Um modelo de cultura de tecidos de Ex Vivo para fibrovasculares complicações retinopatia diabética proliferativa

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a fisiopatologia da retinopatia diabética proliferativa usando tecidos derivados de paciente, cirurgicamente extirpado, fibrovasculares para cultura de tecido tridimensional nativa caracterização e ex vivo. Ex vivo modelo de cultura é também favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.

Retinopatia diabética (DR) é a complicação microvascular mais comum de diabetes e uma das principais causas de cegueira em adultos de idade de trabalhar. Não atuais modelos animais de diabetes e retinopatia induzida pelo oxigênio desenvolvem as alterações progressivas de gama completa manifestadas na retinopatia diabética proliferativa humana (PDR). Portanto, a compreensão da patogênese da doença e fisiopatologia tem dependia em grande parte o uso de cortes histológicos e amostras de vítreos em abordagens que apenas fornecem informações de estado estacionário sobre os fatores patogênicos envolvidos. Aumentando a evidência indica que dinâmica célula-célula e célula-matriz (ECM) interações no contexto do microambiente que tridimensional (3D) são essenciais para os estudos mecanicistas e funcionais para o desenvolvimento de novos estratégias de tratamento. Portanto, formulamos a hipótese que o tecido patológico fibrovasculares cirurgicamente extirpado dos olhos com PDR poderia ser utilizado para confiantemente desvendar os mecanismos celulares e moleculares desta doença devastadora e testar o potencial para romance clínico intervenções. Nesse sentido, desenvolvemos um método inovador para 3D ex vivo cultura de excisada cirurgicamente paciente-derivado fibrovasculares tecido (FT), que servirá como um modelo relevante da fisiopatologia humana de PDR. Os FTs são dissecados em explantes e incorporados em matriz de fibrina para ex vivo cultura e 3D caracterização. Imunofluorescência de toda a montagem do FTs nativas e culturas de ponto de extremidade permite investigação completa da composição do tecido e processos multicelulares, destacando a importância da caracterização de tecido-nível 3D para descobrir as características relevantes de Fisiopatologia do PDR. Este modelo permite a avaliação simultânea dos mecanismos moleculares, celulares/tecido processos e respostas de tratamento no contexto complexo da dinâmicas interações bioquímicas e físicas dentro da arquitetura do tecido PDR e o microambiente. Desde que este modelo recapitula a fisiopatologia do PDR, também será favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos.

DR é uma complicação ocular grave de diabetes, uma doença que atingiu enormes proporções no últimos três décadas¹. Vinte anos após o diagnóstico, virtualmente todos os pacientes com diabetes tipo 1 e 60% dos pacientes com sinais presentes de tipo 2 diabetes de retinopatia, tornando diabetes por si só uma das principais causas de cegueira em adultos de idade²a trabalhar. De acordo com o nível de degeneração microvascular e danos isquêmicos, DR é classificada em RD não proliferativa (não-PDR) e DR proliferativa (PDR). A estágio final da doença, PDR, é caracterizada por neovascularização de isquemia e inflamação-induzida e fibróticas respostas do vitreoretinal interface. Em condições não tratadas, estes processos levará à cegueira devido à fibrose da retina, hemorragia vítrea, descolamento de retina tracional e de^3,de glaucoma neovascular⁴. Apesar dos avanços recentes, opções atuais do tratamento alvo apenas DR etapas, incluindo edema macular diabético e PDR, quando danos na retina tem já se seguiu. Além disso, uma grande proporção de pacientes do DR não beneficia do atual arsenal de tratamento, indicando uma necessidade urgente de melhoria terapias^4,5,6.

Vários outros eun vivo modelos doença/desenvolvimento e modelos animais diabéticos têm sido desenvolvidos até à data, mas nenhum deles recapitula a gama completa de características patológicas observadas em humanos PDR^7,8. Além disso, aumentando a evidência indica que respostas de tratamento estão firmemente conectadas para a composição de ECM, bem como o arranjo espacial e interação entre o microambiente celular e acelular⁹. Nós, portanto, para desenvolver um modelo clinicamente relevante de PDR humano, utilizando o material patológico FT que comumente é extirpado de olhos submetidos a vitrectomia como parte da gestão cirúrgica de PDR¹⁰.

Este manuscrito descreve o protocolo para o 3D ex vivo cultura e caracterização do PDR cirurgicamente extirpado paciente-derivado FT patológica. O método descrito aqui tem sido usado em uma recente publicação que demonstrou sucesso desconstrução da paisagem de tecido PDR 3D nativo e recapitulação das características da fisiopatologia PDR incluindo angiogênico e fibróticas respostas do anormal estruturas vasculares¹¹. Este modelo também revelou características inovadoras que não podem ser facilmente apreciadas de secções histológicas finas, tais como espacialmente confinado a apoptose e proliferação, bem como de formação vascular ilhéu¹¹. Fluido vítreo tem sido usado com sucesso por outros em culturas de esferoide endotelial 3D para avaliar seu potencial de angiogênico e a eficácia das moléculas de angiostatic¹². Quando combinado com um esferoide 3D linfática endothelial da pilha (LEC) em vitro brotando ensaio usando vítreo PDR como estimulante, nosso modelo revelou que a contribuição de ambos os vitreal solúvel fatores pistas, bem como locais dentro o tecido neovascular como ainda mal compreendidos LEC envolvimento no PDR fisiopatologia^3,11. Na gestão de PDR, vitreoretinal cirurgia é um procedimento rotineiramente realizado ainda mais desafiador. Como técnicas e instrumentações cirúrgicas estão vendo avanço contínuo e sofisticação, remoção oportuna e conservador do espécime proliferativa fibrovasculares não só melhora o resultado da visão, mas também fornece material de tecido inestimável para o investigação de respostas de fisiopatologia e tratamento de PDR nos aspectos complexos translacionais do microambiente tecido humano.

Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de revisão institucional e Comissão de ética do Hospital da Universidade de Helsínquia. Foi obtido o consentimento esclarecido assinado de cada paciente.

1. preparação de soluções, meios e equipamentos

1. Prepare os seguintes equipamentos anteriores à colheita dos tecidos fibrovasculares (FT) para assegurar o processamento rápido.
   1. Pinças de microdissection estéril-autoclave dois.
   2. Prepare 1 x tampão fosfato salino (PBS), dissolvendo 1 pré-pesados PBS comprimido (0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,010 M PO₄^-3) em 900 mL de água deionizada e mexa para dissolver. Ajuste o volume de água até 1 L e estéril-autoclave a solução pronta. Loja em RT.
   3. Junte-se a solução acima mencionada e equipamento em uma cesta, juntamente com um bisturi estéril de uso único, numa placa de cultura de célula estéril de 6 cm e 5 placas de cultura estéril 12-poços de célula.
2. Prepare um 6 mg/mL solução de fibrinogênio em novelos equilibrado sal solução (HBSS) dissolvendo-se 30 mg de fibrinogênio humano plasminogênio empobrecido em 5 mL de HBSS, usando um tubo de 50 mL, imergido em um banho-maria a 37 ° C, durante pelo menos 1 h.
   Nota: Esta solução pode ser mantida em banho-maria (37 ° C) para 7 h (máximo 10 h) antes do uso.
3. Preparar o ex vivo de meio de cultura com a adição de 5% de soro fetal bezerro (FCS) ou 5% de soro humano, suplemento de crescimento de células endoteliais de 0,4%, 10 ng/mL recombinante humano fator de crescimento epidérmico, 1 μg/mL hidrocortisona e 50 μg/mL gentamicina para comercialmente disponível meio de crescimento de células endoteliais e manter em banho-maria a 37 ° C até o uso. Armazenar a 4 ° C por até um mês.

2. dissecção de tecidos fibrovasculares

1. Colete o tecido fibrovasculares (FT) que tem sido extirpado de seres humanos submetidos à cirurgia de vitreoretinal microincision trans-conjuntival, por 20 ou 23 calibre três portas pars plana vitrectomia como parte da gestão do vitreoretinal cirúrgica do PDR.
   Nota: O FT é extirpado usando segmentação e delaminação, cortar se necessário com micro-tesouras e removido da cavidade vítrea com um microfórceps, preensão do fim intra-ocular por cirurgião experiente do vitreoretinal. Extremo cuidado deve ser tomado para remover FT intacto, sem danos, sem causar danos às estruturas oculares, incluindo o nervo óptico ou arcada vascular temporal, onde o tecido neovascular patológico se encontra mais comumente. O tamanho do tecido excisado é variável, geralmente variando entre 3 e 50 mm².
2. Manter o FT em uma placa de cultura de células de 6 cm ou tubo de 1,5 mL contendo 1 mL de PBS estéril colocado no gelo molhado e transferir imediatamente para o laboratório para processamento de investigação.
   Nota: É essencial que a unidade de pesquisa (laboratórios) está fisicamente perto da sala de cirurgia do hospital (OR) minimizar os tempos de transferência do pequeno FT extirpado. Neste caso, a transferência leva menos de 5 minutos e os explantes são incorporadas dentro de fibrina normalmente em 1-1,5 h (máximo 2 h) após a remoção cirúrgica. O impacto de tempos de transferência mais na cultura 3D precisa ser testado.
3. Coloque o FT em um prato de cultura de células de 6 cm contendo 1 mL de PBS em temperatura ambiente (RT, 25 ° C) e adquirir imagens do tecido usando um microscópio de epifluorescência invertido com um objectivo de 5x.
   Nota: Imagens são adquiridas para documentação e avaliação qualitativa. Será possível observar o tamanho do tecido, densidade e composição geral (por exemplo, estruturas vasculares).
4. Corte o FT ~ 1 mm² peças sob um estereomicroscópio dissecação vertical, usando uma pinça estéril de bisturi e microdissection. Segure o tecido, bem submergido em PBS, utilizando uma pinça microdissection e realizar cortes claros usando um bisturi estéril. Evite rasgar FT, como isso iria alterar as estruturas nativas fibrovasculares.
5. Coloque cada pedaço individual em um poço de uma placa de cultura de células de 12 poços contendo 1 mL de PBS estéril.
   Nota: Se necessário, espalhe suavemente o FT na chapa, usando uma pinça microdissection, antes de realizar cortes.

