Vitro değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma ajanları geri gecikme süresi yüksek işlem hacmi

HIV verimli yeniden etkinleştirme işlev değerlendirmesi ve gizli proviruses boşluk için yüksek aktarım protokolü açıklanan ve müdahaleler HIV transkripsiyon üzerinde etkisini test ve yapıştırma uygulanır. Soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara geri ve yapıştırma gecikme etkisi temsilcisi sonuçları sağlanır.

HIV istikrarlı ve gizli virüs formu, bağışıklık sistemi için görünmez kalır ve geçerli antiretroviral tedavi (sepeti) tarafından hedeflenen değil, limanlar bir rezervuar hücrelerin varlığı nedeniyle çaresiz kalır. Transkripsiyon ve yapıştırma CD4 + T hücreleri dinlenme içinde HIV-1 gecikme güçlendirmek için gösterilmiştir. Gecikme süresi gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) "şok ve öldürmek" yaklaşımı kullanılarak iptali kapsamlı bir girişim bu rezervuar temizlemek için eğitim gördü ama şu ana kadar herhangi bir başarı yeterli küçük gelişim eksikliği nedeniyle klinik çalışmalarda gösterilmemiştir verimli bir şekilde bu rezervuar huzursuz molekülleri. Burada sunulan Protokolü güvenilir ve verimli bir şekilde gecikme süresi ters ajanlar (LRAs) HIV transkripsiyon değerlendirilmesi ve yapıştırma için bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım aynı anda transkripsiyon ve yapıştırma bir LRA etkisi ölçebilen bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir kullanımı akış sitometresi tarafından temel alır. Burada açıklanan protokol yapışık hücreleri gibi süspansiyon hücrelerde için yeterlidir. Çok sayıda uyuşturucu yüksek üretilen iş sisteminde test etmek için kullanışlıdır. Teknik olarak uygulamak basit ve düşük maliyetli bir yöntemdir. Buna ek olarak, akış sitometresi kullanımı hücre canlılığı değerlendirmesini sağlar ve böylece ilaç toksisitesi vasıl ayni zaman.

Etkili uzun vadeli antiretroviral tedavi rağmen HIV bellekte CD4 + T hücreleri¹tümleşik bir provirus olarak gizli bir durumda kalır. HIV-1 5 kromatin yapısı ' uzun terminal tekrar (LTR) organizatörü ve histon metilasyonu ve DNA methyltransferases (DNMT) ve histon uyku (HDAC) tarafından deasetilasyonu gibi epigenetik değişiklikleri önde gelen önemli mekanizmalar vardır Transkripsiyon baskı ve böylece sonrası entegrasyon gecikme süresi^2,3. Gecikme süresi ters kayıt ajanlar (LRAs), büyük bir çeşitlilik virüs üretim tüp bebek ikna etmek onların etkinliği araştırıldı ve üzerinden vivo gizlice enfekte dinlenme CD4 + T hücreleri^{4,5,6,7 ,8}. LRAs arasında test, HDACi (HDAC inhibitörleri) ve bahis bromodomain inhibitörleri (BETis) kromatin decondensation ve serbest bırakmak-in olumlu transkripsiyon uzama faktörü b (P-TEFb) sırasıyla neden, sonraki lider rahatlatmak transkripsiyon baskı, 5' soldan sağa ve HIV ifade^{9,10,11,12,13}aktivasyonu. Ancak, bu LRAs tarafından elde reaktivasyonu büyüklüğü ex vivo^14,15hücre ilişkilendirilmiş unspliced HIV mRNA (RNA) bize, viral transkripsiyonu, gösterge mütevazı bir artış gözlenmiştir sınırlı oldu. Önemlisi, bu LRAs de gizlice enfekte hücreleri sıklığı bir azalma neden başarısız oldu.

HIV ifade daha verimsiz alışılageldik¹⁶ yanı sıra çarpın spliced HIV RNA (MS RNA)¹⁷nükleer dışa aktarma hataları tarafından kısıtlanabilir. Böylece, daha güçlü ve farklı yönlerini virüs üretim sonrası entegrasyon etkileyebilir LRAs tanımlayıcı yeni sınıflar ihtiyaç vardır. Buna ek olarak, verimli bir şekilde gecikme süresi tersine çevirmek için en uygun bileşikler tanımlama yardım roman deneyleri geliştirilmesi gereklidir.

