgen.
   Hinweis: Die Bilder können für die Quantifizierung von FT Auswuchs als die Gesamtlänge der beiden senkrechten Durchmesser über die modellabhängigen¹¹verwendet werden.

(5) native FT und Ex-Vivo-Kultur-Endpunkt

Hinweis: Die FT/Fibrin-Gele können ex Vivo für den gewünschten Zeitraum (FT ex Vivo Kulturen) kultiviert oder am selben Tag (native FT) für native FT Charakterisierung¹¹behoben.

1. Befestigen Sie die native FT oder FT ex Vivo Kulturen durch den Austausch des Kulturmediums mit 1 mL/gut 4 % Paraformaldehyd in PBS-Lösung für 1 h bei RT Fix für die native FT/Fibrin Gels, 0,5-1 h nach Zugabe der Ex Vivo Kultur Medium (wenn die Fibrin-Gele nicht im Medium getränkt worden, Fixierung wird beschädigt werden).
   Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug wie Paraformaldehyd ätzend, giftig und karzinogen ist.
2. Spülen Sie die FT/Fibrin Gele mit dreimaligem 5 min waschen in PBS (2 mL/Na).
3. Ersetzen der PBS mit 2 mL/auch von PBS mit 0,02 % Natriumazid und die feste Fibrin Gels bei 4 ° C bis zur Weiterverarbeitung zu lagern. Versiegeln Sie die Platten mit Paraffin Film um sicherzustellen, dass die FT/Fibrin-Gele nicht eingelagert trocken.
   Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug als Natriumazid giftig ist.