3. carcaça gotas de Gel de fibrina na posição vertical para a caracterização da FT nativa e cultura Ex Vivo

1. Estéril-filtrar a solução de fibrinogênio pronto, preparada na etapa 1.2 com um filtro de 0,22 μm montada em uma seringa de 10 mL.
2. Prepare alíquotas da solução de fibrinogênio (25 μL por tubo de 1,5 mL) e mantenha em RT. Prepare uma alíquota para fibrina gel / cada pedaço FT obtidos após a dissecação, e um par de alíquotas extras para testar a fibrina formação de gel.
3. Prepare uma solução de HBSS contendo 4 unidades/mL de trombina e 400 μg/mL de aprotinina, chamado solução de outra vida TA e mantém na RT. Prepare tanto solução TA conforme necessário, dependendo do número de peças obtidas após a dissecação (25 μL de solução de TA é usado para cada Gel de FT/fibrin) e uma quantidade extra (por exemplo, 250 μL) para testar a formação de gel de fibrina e garantindo que a solução suficiente é disponível em toda a carcaça das gotas de gel de fibrina.
   Nota: A trombina é necessária para polimerização da fibrina, enquanto aprotinina é adicionada para prevenir a degradação da fibrina gel por proteases celulares expressados pelo FTs^13,14.
4. Testar o tempo de formação de gel de fibrina: Adicionar 25 μL de solução de TA para a solução de fibrinogênio 25 μL aliquotadas preparada no passo 3.2 e, com outra pipeta definida como 50 μL, misture o tubo pipetando e dispense em uma placa de cultura de célula de 6cm , formando uma gota na posição vertical.
   Nota: A formação de gel de fibrina deverá ter lugar em ~ 1 min. Se levar mais de 1,5 min, a concentração de trombina na solução TA preparada na etapa 3.3 pode ser aumentada pela adição de mais solução de trombina. Um décimo do volume da solução de trombina inicialmente usado podem ser adicionado, repetidamente, até a formação de gel de fibrina ocorre dentro de 1,5 min. O tempo de formação de gel de fibrina é crítico para a três dimensões da cultura, como gel de rápida formação (de 1,5 minutos) impede que a peça FT de afundar até o fundo do gel de fibrina e, assim, entrar em contato com a superfície de plástico 2D da célula placa de cultura, que pode levar à adesão celular 2D e consequência.
5. Pedaço FT um lugar no centro de um bem de uma placa de 24 usando uma pinça estéril e retire qualquer excesso PBS pipetando com uma pipeta de 0.5-10 μL para evitar a força de sucção sobre o FT. No caso o tecido mantém a pinça, usar uma pinça adicional para ajudar à colocar o pedaço de tecido sobre a placa.
   Nota: Géis FT/fibrina também podem ser convertidos em placa de 48 para reduzir o uso de reagentes. No entanto, isto é mais desafiador como o espaço é mais limitado e fibrina vai se espalhar-se em contacto com a parede bem.
6. Adicionar 25 μL de solução de TA para a solução de fibrinogênio 25 μL aliquotadas no passo 3.2, e com outra pipeta 50 μL mistura no tubo por pipetagem. Dispensa na parte FT colocado na placa de bem, e pipeta e descer 2 - 3 vezes a fim de incluir a peça FT dentro da gota vertical, fornecendo uma matriz circundante 3D para os pés.
   Nota: Certifique-se que a FT não é aspirado durante a pipetagem e que não há bolhas de ar são formadas. Certifique-se também que a mistura, dispensação e pipetagem são executadas rapidamente como o gel de fibrina se formará dentro de 1,5 min, como testado no passo 3.4. Se a carcaça géis de fibrina na placa de 48, use 20 μL de solução de fibrinogênio e 20 μL de solução de TA.
7. Repita as etapas de 3.5 e 3.6 para todas as peças da FT.
8. Permitir que o gel de fibrina solidificar por incubar as placas em uma incubadora de cultura de célula a 37 ° C numa atmosfera umidificada com 5% de CO₂.
9. Após 0,5-1 h, verifique se o gel de fibrina é completamente formado por cuidadosamente inclinar a placa. Prossiga para a etapa 3.10 quando o gel não se move quando a placa é inclinada, indicando que a formação de gel de fibrina é completa.
10. Sobrepor os géis FT/fibrina com ex vivo de meio de cultura (600 μL/poço em placa de 24) ou 300 μL/poço em placa de 48 suplementados com 100 μg/mL aprotinina. Pipete o meio suavemente por dispensa algumas.
    Nota: Aqui, aprotinina é usada para prevenir a degradação da fibrina gel por proteases celulares expressados pelo FTs^13,14. O ex vivo cultura meio Adicionalmente pode ser suplementado com fatores de crescimento recombinantes, como VEGFA, VEGFC, bFGF, TGFβ (ver Tabela de materiais)¹¹.
11. Coloque o FT ex vivo placa de cultura de volta para o 37 ° C, 5% CO₂ incubadora de cultura celular e cultura para o período de tempo desejado (por exemplo, 2 - 18 dias, cultura mais longo períodos precisa ser testado). Substitua 50% de médio porte com fresco ex vivo de meio de cultura em três dias.

4. "na Matrix" Imaging

1. Adquirir imagens de FT ex vivo de culturas no mesmo dia (dia 0) e em intervalos regulares (por exemplo, todos os dias), usando um microscópio de epifluorescência invertida, a fim de acompanhar o crescimento do 3D.
   Nota: As imagens obtidas podem ser usadas para a quantificação de consequência a FT como o comprimento total dos dois diâmetros perpendiculares através do explante¹¹.