Burada, hangi yüksek üretilen iş yaklaşımı HIV LTR tahrik transkripsiyon ve yapıştırma müdahalelerin etkisi işlevsel değerlendirme için kullanan bir iletişim kuralı sunulur. Kısaca, yeni bir soldan sağa dayalı çift renk muhabir sistem pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Şekil 1) akış sitometresi tarafından HIV reaktivasyonu değerlendirmek için kullanılır. Spliced mRNA (2 kb) ifade Discosoma sp. kırmızı (DsRed) Floresan protein ifade için yol açacak iken bu floresan muhabiri, gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ifade için ifade unspliced HIV mRNA (4 kb) yol açar. Kısaca, biz bir floresan Env-EGFP füzyon protein, gp140unc kullanılır. EGFP, EGFP kodlama dizisi çerçeve ile un cleaved ve kesilmiş bir zarf (Env) şeklinde yerleştirildiği. Değişiklikleri Env ayrılma gp120 ve gp41-EGFP önlenmesi bölünme site ablate ve gp160 protein doğru katlanır kolaylaştırır bir çözünür Env analog oluşturma transmembran etki alanı önce kesecek şekilde tanıtıldı ve EGFP ifadesidir. İfade bir hücre içinde nerede 4 kb env sitoplazmik nükleer ihracat aracılık çekirdeği Rev yerelleştirir mRNA devir duyarlı öğesi (RRE) ile etkileşim ile. Env kesilmesi gp120 ve gp41 ve A7 3' splice sitesi arasında yatıyor RRE ödün vermeyen. Bu sistemde HIV-1'ın porno versiyonunu donör 4 (SD4) splice ve alıcısı 7 (SA7) splice sonuçları 2 kb üretiminde bir işlevsel olmayan Rev proteinin amino asit 38 kesildi kodlama mRNA erimiş DsRed floresan protein, RevΔ38-DsRed. Kısaca, DsRed, örtüşme uzantısı¹⁸tarafından Rev 2^nd exon amino asit 38, içine eklenmiştir. Unspliced mRNA nükleer ihracat kolaylaştırmak için Rev (pCMV-Rev^NL4.3) kodlama bir memeli ifade vektör floresan muhabir yapı (Şekil 2) ile birlikte transfected. Burada açıklanan bu benzersiz muhabir yapı yüksek üretilen iş değerlendirme HIV transkripsiyon ve yapıştırma, ezelî belgili tanımlık lüzum için viral vektörü yararlıdır.

Not: Klonlama için dönüştürme ve sıralama işlemleri başka bir yerde ele^18,19. İletişim kuralları burada memeli ifade vektörel çizimler (Şekil 3) transfection başlar.