6. vollständig-hängen Immunfluoreszenz-Färbung

Hinweis: Dieses Protokoll dauert 5 Tage und kann unterbrochen werden, mit Übernachtung Inkubationen wo nicht anders vermerkt. Lassen Sie sich nicht das Fibrin Gels jederzeit trocken. Alle Schritte werden bei RT ausgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen vor Beginn der Färbung Protokolls.
   1. Post-Fixierung Lösung: bereiten Sie 50: 50-Aceton: Methanol-Lösung durch gleiche Mengen von Aceton und Methanol mischen (z. B. 50 mL). Shop bei-20 ° C. Bereiten Sie diese Lösung, spätestens am Tag vor der Färbung. Diese Lösung kann wieder bei-20 ° C gelagert werden und für spätere Färbungen verwendet werden.
      Hinweis: Bereiten Sie diese Lösung in Abzug wie Aceton und Methanol entzündlich und gesundheitsschädlich sind.
   2. Blockieren Lösung: bereiten Sie eine 15 % fetalen bovine Serum (FBS), 0,3 % Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat Lösung mit PBS-Puffer von ersten Hinzufügen von 15 % FBS PBS. Fügen Sie Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat hinzu und unter Rühren Sie auflösen. Shop bei 4 ° C.
      Hinweis: Diese Lösung kann in großen Mengen im Voraus vorbereitet werden in 15 mL Aliquote bei-20 ° C gelagert und vor dem Gebrauch am Tag wenn die Färbung Protokoll gestartet wird aufgetaut. Verwenden Sie ein frisch zubereitetes oder frisch aufgetauten Aliquote für jede Färbung Protokoll.
   3. Waschlösung: bereiten Sie 1 L des PBS mit 0,45 % Octyl Phenol wurde durch Zugabe von 4,5 mL Octyl Phenol Nonylphenolethoxylat auf 995,5 mL PBS ergänzt. Unter Rühren auflösen. Shop bei RT
2. Heben Sie die Tropfen vorsichtig von der Platte mit einem Edelstahl kantig Spatel. Trennen Sie das Droplet zuerst die Kanten vor dem Anheben der Mittelpunktes, und übertragen auf einen Brunnen 12-Well-Platte mit 1 mL PBS.
   Hinweis: Führen Sie Post-Fixierung, Waschungen und blockierende Schritte in dieser Plattenformat.
3. Nach dem Beheben der Tröpfchen mit 1 mL eiskaltes 50: 50 Aceton: Methanol-Lösung für ~ 1 min (die Grenze der Tropfen leuchtet weiß).
   Hinweis: Führen Sie diesen Schritt unter Abzug wie Aceton und Methanol gesundheitsschädlich sind.
4. Spülen Sie mit 3-5 Wäschen in 2 mL PBS (die Tröpfchen in der PBS-Lösung sinkt wenn Rehydratation abgeschlossen ist).
   Hinweis: Berühren Sie die Tropfen mit der Pipettenspitze wie nach Post-Fixierung, klebrigen Kunststoff sind. Im gesamten Protokoll vermeiden Sie Absaugnadeln nach dem Update, Antikörper, blockieren und Waschlösungen durch Absaugen, wie dies kann beschädigen oder die Tröpfchen zerstören. Stattdessen die Platte kippen und Lösungen mit einer 500-5.000 μl Pipette vorsichtig entfernen.
5. Zentrifugieren Sie die blockierende Lösung für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C, um Ablagerungen zu entfernen.
   Hinweis: Die Lösung kann in 1,5 mL Röhrchen für Zentrifugation regelmÄÑig sein. Nicht verwendete Lösung kann bei 4 ° C gelagert und für alle relevanten Schritte verwendet werden.
6. Inkubieren Sie die Tropfen in 500 μl blockiert Lösung für 2 h bei RT
   Hinweis: Um das Volumen der Blockierung eingesetzte Lösung zu reduzieren, die Platte kann gekippt werden auf einem Träger und weniger als 300 μl der Lösung/Droplet eingesetzt werden.
7. Bereiten Sie die Primärantikörper Mischung (mindestens 30 μL/Tropfen) bei entsprechenden Verdünnung in blocking-Lösung und Zentrifuge für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C.
8. Übertragen Sie die Tropfen in Runde (U)-96-Well-Platte mit einem Spatel Runde Kanten unten, und mit mindestens 30 μL/Tröpfchen der Primärantikörper Mischung über Nacht bei 4 ° c inkubieren