5. nativo FT e Ex Vivo cultura ponto final

Nota: Os géis FT/fibrina podem ser cultivados ex vivo, para o período de tempo desejado (FT ex vivo culturas) ou fixo no mesmo dia (nativo FT) para o nativo de caracterização FT¹¹.

1. Corrigir o FT nativo ou o FT ex vivo culturas, substituindo o meio de cultura com 1ml/bem de paraformaldeído 4% em solução de PBS, por 1h no RT Para os nativos géis FT/fibrina, correção de 0.5-1 h após a adição do ex vivo cultura médio (se o gel de fibrina não ter sido embebido em médio, fixação irá danificá-los).
   Nota: Execute esta etapa na coifa como paraformaldeído é corrosivo, tóxico e cancerígeno.
2. Lave os géis FT/fibrina com três lavagens de 5 min em PBS (2 mL/poço).
3. Substituir a PBS com 2ml/bem de PBS contendo 0,02% de azida sódica e armazenar os géis de fibrina fixa a 4 ° C até o processamento adicional. Sele as placas com película de parafina para garantir que os geles FT/fibrina não seca, no armazenamento.
   Nota: Execute esta etapa na coifa como azida de sódio é tóxica.

6. mancha da imunofluorescência toda a montagem

Nota: Este protocolo dura 5 dias e pode ser interrompido com incubação durante a noite do local indicado. Não deixe que a fibrina géis seca em qualquer ponto. Todas as etapas são executadas no RT, salvo indicação em contrário.

1. Prepare as seguintes soluções antes de iniciar o protocolo de coloração.
   1. Pós-fixação solução: preparar a solução de acetona: metanol 50: 50 pela mistura de quantidades iguais de acetona e metanol (por exemplo, 50 mL). Loja a-20 ° C. Prepare esta solução mais recente no dia antes da coloração. Esta solução pode ser armazenada em-20 ° C e ser usada para colorações subsequentes.
      Nota: Prepare esta solução na coifa, como acetona e metanol são inflamáveis e perigosos para a saúde.
   2. Solução de bloqueio: preparar um 15% bovina soro fetal (FBS), 0,3% octil etoxilato solução de fenol em PBS pelo primeiro adicionando 15% FBS de PBS. Adicionar octil fenol etoxilado e mexa até para dissolver. Loja a 4 ° C.
      Nota: Esta solução pode ser preparada em grande quantidade com antecedência, armazenados em 15 mL aliquotes a-20 ° C e descongelado antes da utilização, no dia quando o protocolo de coloração é iniciado. Use um aliquote recentemente preparada ou recém descongelado para cada protocolo de coloração.
   3. Solução de lavagem: preparar 1 L de PBS suplementado com 0,45% octil fenol etoxilado adicionando 4,5 mL de fenol octil etoxilato de 995,5 mL de PBS. Mexa até para dissolver. Loja em RT.
2. Levante as gotas cuidadosamente da placa usando uma espátula de aço inoxidável quadrado com arestas. Desanexe o droplet primeiro as bordas antes de levantar o centro e transferir para um poço de 12 placa contendo 1 mL de PBS.
   Nota: Realizar pós-fixação, lavagens e bloqueio de etapas neste formato de placa.
3. Fixe as gotas com 1 mL de solução de metanol: acetona gelada 50: 50 por ~ 1 min (fronteira de gotas vai ficar branca).
   Nota: Execute esta etapa na coifa, como acetona e metanol são perigosas para a saúde.
4. Enxágue com 3-5 lavagens em 2 mL de PBS (as gotas vão afundar na solução de PBS quando a reidratação é completa).
   Nota: Evite tocar as gotas com a ponta da pipeta, como, após a fixação pós são pegajosos de plástico. Em todo o protocolo, evite aspirar pós-fix, anticorpo, bloqueando e soluções de lavagem por sucção, como pode danificar ou destruir completamente as gotas. Em vez disso, incline o prato e Retire cuidadosamente a soluções usando uma pipeta μL de 500-5.000.
5. Centrifugue a solução bloqueio por 15 min em 21.000 x g e 4 ° C a fim de remover os resíduos.
   Nota: A solução pode ser aliquotada em tubos de 1,5 mL por centrifugação. A solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C e usada para todas as etapas subsequentes relevantes.
6. Incubar as gotas em 500 μL obstrui a solução por 2 h no RT
   Nota: Para reduzir o volume de solução utilizada de bloqueio, a placa pode ser inclinada sobre um suporte e pode ser usado como 300 μL de solução/gota.
7. Prepare a mistura de anticorpo primário (pelo menos 30 μL/gota) na diluição adequada no bloqueio de solução e centrifugar por 15 min a 21.000 x g e 4 ° C.
8. Transferir as gotas em volta (U)-placa de 96 poços de fundo, usando uma espátula com arestas redondas e incubar pelo menos 30 μL/gota da mistura de anticorpo primário durante a noite a 4 ° C.
9. No dia seguinte, transferência das gotas em 12-poço da placa contendo 2 mL de solução/poço, de lavagem enxágue com três 5 min lava primeiro e, em seguida, com lavagens de nove 30 min. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
10. No dia seguinte, lavar três vezes com PBS e transferir as gotas em volta (U)-placa de 96 poços de fundo.
11. Durante as lavagens, prepare a mistura de apropriado fluoróforo conjugado anticorpo secundário (diluído 1: 500, pelo menos 30 μL/gota) no bloqueio de solução e centrifugar por 15 min em 21.000 x g e 4 ° C.
12. Transferir as gotas em uma rodada (U)-placa de 96 poços de fundo, usando uma espátula com arestas redondas e incubar pelo menos 30 μL da mistura de anticorpo secundário, por 4h em RT, protegido da luz.
    Nota: Execute todas incubação do subsequente e etapas de lavagem, protegidas da luz.
13. Transfira as gotas na placa de 12 contendo 2 mL de lavagem, solução/bem usando uma espátula com arestas redondas, enxaguar com três lavagens de 5 min primeiro e depois com quatro lavagens de 30 min. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
14. No dia seguinte, lave os géis com cinco lavagens de 30 min e então três vezes com PBS. Deixar a última lavagem (2 mL) durante a noite a 4 ° C.
15. No dia seguinte, transferir as gotas em uma rodada (U)-placa de 96 poços de fundo usando um núcleos de espátula e corante de contraste com arestas redondas incubando com 10 μg/mL Hoechst mancha nuclear (pelo menos 30 μL/gota) por 30 minutos em RT
    Nota: Suplementado com 4' de montagem, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para núcleos counterstaining Alternativamente pode ser usado. Nesse caso, este passo e passo 6.16 são ignorados, procedendo diretamente para a etapa 6.17.
16. Transferir as gotas para a placa de 12 contendo 2 mL de PBS/bem, usando uma espátula com arestas redondas e lavar três vezes com PBS.
17. Monte as gotas para uma lâmina de microscópio, como segue:
    1. Aplique uma camada estreita de meio de montagem rápida-endurecimento nas bordas de uma lamela em forma de quadrado 22 x 22 mm e deixe secar por ~ 1 minuto. Execute esta etapa para cada gota individualmente, para evitar endurecimento excessivo do meio de montagem.
       Nota: Execute esta etapa na coifa, como o meio de montagem rápida-endurecimento é perigoso para a saúde.
    2. Enxágue o droplet mergulhando em um poço de uma placa de 12 contendo 2 mL de água desionizada e transferir para uma lâmina de microscópio, usando uma espátula com arestas redondas. Remova o excesso de água usando um pequeno pedaço de papel absorvente.
    3. Dispense a 15 µ l de meio de montagem de antidesgaste não-endurecimento para a gota.
       Nota: Como alternativa, se não tiver sido usada mancha nuclear Hoechst, montagem meio contendo 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pode ser usado.
    4. Delicadamente, posicione o tampa de vidro, com o meio de montagem rápida-endurecimento virado a corrediça microscópica, a gota e deixa-se.
       Nota: O meio de endurecimento rápido furarão ao slide microscópica e manter a gota no lugar.
18. Repita a etapa 6.17 para todas as gotas. Monte as duas gotas em cada lâmina de microscópio.
19. Deixe os slides secar ao ar livre em RT ~ 2 h e armazenar a 4 ° C durante a noite. Certifique-se que os slides são posicionados horizontalmente e protegidos da luz.
20. Imagem manchada nativo ou ponto de extremidade FT ex vivo de culturas usando um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma função de seccionamento óptica e 20x ou objectivo de x 40. Use a função de telha para capturar uma área maior do tecido de uma só vez.