1. transfection HEK293T hücre çift renk Reporter ile inşa

1. Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 (v/v) fetal Sığır serum (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 μg/mL) % 5 CO₂ kuluçka 37 ° C'de takıma hücrelerde HEK293T yetiştirmek Çözdürme sonra 2 - 3 kez transfection içinde onları kullanmadan önce geçiş HEK293T hücre deneyleri. Bu hücreler zaman çözülme yordamdan geri verecek.
   Uyarı: Hücre kültürleri Mikoplazma kirlenme ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir. İyi laboratuar uygulaması ve hücre kültürleri rutin test Mikoplazma bulaşma riskini azaltmak ve difüzyon²⁰önlemek için gereklidir.
2. 1:2 bir gün önce Tohum hücreleri bölme ve taze DMEM orta aktarabilirsiniz. 24 h 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka için hücreleri yetiştirmek
3. Transfection, önceki gün Orta balonun aspirasyon tarafından kaldırmak ve serum izlerini kaldırmak için Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) çözüm kalsiyum (Ca^{2 +}) ve magnezyum (Mg^{2 +}) ücretsiz hücrelerle yıkayın.
4. 5 mL tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.05-10 mM PBS) kültür damar dağıtmak ve 37 ° c % 5 CO₂ kuluçka 2-5 dakika yerleştirin.
5. Hücreler ayrılır, 5 mL (v/v) FBS % 10 ile desteklenmiş DMEM daha fazla hücreleri zarar verebilir tripsin faaliyetle etkisizleştirmek için de ekleyin.
6. Yavaşça yukarı ve aşağı kümeleri kırmak için hücre süspansiyon pipetting tarafından resuspend.
7. Hücreleri 1:10 trypan mavi leke (% 0,4) oranında seyreltin.
8. Trypan istimal mikroskop (10 x amaç) ve bir haemocytometer mavi yapmayız canlı hücreleri saymak.
9. Hücre sayısı ortalamasını alarak ve 10.000 tarafından çarpmadan mililitre başına hücrelerin sayısını hesaplamak ve mavi trypan elde edilen seyreltme faktörü (1:10) tarafından leke.
10. 2 x 10⁴ DMEM orta % 10 ile desteklenmiş 100 μL hücrelerde plaka FBS 96-şey düz-alt plaka 24 h için antibiyotik olmadan.
11. Her şey için 400 seyreltik pLTR.gp140/EGFP ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV-Rev^NL4.3 ve 100 ng ng pCMV-Tat101^AD8-bayrak DNA serum ücretsiz orta 50 μL '. Hafifçe karıştırın. Tat olmadan deneyler için bir eşleşen boş Tat vektör pcDNA3.1 (-) kullanın.
    Not: Endotoksin içermeyen DNA kullanımı önerilir. Bunun için DNA'sı endotoksin-Alerjik bir MIDI veya maxiprep nükleik asit arıtma kit kullanarak hazırlayın. DNA saflık 1.7 ve 1,9 arasında olmalıdır 260/280 OD oranı ölçerek belirlemek.
12. Lipid reaktif kullanmadan önce hafifçe karıştırın, sonra serum ücretsiz orta 50 μL 0.65 μL oranında seyreltin. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
13. Seyreltilmiş DNA ile seyreltilmiş lipid reaktif birleştirin.
14. Karışımı yavaşça ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Çözüm bulutlu görünebilir.
    Not: 1,15 adıma geçin. 30 dk içinde.
15. Lipid reaktif-DNA komplekslerinde drop-wise hücreleri üzerine kuyu başına 100 μL dağıtmak.
16. Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak.
17. Bir % 5 CO₂ oksijen kuluçka 37 ° C'de 5 h plaka kuluçkaya
    1. Her reaksiyon karışımı bir tek şey (96-de) transfection için yeterlidir. Miktar ve birim uyuşturucu ve test edileceğini kombinasyonu sayısına göre bileşenlerinin ve hesaplar pipetting çeşitleri için ayarlayın. Tüm koşulları genellikle triplicates test edilmektedir.
    2. Ek wells 100 ile transfect EGFP ve DsRed-Express DNA plazmid CMV dayalı tazminat amaçlar için ng.

2. Transfected HEK293T tedavisinde ajanları geri gecikme süresi ile hücreleri

Not: Her tahlil önce hücre proliferasyonu tahlil ile ilacın yüksek ve düşük dozda maruz kaldıktan sonra hücrelerin canlılık ölçerek her LRA fizyolojik durumunu belirlemek.

1. Her LRA büyüme orta ile uygun çalışma konsantrasyonu seyreltik (örneğin, JQ1(+)) için 1 mikron.
   Uyarı: 10 mM bir konsantrasyon için uygun solvent lyophilized ilaçlarla sulandırmak. Tüm hisse senedi LRAs-80 ° C'de bir kişilik aliquot (5 μL her) tekrar tekrar donma-çözülme döngüsü önlemek için saklayın.
2. Dikkatle transfection orta bir çok kanallı ile Aspire edin ve uygun LRA (Tablo 1) içeren 100 μL orta ile değiştirin. Orta çok yavaşça yanında kültür plaka yüzeyinden kolayca ayırmak için bilinen transfected HEK293T hücreleri ayırma önlemek için kuyu duvarı ekleyin.
3. Bir % 5 CO₂ oksijen kuluçka 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya

3. Akış Sitometresi Analizi için tamir edilebilir canlılığı boya ile Transfected hücre boyama

Uyarı: Ölü hücreleri ve enkaz kaldırma, yanlış pozitif ortadan kaldırmak ve en yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için önemlidir.