9. Am folgenden Tag, Übertragung der Tröpfchen in 12-Well Platte mit 2 mL Lösung/gut waschen wäscht mit drei 5 min spülen und dann mit neun 30 min wäscht. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
10. Am nächsten Tag spülen Sie dreimal mit PBS und übertragen die Tröpfchen in Runde (U)-96-Well-Platte unten.
11. Während der Waschgänge bereiten Sie die entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper Mischung (verdünnt 1: 500, mindestens 30 μL/Tropfen) in blocking-Lösung und Zentrifuge für 15 min bei 21.000 x g und 4 ° C.
12. Die Tröpfchen in einer Runde zu übertragen (U)-96-Well-Platte mit einem Spatel Runde Kanten unten und inkubieren Sie mit mindestens 30 μl der Sekundärantikörper Mischung, 4 h bei RT, vor Licht geschützt werden.
    Hinweis: Führen Sie alle nachfolgenden Inkubationen und Waschschritte vor Licht geschützt werden.
13. Übertragen Sie die Tropfen in 12-Well-Platte mit 2 mL Lösung/Brunnen mit einem runden Kanten Spatel, Spülen mit drei 5 min wäscht zuerst waschen und dann mit vier 30 min wäscht. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
14. Am nächsten Tag spülen Sie die Gele mit fünf 30 min wäscht und dann dreimal mit PBS. Lassen Sie die letzten Waschen (2 mL) über Nacht bei 4 ° C.
15. Am Folgetag, übertragen die Tröpfchen in einer Runde (U)-unten 96-Well-Platte mit einer Runde Kanten Spachtel und Gegenfärbung Kernen durch Inkubation mit 10 μg/mL Hoechst nuklearen Fleck (mindestens 30 μL/Tropfen) für 30 Minuten bei RT
    Hinweis: Montage Medium ergänzt mit 4', kann 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Kerne Gegenfärbung alternativ verwendet werden. In diesem Fall werden diese Schritt und Schritt 6.16 übersprungen ausgehend direkt zu Schritt 6.17.
16. Übertragen Sie die Tropfen in 12-Well-Platte mit 2 mL PBS/Brunnen mit einem Spatel Runde Kanten und waschen Sie dreimal mit PBS.
17. Montieren Sie die Tröpfchen auf Objektträger wie folgt:
    1. Eine schmale Schicht schnell aushärtende Eindeckmedium am Rande einer quadratischen 22 x 22 mm-Deckglas und ~ 1 Minute lang trocknen lassen. Führen Sie diesen Schritt für jeden Tropfen einzeln, um übermäßige Verhärtung des Mediums Montage zu vermeiden.
       Hinweis: Führen Sie diesen Schritt in Abzug, da die schnell aushärtende Eindeckmedium gesundheitsschädlich ist.
    2. Das Tröpfchen durch Eintauchen in einen Brunnen von einem 12-Well-Platte mit 2 mL entionisiertem Wasser spülen und übertragen auf einen Objektträger mit einem Spatel Runde Kanten. Entfernen Sie überschüssiges Wasser mit ein kleines Stück Küchenpapier.
    3. 15 μl nicht aushärtende antifade Eindeckmedium auf das Droplet zu verzichten.
       Hinweis: Alternativ, wenn nukleare Hoechst-Fleck nicht benutzt wurde, Montage Medium mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) einsetzbar.
    4. Sanft positionieren Sie das Deckglas mit den schnell aushärtende Eindeckmittel mit Blick auf die mikroskopische Folie über das Tröpfchen zu und lassen Sie zu begleichen.
       Hinweis: Das schnell aushärtende Medium wird zur mikroskopischen Folie kleben und bewahren Sie das Droplet.
18. Wiederholen Sie Schritt 6.17 für alle Tröpfchen. Montieren Sie zwei Tropfen auf jedes Mikroskop-Objektträger.
19. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen bei RT für ~ 2 h und über Nacht bei 4 ° C lagern. Stellen Sie sicher, dass die Folien sind horizontal positioniert und vor Licht geschützt.
20. Bild der gefärbten gebürtige oder Endpunkt FT ex Vivo Kulturen mit einem confocal Mikroskop oder eine aufrechte Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer optischen Stationspunkte Funktion und 20 X oder 40 X Objektiv ausgestattet. Verwenden Sie Kachel-Funktion, um einen größeren Bereich des Gewebes gleichzeitig aufnehmen.