Compreensão mais profunda das propriedades de tecidos fibrovasculares PDR e expressão da proteína dependeu principalmente amostras de vítreos e fina histológica FT seções^3,15,16,17. Para desenvolver um método para investigação minuciosa da organização tecido 3D e multicelulares processos fisiopatológicos de PDR, partimos para utilizar o cirurgicamente extirpado, paciente-derivado patológicas FTs para caracterização 3D e ex vivo de cultura. Os FTs frescos são transferidos para o laboratório de pesquisa e processados conforme ilustrado no fluxo de trabalho esquemático na Figura 1.

Os FTs podem ser fotografados antes da dissecação para avaliação qualitativa e documentação (Figura 2). Como mostrado na Figura 2, os FTs exibem grande variação inter paciente em tamanho, densidade e abundância de estruturas vasculares. Em alguns tecidos, células soltas, presumivelmente inflamatória/imune células ou células vermelhas do sangue, bem como estruturas vasculares permeável de calibre diferente podem também ser facilmente distinguidas (Figura 2). Após a dissecação, uma decisão precisa ser feita sobre o uso a jusante do número limitante dos explantes obtidos. Uma porção dos explantes é incorporada dentro da matriz de fibrina e fixa depois da formação de gel de fibrina, enquanto os restantes explantes podem ser submetidos a ex vivo de cultura numa placa separada (Figura 1). Os FTs frescos tem também sido com sucesso utilizados para caracterização ultraestrutural por microscopia electrónica. As amostras podem ser que também processados para microscopia eletrônica de transmissão convencional (TEM) de seções ultra-finas ou bloco serial microscopia eletrônica de varredura de rosto (SBF-SEM)^3,11.