1. Hücreleri iyi ücret ve yavaşça (~ 5 kere) ile bir çok kanallı, medya renginde solma kaçınırken alçalarak pipetting tarafından 100 μL fosfat tamponlu tuz (PBS) kullanarak ortamın içine bağlantısını kesin. Gerekirse, tripsin-EDTA çözüm (% 0.05-10 mM PBS) kuyu başına 35 µL kullanarak ve serum içeren orta ile nötralize daha önce 37 ° C'de 5 dk kuluçka plaka hücrelerden bağlantısını kesin.
2. Hücreleri bir 96-şey V-alt plaka aktarın.
3. 500 x g 4 ° c de 5 min için hücreleri spin sonra dikkatli bir şekilde orta/PBS hücreleri dokunmadan Aspire edin.
4. Hücrelerin protein/serum ücretsiz PBS 200 μL ile en az 1 kez yıkayın.
5. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi sonra plaka devirme ve yıkama arabellek hücreleri dokunmadan kaldırarak süpernatant atmak.
6. Tamir edilebilir canlılığı boya çalışan bir çözüm canlılığı boya 1: 1000 olarak protein/serum ücretsiz PBS sulandrarak hazırlayın. Seyreltilmiş leke şey başına 50 µL hazırlayın.
   Not: Canlılığı boya renkleri mavi, kırmızı ve mor lazerler ile kullanım için uygun bir dizi mevcuttur. Lyophilized boya (a bileşeni) 50 μL susuz DMSO (bileşen B) ile bir şişe resuspending tarafından tamir edilebilir canlılığı boya stok çözeltisi hazırlayın. Tek Kişilik Kullanım aliquot (1 μL her),-20 ° C'de mağazasında korumalı gelen ışık.
7. 50 μL seyreltilmiş canlılığı boya, her şey için ve yukarı ve aşağı ile çok kanallı pipetting tarafından hücreleri karıştırın.
8. Leke ışıktan korunan 4 ° C'de 10-15 dk için.
9. 1 - 2 kez 150 μL yıkama arabelleği (PBS % 1 sığır serum albümin ve 2 mM EDTA ile) yıkayın.
10. 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj Süpernatant atmak.
11. Hücreleri 100 μL için 10-15 dk içinde belgili tanımlık karanlık 4 ° C'de yıkama arabellekte taze olarak hazırlanan % 1 formaldehit ile düzeltmek.
    Uyarı: Formaldehit çok toksiktir. % 1 formaldehit çözümde bir duman hood eldiven ve koruyucu gözlük koruma için giyen süre teneffüs önlemek için hazırlayın.
12. 1 - 2 kez 100 μL yıkama arabelleği içeren hücreleri yıkayın.
13. 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj Süpernatant atmak.
14. Hücre Pelet yıkama arabellek 70 μL içinde resuspend.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Sabit hücre analizi için karanlıkta 4 ° C'de akış sitometresi ertesi gün saklanan olabilir.

4. EGFP ve DsRed ölçümleri akış sitometresi ve veri analizi

Not: HIV Transkripsiyon (% EGFP) ve yapıştırma (% DsRed) bir akış sitometresi analiz. Örnek çalışma bir 70 mikron hücre-süzgeç veya meme kadar tıkanma önlemek için 100 mikron naylon mesh ile önce filtre.

1. Başlamak yukarıya belgili tanımlık Sitometresi ve bilgisayar en az 10 dk lazerler ısınmak sağlamak için kullanmadan önce.
2. Örnekleri çalışan ve veri toplama başlıyor önce kılıf tank % 0,9 serum fizyolojik çözüm ile doldurun ve sodyum hipoklorit tablet atık deposuna eklenir emin olun.
3. Akışı hücre hava kabarcık açısından kontrol edin.
4. Dedektörleri ve filtreler denemenin uygun olduğundan emin olun.
   Not: EGFP için mavi lazer kullanın (488 nm) ve 530/30 bant, DsRed Express sarı lazer kullanarak en iyi şekilde tespit ederken (561 nm) ve 610/20 bant. Mavi lazer (488 nm) ve 610/20 bant DsRed ifade tespit etmek için de kullanılabilir.
5. Sitometresi performans ve duyarlılık dedektörleri arasında kalibrasyon boncuk çalıştırarak olup olmadığını denetleyin.
6. İleri ayarlamak (FSC-A) ve yan (SSC-A) dağılım gerilimleri ile günahı örnek böylece ana nüfus ekran ve açıkça discernable.
   Not: FSC (ileri dağınık ışık) olan bir ölçüm ışığın kırınım (yan-ışık dağınık) SSC süre (hücre yüzey alanı veya boyutu), hücre hacmi bağlıdır düz bir açıda ışık kırınım orantılıdır bir dik açı ölçüsü olduğunu hücre parçalı yapı ve iç karmaşıklığı.
7. El ile veya otomatik tazminat nüfusunun EGFP + DsRed dedektörü ve tersi içine en az yayılma sağlanması tek lekeli örnekleri kullanarak gerçekleştirin.
   Uyarı: Tazminat nedeniyle, her tek renkli floresan protein hem de tek başına tamir edilebilir canlılığı boya ile lekeli hücreleri ifade hücreleri bir örneğini kullanın. EGFP ve DsRed floresan proteinler tazminatlar farklı spektral özellikleri nedeniyle FITC ve PE tazminat boncuk kullanın. Tazminat kontrolleri pozitif ve negatif nüfus gidermek için parlak olmalıdır.
8. Araziler oluşturun ve kapıları floresans eksi bir (FMO) denetimleri kullanarak ayarlayın.
9. Elde ve en az 10,000 uygun hücre olayları örnek başına kayıt. Lazer kesme noktası geçen birini önlemek için orta veya düşük hızda örnekleri çalıştırmak. Nabız gibi geometri Perdeleme kullanın SSC-A birini ortadan kaldırmak için SSC-H karşı. İstikrar kontrol zaman SSC-A karşı komplo tarafından çalışmanın nasıl bile akışı çalışma sırasında görmektir.
10. Çalışma sonunda, akış sitometresi akışkanlar konsantre temizlik maddeleri ile temizlik sonra 5 dk her su.
11. Kapatma sistemi, atık atmak ve kılıf tank Alım sonra yeniden doldurun.
12. Bir akış sitometresi veri analizi yazılım kullanarak veri analiz. Hücre artıkları ve ön ve yan dağılım göre yığın (birini) hariç, o zaman canlılık boya leke kullanarak ölü hücreleri ortadan kaldırmak (negatif nüfus = canlı hücre). Spliced ürün DsRed yüzde yanı sıra EGFP ve DsRed (Şekil 4), ifade hücreleri tanımlamak /(DsRed + EGFP) (Şekil 5).
13. Ira etkisi HIV transkripsiyon ve tedavi edilmezse hücreleri ve birey veya LRAs (Şekil 5) bir arada maruz hücreleri karşılaştırarak Uçbirleştirme belirlemek.