Tieferes Verständnis der PDR fibrovaskulärem Gewebeeigenschaften und Protein-Expression hat vor allem auf glasartige Proben und dünne histologischen FT Abschnitte^3,15,16,17verlassen. Um eine Methode zur gründlichen Untersuchung der 3D Gewebe Organisation und mehrzelligen pathophysiologischen Prozesse der PDR, entwickeln wir uns vorgenommen, um die chirurgisch ausgeschnittenen, nutzen Patienten gewonnenen pathologischen FTs für 3D Charakterisierung und ex-Vivo-Kultur. Die frischen FTs sind das Forschungslabor übertragen und dort verarbeitet, wie in der schematischen Workflow in Abbildung 1dargestellt.

Die FTs können vor der Präparation für qualitative Bewertung und Dokumentation (Abbildung 2) abgebildet werden. Wie in Abbildung 2dargestellt, Anzeigen der FTs große Inter Patienten Unterschiede in Größe, Dichte und Fülle von vaskulären Strukturen. In einigen Geweben, lose Zellen, vermutlich entzündliche/Immune Zellen oder roten Blutkörperchen unterschieden ebenso wie durchlässige vaskuläre Strukturen der verschiedenen Kaliber auch leicht sein können (Abbildung 2). Nach Dissektion muss eine Entscheidung über die nachgeschaltete Verwendung begrenzen Anzahl der erhaltenen Explantaten erfolgen. Ein Teil der Explantate ist Fibrin-Matrix eingebettet und nach dem Fibrin Gelbildung fixiert, während die restlichen Explantaten ex Vivo Kultur auf einer separaten Platte (Abbildung 1) ausgesetzt sein können. Die frischen FTs wurden auch für Ultrastrukturforschung Charakterisierung mittels Elektronenmikroskopie erfolgreich genutzt. Die Proben können man entweder für herkömmliche Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) von ultradünnen Abschnitte oder serielle Block Gesicht scannen Elektronenmikroskopie (SBF-SEM)^3,11verarbeitet.

Die feste Fibrin-Gele können mehrere Wochen lang gespeichert und befleckt durch ganze-Mount Immunfluoreszenz^18,19. Die gefärbten Proben sind ebenfalls stabil, wenn Sie bei 4 ° C im Dunkeln aufbewahrt. Die dicken FT/Fibrin-Gele können Zeit-effizient mit Epifluoreszenz Mikroskop mit einer optischen Stationspunkte Funktion ausgestattet, nützlich zum Entfernen von Out-of-Focus Streulicht abgebildet werden. Bildgebung mit dieser Methode bietet eine feine Visualisierung der Strukturen. Alternativ, konfokale Mikroskopie, obwohl mehr Zeit fordern, können ermöglicht die Erfassung von feineren Details. Die Charakterisierung der frisch Fibrin eingebettet und festen, unkultiviert, native FTs von ganz-Mount Immunfluoreszenz ermöglicht die Charakterisierung der vaskulären Strukturen, mehrere Zelltypen und deren gegenseitige Anordnung innerhalb der 3D PDR-Gewebe ¹¹-Landschaft. Z. B. CD31 Antikörper können verwendet werden, um das Endothel anzeigen und NG2 anzuzeigenden Perizyten (Abbildung 3), während Lyve1 Antikörper neu visualisieren entdeckt lymphatische endothelial Strukturen (Abbildung 4)¹¹. Mehrere Kombinationen von Antikörpern können verwendet werden, um mehrere Strukturen und Zelltypen (siehe Tabelle der Materialien) zu visualisieren; ERG visualisieren beispielsweise auch das Endothel hat eine Discontinuos Ausdrucksmuster in die abnorme PDR-Neovasculature. Der vaskulären Strukturen gebeizt mit einem Membran-Marker (z. B.CD31 und Lyve1) können für Erhaltung und Dichte quantitativ analysiert werden, mithilfe von Angiotool, ein frei-Source-Software, entwickelt von der NIH National Cancer Institute^{11, 20}. 3D Volumen können auch aus dem Dataset gewonnen (siehe Video 1) gerendert werden. Wenn ein Antikörper nicht vollständig-hängen Immunfluoreszenz eignet, können von Immunohistochemistry die Fibrin-Tröpfchen alternativ in Paraffin eingebettet, geschnitten, Dünnschliffe und analysiert werden. Profitieren Sie in diesem Fall die Tröpfchen von Übernachtung Fixierung bei 4 ° C anstelle von 1 h bei RT

Ex-Vivo trägt Kultur das Wachstum von Fibrin eingebettet FTs, Entwicklung von zellulären Auswüchse bereits nach zwei Tagen (Abbildung 5). Die in Vitro Fibrin Gel dient als Matrix für ex Vivo Kultur seit der in-vivo vorläufige ECM verkörpert nach Thrombin Spaltung von Serum Fibrinogen an den Standorten der vaskulären Leckage in direktem Kontakt mit den undichten PDR-Neovessels in gebildet der fibrotische Milieu^15,21,22entzündet.