O gel de fibrina fixo pode ser armazenado por várias semanas e manchado por toda a montagem da imunofluorescência^18,19. As amostras coradas são igualmente estáveis quando conservado a 4 ° C, no escuro. Os géis FT/fibrina espessos podem ser fotografados tempo-eficiente com microscópio de epifluorescência, equipado com uma função de seccionamento óptica, útil para remover a luz dispersa fora de foco. Imagem com este método fornece uma boa visualização das estruturas. Alternativamente, microscopia confocal, embora mais exigentes de tempo, pode permitir a captura de detalhes mais finos. A caracterização dos recém incorporado de fibrina e fixo, FTs incultos, nativas por toda a montagem imunofluorescência permite a caracterização de estruturas vasculares, vários tipos de células e seu arranjo recíproco dentro o tecido PDR 3D paisagem de¹¹. Por exemplo, CD31 anticorpos podem ser usados para exibir o endotélio e NG2 para exibir pericitos (Figura 3), enquanto os anticorpos Lyve1 Visualizar recém descoberto linfático-como estruturas endoteliais (Figura 4)¹¹. Várias combinações de anticorpos podem ser usadas para visualizar várias estruturas e tipos de células (veja a Tabela de materiais); por exemplo, ERG pode também visualizar o endotélio, que tem um padrão de expressão discontinuos no neovasculature PDR anormal. As estruturas vasculares manchadas com um marcador de membrana (por exemplo, CD31 e Lyve1) podem ser analisadas quantitativamente para preservação e densidade usando Angiotool, um software de código livre desenvolvido pelo NIH National Cancer Institute^{11, 20}. Volumes 3D também podem ser processados a partir do conjunto de dados obtidos (ver vídeo 1). Se um anticorpo não é adequado para imunofluorescência toda a montagem, as gotas de fibrina podem alternativamente ser incorporadas em parafina, corte de seções finas e analisadas por imuno-histoquímica. Neste caso as gotas beneficiam de fixação durante a noite a 4 ° C, em vez da 1 h no RT

Ex vivo cultura sustenta o crescimento das FTs de fibrina-incorporado, desenvolvendo Humanisme celular já depois de dois dias (Figura 5). O gel de fibrina em vitro é usado como matriz para ex vivo de cultura, desde tipifica o ECM provisório em vivo, formado após clivagem de trombina de fibrinogênio soro aos sítios de escapamento vascular, em contato direto com o neovessels PDR com vazamento na inflamados fibrótico meio^15,21,22.

PDR é uma complicação microvascular, caracterizada por uma resposta fibrótica e angiogênico e os explantes FT retêm este repertório celular na cultura, bem como respondem eficientemente aos estímulos exógenos adicionados para os meios de cultura¹¹. Os dados representativos na Figura 6 mostram que as culturas de ex vivo PDR induziram brotando da preservação endotélio e vasculatura CD31 positivo em resposta a VEGFA, enquanto TGFβ induziu uma resposta fibrótica reflectida pela consequência em NG2-positivo pericitos/SMCs. Vários estímulos exógenos podem ser testados e, quando informado por medições de sua abundância de vitreal in vivo, o PDR aqui desenvolvido ex vivo modelo de cultura pode revelar romance microambiente e contexto dependente PDR patológicos mecanismos que não podem ser visualizado no material de tecido fixo.