Ifade HIV-1'in (EGFP) unspliced ve (DsRed) ürünleri tedavi bromodomain inhibitörü JQ1 ile aşağıdaki spliced temsilcisi sonuçları Şekil 5 ' te gösterilmiştir. JQ1(+) ve Tat önemli ölçüde arttı EGFP ifade hücre yüzdesi (2,18 ve 4.13 FC DMSO üzerinde sırasıyla; n = 3) unspliced transkript göstergesidir. Ayrıca, JQ1(+) önemli ölçüde spliced ürün (DMSO üzerinde 7.37 FC) Tat olarak benzer bir seviyeye oranının yanı sıra DsRed (DMSO üzerinde 46.6 FC) ifade hücre yüzdesi artar (59.6 ve 5,83 FC DMSO üzerinde sırasıyla) JQ1(+) yeteneği onaylayan HIV transkripsiyon ve'nın porno versiyonunu etkinleştirmek için. Öte yandan, stereoisomer kontrol JQ1(-) ile tedavi HIV transkripsiyon ve protokol başarısını teyit Uçbirleştirme JQ1(+) etkisi onuntemsilcilerini yasakladı

Son bir yayında bir birikimi HIV JQ1(+) tedavi²¹aşağıdaki transkript spliced RNA analizi ile göstermiştir. Aslında, bizim veri JQ1(+) ile tedavi aşağıdaki Bu modelde EGFP ve DsRed protein ifade tarafından yansıtılmış unspliced ve spliced transkript düzeyleri tutarlı değişiklikler ortaya koydu. Bu sonuçlar EGFP ve DsRed hücreleri ifade bromodomain inhibitörü JQ1(+) HIV transkripsiyon ve yapıştırma yeteneği yansıtmak göstermek.

Özetle, biz pLTR.gp140/EGFP kullanımı onaylanmış. HIV-1 transkripsiyon ve yapıştırma LRAs etkisi değerlendirilmesi için bir yüksek-den geçerek tuzak RevΔ38/DsRed muhabiri. Alt-optimal miktarda Ira veya artan toksisite scud sonuçlara neden olabilir. Hücre canlılığı koruyarak kullanılan ilaç miktarını en iyi duruma getirme sonuçlarının doğruluğunu artırabilirsiniz.