PDR ist eine mikrovaskuläre Komplikation zeichnet sich durch eine Angiogenese und fibrotische Reaktion und FT Explantaten behalten diese zelluläre Repertoire in der Kultur, sowie effizient reagieren auf exogene Reize der Nährmedien¹¹hinzugefügt. Die repräsentativen Daten in Abbildung 6 zeigt, dass die PDR Ex Vivo Kulturen sprießen der CD31-positiven Endothel und Gefäßsystem Erhaltung als Reaktion auf VEGFA induzierte, während TGFβ reflektierte Auswuchs auf fibrotische Reaktion induziert NG2-positiven Perizyten/SMCs. Mehrere exogene Reize können getestet werden, und wenn durch Messungen der Fülle ihrer in-vivo Glaskörperblutung informiert, kann die hier entwickelten PDR ex Vivo Kultur Modell Roman Mikroumgebung und Kontext abhängige PDR pathologische Mechanismen, die nicht offenbaren in festen Gewebematerial visualisiert.

Abbildung 1. Ex-vivo PDR fibrovaskulärem Gewebekultur Modell. Schematische Darstellung des Workflows aus der vitreoretinalen Chirurgie (Pars Plana Vitrektomie) für die Exzision der FT zu seiner Zerlegung in Explantaten und Einbettung in Fibrin für dreidimensionale Charakterisierung und ex-Vivo -Kultur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: PDR fibrovaskulärem Gewebe vor der Präparation frisch herausgeschnitten. Phase Kontast Mikrographen von frisch ausgeschnittenen FTs vor der Präparation genommen. Die FTs sind sehr variabel in Größe, Dichte und Fülle von vaskulären Strukturen. Pfeilspitzen zeigen vaskuläre Strukturen verschiedener Kaliber. Der Grat teilweise transparent zeigt zwei einzelne Schiffe unterschiedlichen Kalibers. Die Bilder wurden mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop mit 5-fach, 0,15 numerische Apertur (NA), Ziel. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz eines nativen PDR fibrovaskulärem Gewebes. Epifluoreszenz Schliffbild eines systemeigenen gebeizt PDR FT durch Immunfluoreszenz vollständig-hängen. CD31 (A, grüne) visualisiert das Endothel während NG2 (B, rot) visualisiert die Perizyten innerhalb der unregelmäßigen neovaskulären Strukturen. Verbundene Bilder sind (C) gezeigt. DAPI (blau) Gegenfärbung visualisiert Kerne. Das Bild wurde mit einem aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit optischen Stationspunkte Funktion aufgenommen und kombiniert mit einer computergesteuerten 1,3 Megapixel monochrome CCD Kamera und Bild Datenerfassungs-Software, mit einer 40 X 1,4 NA, Öl-Ziel. Neun optischen Abschnitte wurden mithilfe von Bildverarbeitungssoftware ImageJ kombiniert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz eines nativen PDR fibrovaskulärem Gewebes. Epifluoreszenz Schliffbild eines systemeigenen gebeizt PDR FT durch Immunfluoreszenz vollständig-hängen. CD31 (A, grüne) visualisiert das Endothel während des Lyve1 (B, rot) visualisiert die neuentdeckten lymphatische endothelialen Strukturen. Verbundene Bilder sind (C) gezeigt. Hoechst 33342 (blau) Gegenfärbung visualisiert Kerne. Das Bild wurde mit einem aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit optischen Stationspunkte Funktion aufgenommen und kombiniert mit einem computergesteuerten 1,3 Megapixel Monochrome CCD-Kamera und Bild-Datenerfassungs-Software, mit Hilfe einer Objektiv 20 X, 0,8 NA. Mit Bildverarbeitungssoftware ImageJ wurden vier optische Abschnitte kombiniert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5. Ex-Vivo-Wachstum der PDR fibrovaskulärem Gewebe. Phase Kontrast Mikrographen zwei FT eX vivo Kulturen zu angegebenen Zeitpunkten (Tag). Die FTs wachsen nach ex-Vivo-Kultur, Entwicklung von zellulären Auswüchse bereits nach zwei Tagen. Die Bilder wurden mit einem invertierten Epifluoreszenz-Mikroskop mit einem Objektiv 5 X, 0,15 NA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6. Vollständig-hängen Immunfluoreszenz PDR fibrovaskulärem Gewebe kultiviert ex Vivo unbehandelt (CTRL) oder in Gegenwart von VEGFA oder TGFβ. Epifluoreszenz Schliffbild von FT ex Vivo unbehandelt (CTRL) oder in Gegenwart von VEGFA oder TGFβ für 9 Tage kultiviert und anschließend gefärbt durch Immunfluoreszenz vollständig-hängen. CD31 (grün) visualisiert das Endothel, während NG2 (rot) die Perizyten visualisiert. DAPI (blau) Gegenfärbung visualisiert Kerne. VEGFA stabilisiert das Gefäßsystem während TGFβ eine fibrotische Reaktion induziert. Die Bilder wurden mit einem aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit optischen Stationspunkte Funktion und kombiniert mit einem computergesteuerten 1,3 Megapixel Monochrome CCD-Kamera und Bild-Datenerfassungs-Software, mit Hilfe einer Objektiv 20 X, 0,8 NA. Neun optischen Abschnitte wurden mithilfe von Bildverarbeitungssoftware ImageJ kombiniert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1. 3D-Volumen Rekonstruktion der native FT von ganz-Mount Immunfluoreszenz befleckt. CD31 (grün), Lyve1 (rot). Hoechst 33342 Gegenfärbung (blau) visualisiert Kerne. Das Bild wurde mit einem aufrechten Epifluoreszenz-Mikroskop mit optischen Stationspunkte Funktion aufgenommen und kombiniert mit einem computergesteuerten 1,3 Megapixel Monochrome CCD-Kamera und Bild-Datenerfassungs-Software, mit Hilfe einer Objektiv 20 X, 0,8 NA. 3D-Volumen Wiederaufbau und video-Rendering erfolgte mittels einer kommerziellen Software. Ein Teil des Videos ist abgedruckt mit freundlicher Genehmigung von Gucciardo Et al. ¹¹. bitte hier klicken, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