Figura 1. Ex vivo Modelo de cultura de tecidos fibrovasculares PDR. Representação esquemática do fluxo de trabalho da cirurgia para a excisão do FT do vitreoretinal (pars plana vitrectomy) para dissecação em explantes e incorporação em fibrina para cultura tridimensional de caracterização e ex vivo . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Recentemente extirpado tecidos fibrovasculares de PDR antes da dissecação. Fase contast micrografias de recém extirpados FTs tiradas antes da dissecação. As FTs são altamente variáveis em tamanho, densidade e abundância de estruturas vasculares. Setas indicam estruturas vasculares de calibres diferentes. A linha vermelha e parcialmente transparente destaca dois navios individuais de calibres diferentes. As imagens foram tiradas usando um microscópio de epifluorescência invertido com 5x, 0.15 abertura numérica (NA), objetivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Toda a montagem imunofluorescência de um tecido nativo de fibrovasculares PDR. Micrografia de epifluorescência de um nativo PDR FT manchado por imunofluorescência toda a montagem. CD31 (Averde) visualiza o endotélio enquanto NG2 (B, vermelho) visualiza os pericitos dentro de estruturas irregulares neovascular. Imagens mescladas são mostradas em (C). Corante de contraste DAPI (azul) visualiza os núcleos. A imagem foi tirada usando um microscópio de epifluorescência vertical com função de seccionamento óptica e combinada com um controlado por computador 1.3 megapixel monocromático CCD câmera e imagem aquisição software, usando um x 40, at 1.4, objectivo de óleo. Nove seções óticas foram combinadas com o uso de software de processamento de imagem ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Toda a montagem imunofluorescência de um tecido nativo de fibrovasculares PDR. Micrografia de epifluorescência de um nativo PDR FT manchado por imunofluorescência toda a montagem. CD31 (Averde) visualiza o endotélio enquanto Lyve1 (B, vermelho) visualiza as recém-descoberto linfático-como estruturas endoteliais. Imagens mescladas são mostradas em (C). Corante de contraste (azul)-Hoechst 33342 visualiza os núcleos. A imagem foi tirada usando um microscópio de epifluorescência vertical com função de seccionamento óptica e combinada com um controlado por computador 1.3 megapixel monocromático câmera CCD e software de aquisição de imagem, usando um objectivo de 20x, 0,8 nd. Quatro seções óticas foram combinadas com o uso de software de processamento de imagem ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Ex vivo de crescimento dos tecidos fibrovasculares PDR. Micrografias de contraste de fase de culturas de x vivo dois FT eem pontos de tempo indicado (dia). Os FTs crescem em cima ex vivo, cultura, desenvolvimento celular Humanisme já depois de dois dias. As imagens foram tiradas usando um microscópio de epifluorescência invertido com um objectivo de 5x, 0,15 nd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Toda a montagem da imunofluorescência de tecidos fibrovasculares PDR, cultivadas ex vivo não tratada (CTRL), ou na presença de VEGFA ou TGFβ. Micrografia de epifluorescência da FT cultivadas ex vivo não tratada (CTRL) ou na presença de VEGFA ou TGFβ durante 9 dias e posteriormente corados por imunofluorescência toda a montagem. CD31 (verde) visualiza o endotélio enquanto NG2 (vermelho) visualiza os pericitos. Corante de contraste DAPI (azul) visualiza os núcleos. VEGFA estabilizado da vasculatura enquanto TGFβ induziu uma resposta fibrótica. As imagens foram tiradas usando um microscópio de epifluorescência vertical com função de seccionamento óptica e combinadas com um controlado por computador 1.3 megapixel monocromático câmera CCD e software de aquisição de imagem, usando um objectivo de 20x, 0,8 nd. Nove seções óticas foram combinadas com o uso de software de processamento de imagem ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Video 1. reconstrução de volume 3D de um nativo FT manchado por toda a montagem da imunofluorescência. CD31 (verde), Lyve1 (vermelho). Hoechst 33342 corante de contraste (azul) visualiza os núcleos. A imagem foi tirada usando um microscópio de epifluorescência vertical com função de seccionamento óptica e combinada com um controlado por computador 1.3 megapixel monocromático câmera CCD e software de aquisição de imagem, usando um objectivo de 20x, 0,8 nd. Reconstrução de volume 3D e processamento de vídeo foi realizada usando um software comercial. Uma parte do vídeo é reproduzida com permissão da Gucciardo et al . ¹¹. por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Considerando a importância do microambiente tecido relevantes para confiança funcional celular e moleculares resultados mecanicistas, é imperativo encontrar modelos experimentais adequados que fornecem este ambiente de tecido. O descrito neste documento ex vivo PDR cultura modelo para os FTs de fibrina-incorporado permite a investigação dos mecanismos da fisiopatologia PDR no contexto nativo, complexo e multicelular de amostras clínicas de PDR.

Passos críticos dentro do protocolo são a formação de gel de fibrina adequada, o posicionamento da FT e lavagem adequada durante a coloração. Desde que a formação de gel de fibrina depende principalmente da atividade de trombina, afetaram a concentração e a temperatura, a quantidade de trombina precisa ser ajustado para cada lote de preparação do gel de fibrina. Formação de gel de fibrina deve ser rápida o suficiente para impedir o crescimento de explantes o FT 2D mas também lento o suficiente para permitir o posicionamento do FT para o centro de gotas verticalmente e horizontalmente. No caso que do FT acontece localizar-se na borda da gota, pipetagem adicionais pode ajudar a colocação da FT para o centro. STF que ainda permanecem na borda de gotas ou que crescem em 2D precisará ser excluído. Adequada de lavagem durante coloração e evitando secagem das gotas são críticos por sua vez a fim de otimizar a coloração e minimizar o sinal de fundo. Tempos de transferência podem também ser críticos. Temos incorporado os FTs até duas horas após a vitrectomia e isso não afetou o ex vivo de crescimento. O impacto de tempos de transferência mais sobre o sucesso da cultura que precisam ser testados.

Este protocolo pode ser modificado usando matrizes alternativas para a incorporação de FT. In vivo, os PDR neovessels crescem em direção ao córtex vítreo ricos em colágeno²³. No entanto, com componentes de soro escapamento vascular, incluindo o fibrinogênio, dissolva no vítreo em estreita proximidade com os navios, segundo o qual a resposta fibrótica é iniciada. Por conseguinte, o coágulo de fibrina in vitro foi utilizado aqui para o ex vivo cultura para tipificar o ECM provisório formado no meio de fibrótico inflamado de PDR^15,21,22. Alternativamente, os coágulos de fibrina podem ser complementados com laminina e fibronectina alterar a estabilidade da brotação capilares, ou os explantes pudessem ser incorporados dentro tipo I, colágeno e outras matrizes mistos para tipificar o microambiente mais fibrótico em neovascular tecidos. Estas matrizes são geralmente adequados para a cultura 3D e imunofluorescência toda a montagem, mas seus efeitos sobre o PDR FTs continuam a ser testado e considerações sobre o calendário de formação da matriz 3D terá de ser feita a fim de permanecer dentro dos limites para a prevenção de 2D crescimento de^18,19. Quando a proximidade física da unidade de pesquisa do hospital representa uma limitação, tempos de transferência mais poderiam ser compensados com trabalho em equipe; Preparação de solução de TA, estéril de fibrinogênio-filtração e teste de formação de gel de fibrina podem ser executadas durante a transferência de FT. Se o gel de fibrina não fazem mesmo depois de 1 hora, pode ter ocorrido um problema com o fibrinogênio ou preparação de solução de TA. Neste caso, não pode ser usado o gel de fibrina/FT.