Şekil 1: soldan sağa dayalı transkripsiyon ajanlara ters ve yapıştırma gecikmesi etkilerini belirlemek için kullanılan modeli şematik. Her iki unspliced zarf (Env) protein için erimiş LTR yapı ifade yeşil flüoresan protein (EGFP) gelişmiş veya Δ38rev protein DsRed ile spliced. Bu rakam Khoury vd.²¹yeniden basıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: yapıları tasarım. (A)pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed dikişi muhabir amino asit 38 erimiş DsRed floresan protein (RevΔ38-DsRed), EGFP (gp140-EGFP) ve işlevsel olmayan Rev protein erimiş zarf ifade kesilmiş sağlar. (B) pCMV-Rev^NL4.3 Ifade Rev protein sağlar. (C) pCMV-Tat101^AD8-bayrak Tat101(AD8) protein bir C-terminal bayrak etiketi ile ifade sağlar. İfade plazmid PCR örtüştüğü ve kısıtlama Özet kullanılarak inşa edilir. Tüm vektör haritaları SnapGene yazılım, sürüm 4.1.9 kullanarak oluşturulmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: tahlil tasarım HIV gecikme ajanları geri hızlı değerlendirme için. HIV-1 transkripsiyon ve yapıştırma LRAs etkisi değerlendirilmesi için geçerli yöntem i) HEK293T hücrelerinin II) transfection önce bir gün III) LRA tedavi tarafından takip ifadeler vektörel çizimler ile tohum içerir. IV) hücreleri tarafından tedavi akış sitometresi 48 saat sonrası analiz edilir. Bu iletişim kuralını kullanan, 32-96 koşulları (içinde nüsha) plaka test olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: plaka koymak-yukarıya ve gerekli denetimlerin temsilcisi örnek. Hiçbir ilaç ve çözücü tek (DMSO 1: 5000) denetimleriyle negatif (-) için karşılık Tat gibi pozitif (+) denetimler yanı sıra sütun 1-3 (100 ng), PMA/PHA phorbol myristate asetat/phytohaemagglutinin = (10 nM PMA, 10 μg/mL PHA), JQ1 (+/-) (1 mikron), VOR = vorinostat () 0.5 mikron) ve PAN panobinostat = (30 nM). Bilinmeyen LRAs konsantrasyonu (15.625) 1000 nM için bir dizi üzerinden nüsha test edilmektedir. Tazminat amacıyla, her tek renkli floresan protein (EGFP + ve DsRed +) yanı sıra hücreleri ifade hücreleri ile canlılık boya lekeli ve günahı hücreleri her vadede dahil edilir. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: akış sitometresi analizinde kullanılan strateji geçişi. Perdeleme strateji ilk adımda bu hücre boyutu ve parçalı yapı özelliklerine göre faiz hücrelerinin ayrım sağlar ön ve yan dağılım temel alır. Bu geçişi tüm olaylar, hücresel artıkları ve yoğunluk Arsa sol alt köşesinde bulunan ölü hücreleri kaldırılırken yer için mümkün olduğu kadar cömert olması önerilir. Sonra nabız geometri perdeleme, SSC-A karşı SSC-H ve daha dar canlılığı boya kullanarak canlı hücreleri kullanarak veri kümesinden birini kaldırın. Son olarak, bir döküm kanal (menekşe) ve EGFP ya da DsRed faiz hücrelere tanımlamak için kullanılır. Floresans eksi bir (FMO) denetimleri kullanımı faiz nüfusu tanımlama ve kanal ilgi başka bir fluorochrome üzerinden yayılma konuları ele kritik. Satın alma sonra veri akış sitometresi veri analizi yazılım kullanılarak analiz edilir. Bu rakam adapte formunda Khoury vd.²¹yeniden basıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: bromodomain inhibitörleri etkisi HIV transkripsiyon ve yapıştırma temsilcisi sonuçları. (A)örnek olarak iki parametre çift renkli floresan yoğunluğu arsalar untransfected hücrelerden DsRed karşı EGFP (-Tat), hücre transfected ile 100 ng pCMV-Tat101^AD8-bayrak (+ Tat) ve hücreleri tedavi DMSO, JQ1 ile (+) veya JQ1 (-). (B) ortalama yüzde (%) EGFP, DsRed veya spliced ürün ifade hücre (DsRed / DsRed + EGFP) 3 bağımsız deneylerden gösterilir. Her koşul için DMSO karşılaştırmalar 2 yönlü ANOVA testi kullanılarak yapılmıştır. Yalnızca istatistiksel olarak anlamlı karşılaştırmalar gösterilir. p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001. Siyah çizgiler mean±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 temsil (+) ve JQ1(-) (1 mikron). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Virüs reaktivasyonu ex vivo ölçme zorluk göz önüne alındığında, çok çeşitli modelleri HIV gecikme gizlice dahil olmak üzere çalışma için zaman içinde geliştirilen vitro olarak T hücre-hatları (J Latı, ACH2, U1), temel model istirahat (latent enfeksiyon bulaşmış O'Doherty, Lewin, Greene ve Spina modelleri) ya da pre-harekete geçirmek CD4 + T hücreleri (sanane, Marini, Planelles, Siliciano, Karn modelleri) tek yuvarlak veya çoğaltma yetkili gazeteci virüsler ile²². Fizyolojik şartlarda CD4 + T hücreleri dinlenme içinde HIV gecikme süresi, model, Çift floresan muhabir sistemleri bir soldan sağa dayalı Gag-eGFP marker ve CMV tahrik mCherry yerde ile Ivan Sadowski'nın grubu tarafından geliştirilen RGH (kırmızı-yeşil-HIV) muhabir gibi ortaya çıkan NEF²³/. Benzer bir çift renk muhabir virüs, Duo-Fluo, bir EF1α organizatörü²⁴tarafından yönlendirilen bir mCherry floresan marker ve soldan sağa dayalı EGFP ifade ile E. Verdin laboratuvar tarafından geliştirilmiştir. Bu sistemde, EGFP sonunda 3' provirus Nef yerine eklenir. Silme işlemini her iki bu sistemlerde zarf içinde birden fazla mermi enfeksiyonları önler. Ayrıca, iki floresan proteinlerin kombinasyonu tespiti verimli sağlar (eGFP + mCherry +) ve gizlice (eGFP - mCherry +) enfekte hücreleri. Ancak, gizlice enfekte hücreleri doğrudan enfeksiyon T-hücreleri^23,24hücresel etkinleştirme durumunu büyük ölçüde bağımlı olduğu gibi çift renk muhabir virüslerin birçok eksiklikleri CD4 + T hücreleri fark edildi. Aslında, enfeksiyon oranı çok düşük CD4 + T hücreleri dinlenme içinde bu iki gazeteci virüsler kullanarak gözlenmiştir: RGH^%23 0,1 ve %0,2 DuoFluo²⁵. Ayrıca, Sigara aktive hücreleri^26,27,28, etkin olmayan bir CMV daha alt düzeylerde ifade edilecek organizatörü CMV gösterilmiştir veya EF1α organizatörü için gizlice salgın küçümseme yol açacak nüfus.