In Anbetracht der Bedeutung der entsprechenden Gewebe Mikroumgebung für zuverlässige funktionelle Zelle und molekulare mechanistischen Ergebnisse ist es unerlässlich, entsprechende experimentelle Modelle finden, die diese Gewebe-Umfeld zu schaffen. Die hierin beschriebenen ex Vivo PDR Kultur Modell für das Fibrin eingebettet FTs ermöglicht die Untersuchung der Mechanismen der PDR Pathophysiologie im native, komplex und mehrzelligen Rahmen der PDR klinischen Proben.

Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind die richtigen Fibrin Gelbildung, die Positionierung der FT und ausreichend Wäsche der Färbung. Da Fibrin Gelbildung der Thrombin-Aktivität, durch die Konzentration und Temperatur, beeinflusst vor allem hängt muss die Höhe der Thrombin für jede Charge von Fibrin Gel Vorbereitung angepasst werden. Fibrin Gelbildung sollte schnell genug, um 2D Wachstum von FT-Explantaten zu verhindern, aber auch langsam genug, um die Positionierung der FT in die Mitte der Tröpfchen vertikal und horizontal zu ermöglichen. Im Fall die FT passiert, am Rande des Tröpfchens zu finden, konnte die zusätzliche pipettieren die Platzierung der FT zum Zentrum helfen. FTs, die immer noch am Rande der Tröpfchen oder das wachsen in 2D, müssen ausgeschlossen werden. Während der Färbung und die Vermeidung von Waschen Trocknen der Tröpfchen ausreichen wiederum kritisch, um Fleckenbildung zu optimieren und zu minimieren Hintergrundsignal. Transferzeiten können auch wichtig sein. Wir haben die FTs bis zu zwei Stunden nach Vitrektomie eingebettet und dies hatte keinen Einfluss auf die Ex Vivo Wachstum. Die Auswirkungen der längere Übertragungszeiten auf dem Kultur-Erfolg hätte geprüft werden müssen.