As limitações desta abordagem, tal como acontece com todos os ex vivo abordagem, são a variável qualidade da amostra de tecido primário através de indivíduos, bem como a heterogeneidade do tecido paciente intra e inter paciente. No caso de pacientes diabéticos, parte desta variabilidade inclui o grau de vascularização e fibrose que dependem de vários fatores como a duração da doença, condição metabólica, fatores genéticos/epigenética, tipo de diabetes e a terapia sistêmica. O tamanho da FT de PDR cirúrgico recuperado também é um fator limitante na determinação do número de condições que podem ser investigados para cada amostra. Proporcionando informação recíproca espacial, toda a montagem imunofluorescência permite a investigação de apenas uma quantidade limitada de recursos/marcadores por gotículas. Como um compromisso, as gotas de fibrina como alternativa podem ser incorporadas em parafina, corte de seções finas e analisadas por imuno-histoquímica.

Existentes rato diabético modelos desenvolvem muitas características da fase inicial DR, mas não conseguem repetir exaustivamente as progressivas mudanças que ocorrem no PDR humano, dificultando, assim, os estudos do PDR doença mecanismos^7,8. Além disso, o olho murino é fundamentalmente diferente do olho humano, em que falta-lhe a mácula, enfatizando ainda mais a importância de estudar as doenças humanas²⁴. O FTs PDR cirúrgicos anteriormente também foram descartados, ou usado para cortes de parafina, microscopia eletrônica de transmissão, bloco serial microscopia eletrônica de varredura de rosto, em massa, a sequenciação do ARN ou 2D cultura de células dissociadas^3,25 . O modelo aqui descrito permite a caracterização 3D deste precioso material cirúrgico, bem como a investigação da fisiopatologia PDR no microambiente do tecido doente nativo. Quando combinado com o uso de fluido vítreo, este modelo também permite a investigação da contribuição do microambiente PDR celular e acelular. Uma vez que as culturas respondem eficientemente para fatores de crescimento detectado no vítreo, tais como VEGFA, bFGF, VEGFC e TGFβ, sintetizando, assim, características da fisiopatologia PDR, este PDR ex vivo modelo de cultura é favorável para teste ou desenvolvimento de novos tratamentos de PDR ¹¹. neste modelo, anti-VEGFA impediu a germinação capilar e induzido por sinais de regressão capilar, respostas que são consistentes com os resultados clínicos esperados de anti-VEGFA tratamento^26,27. Portanto, este modelo também pode ser usado para melhor entender os efeitos das terapias atuais, incluindo tratamentos anti-VEGFA e corticosteroides.

Com instrumentação da imagem latente de viver-pilha, o descrito neste documento ex vivo modelo de cultura poderia ser submetido a microscopia de lapso de tempo, para permitir a investigação em tempo real de processos tais como regressão vascular, plasticidade celular e germinação. Quando combinado com modelos in vitro e in vivo, bem como dados clínicos, este ex vivo modelo PDR vai ajudar na investigação de respostas do paciente baseadas em conjuntos particulares de identificação de marcadores, um passo mais perto para a Avenida para medicina personalizada. Identificar respostas específicas do paciente e/ou marcadores de resposta específicos é especialmente relevante no caso de PDR, que é uma doença multifatorial, com uma complexa interação de microvascular, neurodegenerativas, metabólicas, genética/epigenética, fatores imunológicos e relacionadas com inflamação, exigindo esforços cada vez mais multidisciplinares para o desenvolvimento da gestão melhorada de direcionamento e doença terapêutico. Além de toda a montagem da imunofluorescência, a ex vivo cultivada FTs também podem ser obtidos a fibrina por tratamento de nattokinase plasmina/e submetidos a transcriptomic e proteomic analisa²⁸. A adequação do modelo descrito neste documento para ex vivo estudos dos tecidos fibrovasculares desenvolvidos em outras doenças oculares, tais como em casos graves de retinopatia falciforme, também poderia ser explorada no futuro.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores são muito agradecidos aos colegas de retina médica e cirúrgica, enfermeiras e toda a equipe da unidade de cirurgia do Vitreoretinal no departamento de Oftalmologia, Hospital da Universidade de Helsínquia para participar ativamente no recrutamento e unidade diabética dos pacientes. Agradecemos a Biomedicum Molecular Imaging unidade por instalações de geração de imagens. Agradecemos Anastasiya Chernenko excelente assistência técnica. Este estudo foi suportado por doações da Academia da Finlândia (KL), Universidade de Helsínquia (KL), Sigrid Juselius Foundation (KL), K. Albin Johansson Foundation (KL), Instituto Finlandês de câncer (KL), Karolinska Institutet (KL), finlandês Eye Foundation (SL), olhos e Fundação Banco de tecido (SL), Maria e Georg C. Ehrnrooth Foundation (SL) e bolsas de investigação clínica HUCH (TYH2018127 após TYH2016230, SL), Diabetes Research Foundation (SL, KL, AK, por exemplo), bem como o programa de doutoramento em biomedicina (EG).