Biz oluşturulan ve gecikme ve yüksek işlem hacmi tahlil virüs reaktivasyonu kurulmasını çalışmaya yeni bir HIV muhabir vektör ile karakterizedir. Bizim tarama yöntemi için birkaç avantajı yeteneği transkripsiyon ve aynı anda, II) tek bir deneyde, III) hızlı değerlendirilmesi çok sayıda uyuşturucu ya da kombinasyon test etmek yeteneği Uçbirleştirme değerlendirmek için i) maliyet etkinliği içerir LRAs etkisini akış sitometresi (30-45 dk tipik okuma zaman iyi plaka, floresan parametreleri sayısından bağımsız 96), tarafından IV) yüksek dinamik Aralık, v) yüksek üretilen iş transfection ve robot kolları ve HTS platformu kullanarak akış sitometresi otomatik için uygun VI) hızlı VII bir akış sitometresi çalışma alanı şablonunu kullanarak veri türlerini kür) için ideal süspansiyon ve yapışık hücreleri, VIII) modeli ve ışıma ve plaka okuyucu ölçümleri (çift luciferase Firefly ve Renilla) ve IX adaptasyon basitlik) ölçeklenebilirlik (96 - ve 384-da pate oluşum).

HIV LTR tahrik transkripsiyon ve böylece EGFP ve DsRed floresan proteinler ifade'nın porno versiyonunu etkinleştirmek için eğilimi bir IRA veya LRAs bir arada HIV alışılageldik muhabirimiz kullanarak akış sitometresi tarafından muayene. Ancak, roman LRAs sinerji test etmeden önce fizyolojik şartlarda her Ira, bir dizi tek ilaç konsantrasyonları maruz kaldıktan sonra hücrelerin canlılık ölçerek belirlemek için önerilir. Bu nedenle, canlı ve ölü hücrelerin bir işareti de dahil olmak üzere yanlış pozitif ortadan kaldırmak için ve en yüksek kalitede sonuçlar elde etmek için önemlidir. Başka bir önemli Akış Sitometresi Analizi tazminat denetimleri veya FMO olanıdır. Tek başına lekeli örnekleri nüfusunun EGFP + DsRed ve tersi içine en az yayılma sağlanması kullanmak için önerilir. Ayrıca, bu günahı hücreleri de dahil olmak üzere hesap için hücreleri autofluorescence için esastır. Son olarak, sitometresi performans ve duyarlılık dedektörleri arasında düzenli bir kontrol çoğunlukla ne zaman ölçme örnekleri uzun bir zaman aralığını kapsayan bir çalışma için önemlidir.