Dieses Protokoll könnte geändert werden, durch die Verwendung alternativer Matrizen für die Einbettung von FT. In-vivo entgegenwachsen PDR Neovessels des Glaskörpers Kortex reich an Kollagen²³. Auf vaskuläre Leckage Serumkomponenten, einschließlich Fibrinogen, lösen sich in Glaskörper in unmittelbarer Nähe zu den Schiffen, wobei die fibrotische Reaktion initiiert wird. Daher, das in-vitro-Fibrin-Gerinnsel genutzt wurde hier für die Ex Vivo Kultur um sind typisch für die vorläufige ECM gebildet im entzündeten fibrotische Milieu der PDR^15,21,22. Alternativ könnte die Fibrin-Gerinnsel mit Laminin und Fibronektin, die Stabilität der Kapillaren sprießen zu ändern ergänzt werden oder der Explantate eingebettet werden könnte in Typ I-Kollagen und andere gemischten Matrizen, sind typisch für die meisten fibrotischen Mikroumgebungen im neovaskulären Gewebe. Diese Matrizen sind in der Regel geeignet für 3D Culture und vollständig-hängen Immunfluoreszenz, aber ihre Auswirkungen auf die PDR-FTs bleiben getestet werden und Überlegungen über das Timing der 3D Matrixbildung müssen gemacht werden, um innerhalb der Grenzen zur Verhinderung von 2D zu bleiben Wachstum^18,19. Wenn die räumliche Nähe der Forschergruppe ins Krankenhaus eine Einschränkung darstellt, könnten längere Übertragungszeiten mit Teamarbeit ausgeglichen werden; Vorbereitung der TA-Lösung, Sterilfiltration Fibrinogen und Fibrin Gel Bildung Tests können während FT Transfer durchgeführt werden. Wenn die Fibrin-Gele nicht auch nach 1 Stunde sind, möglicherweise ein Problem mit dem Fibrinogen oder TA Vorbereitung der Lösung aufgetreten. In diesem Fall können nicht die FT/Fibrin Gele verwendet werden.

Grenzen dieses Ansatzes, wie bei jeder Ex Vivo nähern, sind die unterschiedlichen Qualität der primären Gewebeprobe über Einzelpersonen sowie Intra geduldig und Inter Patienten Gewebe Heterogenität. Bestandteil dieser Variabilität umfasst bei Diabetes-Patienten das Ausmaß der Vaskularisation und Fibrose, abhängig von zahlreichen Faktoren, wie Dauer der Krankheit, Stoffwechsellage, genetische/epigenetische Faktoren Art von Diabetes und systemische Therapie. Die Größe der chirurgischen PDR FT wiederhergestellt ist auch ein limitierender Faktor bei der Bestimmung der Anzahl der Bedingungen, die für jede Probe untersucht werden können. Gleichzeitiger gegenseitiger räumliche Informationen ermöglicht vollständig-hängen Immunfluoreszenz die Untersuchung von nur eine begrenzte Anzahl von Funktionen/Marker pro Tropfen. Als Kompromiss können die Fibrin-Tröpfchen alternativ in Paraffin eingebettet, auf dünne Abschnitte geschnitten und von Immunohistochemistry analysiert.