Protokol bölümünde tartışılmamış rağmen alışılageldik muhabir sistemimizin çeşitli sınırlamalar vardır. Daha ayrıntılı açıklamalar için lütfen bizim önceki yayın (Khoury vd., 2018) bakın. İhracat kısmen veya HIV mRNA unspliced türevleri viral protein Rev ve dernek ile Rev duyarlı öğesi (RRE) bu mRNA türler^29,30,31,32içinde tarafından kolaylaştırdı. Rev overexpression bize çarpma nükleer tutma büyük blok aşmak izin sistemimizde spliced ve gizlice enfekte T hücreleri¹⁷ ve nasıl LRAs transkripsiyonu ve yapıştırma teşvik anlama odaklanmak unspliced mRNA'ların gözlenen Böylece virüs yeniden etkinleştirme. Verilen bu sistemimiz 3 plazmid transfection gerektirir, buna ek olarak, biz seçtik HEK293T hücreleri çünkü bu hücreler yüksek transfection verimliliğini. Bir kanser hücre hattına göre T hücreleri hücresel faktörler farklı zamansal ve mekansal kullanılabilirliği nedeniyle, T-hücre satırları ve büyük sağlayabilir primer hücre HEK293T hücrelerde elde alışılageldik muhabir sonuçlarını doğrulamak önemlidir Teknik sorunlar nedeniyle sınırlı onların transfectability. Bu nedenle, alternatif DNA teslim reaktifler kullanım için özellikle süspansiyon hücreleri (örneğin, Jurkat) transfection için etkili olduğu gösterilmiştir DMRIE-C gibi transfection veya Amaxa nucleofector veya Neon gibi nucleofection yöntemleri verimli ve güvenilir teslim edilmesi, tek veya birden çok plazmid zor transfect hücreleri birincil CD4 + T hücreleri de dahil olmak üzere kolaylaştırmak için kanıtlanmış oldu transfection sistemi. Alternatif olarak, tam uzunlukta virüs gecikme söz konusu transfection yöntemleri kullanarak, bir birincil hücre modeli bağlamında bu muhabir sistemi test etmek ilginç olabilir. Aslında, ana bilgisayar transkripsiyon, uzama ve rCD4 + T hücre faktörler Uçbirleştirme farklılıkları gizli provirus yeniden etkinleştirmek için bir LRA kapasitesini etkileyebilir. Son olarak, modelimiz Ira transkripsiyon ve seyirci hücrelerinin Uçbirleştirme etkileyebilir ve çoğaltma yetkili virüs tetikleyebilir gidermez. Ancak, hücre ilişkili HIV u.s. ve MS RNA artış ölçerek, bu çoğaltma kültür süpernatant yetkili virüs üretimine yol açacak bu şüpheli olur. Bu altın standart nicel virüs yapılan tahlil (QVOA)³³yaparak teyit.

Karmaşık yapısı gecikme süresi ve verimli virüs yeniden etkinleştirme yapılmasını sağlamak için nedeniyle, çok yönlü bir birleşimsel strateji gerekli³⁴olabilir. Potansiyel tedaviye ihtiyacı ve yapıştırma, transkripsiyon dahil olmak üzere birden çok yolları uyarmak hangi daha önce gecikme süresi^16,35,36, işyerinde önemli rol oynarlar gösterilmiştir ³⁷. alışılageldik muhabir bizim LTR tahrik için daha düşük bir yol açacak bu verimli bir şekilde synergize bulma molekülleri şansımızın artması yüksek aktarım tarama adımları, transkripsiyon ve yapıştırma, en iyi şekilde hedefleyebilirsiniz ilaçların sağlayacak doz düzeyleri ve böylece her ilaç toksisitesi.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser proje desteği APP1129320 ve programı hibe APP1052979 Avustralya NHMRC tarafından desteklenmiştir. Biz Dr Adam Wheatley, Doktor Marina Alexander, Dr Jenny L. Anderson ve Michelle Y. Lee temel yapıları ve tavsiye Bu eser başarıyla tamamlanması için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Biz de DMI akış olanağı personel onların tavsiye ve bu çalışmada kullanılan akış sitometresi korumak cömert yardım için teşekkür ederiz.