Die bestehenden diabetischen Maus Modelle entwickeln viele Merkmale der frühen Stadium DR aber nicht umfassend die progressive Veränderungen in menschlichen PDR, so behindert die Studien der PDR Krankheit Mechanismen^7,8rekapitulieren. Darüber hinaus ist das murine Auge unterscheidet sich grundlegend von dem menschlichen Auge, dass es die Makula, weitere betonend, wie wichtig es ist, Studium der menschlichen Krankheit²⁴fehlt. Die chirurgische PDR FTs entweder zuvor verworfen worden, oder verwendet für Paraffin Abschnitte, Transmissions-Elektronenmikroskopie, serielle Block Gesicht scannen Elektronenmikroskopie, bulk-RNA Sequenzierung oder 2D Kultur der dissoziierten Zellen^3,25 . Die hierin beschriebene Modell ermöglicht die 3D Charakterisierung von diesem kostbaren chirurgisches Material, sowie die Untersuchung der PDR Pathophysiologie in der Mikroumgebung native erkranktes Gewebe. In Kombination mit dem Einsatz von glasigen Flüssigkeit erlaubt dieses Modell auch die Untersuchung des Beitrags der zellulären und azellulärer PDR Mikroumgebung. Da die Kulturen effizient zu reagieren, dass Wachstumsfaktoren in den Glaskörper, wie VEGFA, bFGF, erkannt ist VEGFC und TGFβ, somit Rekapitulation Funktionen der PDR Pathophysiologie, diese PDR ex-Vivo-Kultur-Modell für Tests oder Entwicklung neuer Behandlungsmethoden in PDR ¹¹. in diesem Modell Anti-VEGFA verhindert Kapillaren sprießen und induzierte Anzeichen von Kapillaren Regression, Antworten, die klinischen Ergebnisse der Anti-VEGFA Behandlung^26,27entsprechen. Daher kann dieses Modell auch für ein besseres Verständnis der Auswirkungen der gegenwärtigen Therapien, einschließlich Anti-VEGFA und Kortikosteroid-Behandlung verwendet werden.

Mit live Cell imaging Instrumentierung, die hierin beschriebenen ex Vivo Kulturmodells Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht Echtzeit-Untersuchung von Prozessen wie vaskuläre Regression, Keimen und zelluläre Plastizität unterliegen könnte. In Kombination mit in-vitro und in vivo Modellen sowie klinische Daten diese ex-Vivo-PDR-Modell hilft bei der Untersuchung von Patienten Antworten basierend auf bestimmte Gruppen von Marker zu identifizieren, ein Schritt näher an der Allee für personalisierte Medizin. Identifizierung von Patienten-spezifischen Antworten und/oder Antwort-spezifische Marker ist besonders relevant bei PDR, ist eine multifaktorielle Erkrankung mit einem komplexen Zusammenspiel von mikrovaskulären Neurodegenerative, Stoffwechsel-, genetische/epigenetische immunologische und Entzündung-bezogene Faktoren erfordern somit zunehmend interdisziplinäre Bemühungen für die Entwicklung von verbesserten therapeutischen Zielen und Disease Management. Neben der gesamten-Mount Immunfluoreszenz analysiert die Ex, die vivo kultiviert FTs könnte auch das Fibrin durch Plasmin/Nattokinase Behandlung entnommen und transkriptomischen und Proteomic ausgesetzt,²⁸. Die Eignung des hierin beschriebenen Modells für ex-Vivo-Studien von fibrovaskulärem Geweben entwickelt in anderen okulären Bedingungen, wie z. B. in schweren Fällen von Sichelzellen Retinopathie, könnte auch in der Zukunft geprüft werden.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Autoren sind sehr dankbar, die medizinische und chirurgische Netzhaut Kollegen, Krankenschwestern und Belegschaft von diabetischen und vitreoretinalen Chirurgie-Einheit an der Abteilung für Augenheilkunde, Helsinki University Hospital für aktive Teilnahme an der Rekrutierung der Patienten. Wir danken Biomedicum Molecular Imaging Unit für bildgebende Einrichtungen. Wir danken Anastasiya Chernenko für hervorragende technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse von Akademie von Finnland (KL), Universität Helsinki (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), finnische Krebs-Institut (KL), Karolinska Institutet (KL), finnische Eye Foundation (SL), Auge und Gewebe-Bank-Stiftung (SL), Maria und Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) und HUCH klinische Forschung Bewilligungen (TYH2018127 nach TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, EG) sowie das Doktoratsstudium in Biomedizin (EG).