CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri kullanarak genetik bağımlılıkları incelenmesi

Bu el yazması için basit ve ivedi soruşturma akut miyeloid lösemi (AML) hücre çoğalması içinde birden çok aday genlerin rolünün bir kümelenmiş düzenli olarak Interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemi açıklar paralel. Bu teknik ölçeklenebilir ve de diğer kanser hücre hatlarında uygulanabilir.

Gene pertürbasyon çalışmalar yoğun bireysel gen AML patogenezinde rol araştırmak için kullanılmaktadır. Tam gene bozulma ulaşmak için birçok bu çalışmalar yapmış karmaşık gen nakavt modelleri kullanın. Bu çalışmalar nakavt fareler ile genotip fenotip ilişkileri araştıran bir zarif ve zaman test sistemi sunarken, aday genler değerlendirmek için hızlı ve ölçeklenebilir bir yöntem bu AML hücre çoğalması bir rol veya AML modelleri hayatta kalma oynamak paralel sorgu birden fazla aday gen hızlandırmak yardımcı olacaktır. Genom düzenleme teknolojileri son gelişmeler önemli ölçüde bizim yeteneği benzeri görülmemiş ölçekte bir genetik tedirginlikler gerçekleştirmek için gelişmiş var. Genom düzenleme bir tür hedef hücre genom hızlı ve etkili değişiklik yapma için kullanılan yöntemi CRISPR Cas9 göre sistemidir. Kolaylık ve CRISPR/Cas9-aracılı gen-silme ölçeklenebilirliğini yapar çok sayıda gen sorgulama için en cazip tekniklerden birini fenotipik deneyleri. Burada, nükleer silahların yayılmasına karşı önemli bir rol oynayabilir genlerin rolünün veya insan yaşama araştırmak için CRISPR/Cas9 aracılı gen-kesinti yüksek üretilen iş akış sitometresi-tabanlı rekabet deneyleri ile kombine kullanarak basit bir tahlil mevcut ve fare AML hücre hatları.

Son birkaç on yıl çok sayıda araştırma çabalarının anahtar moleküler yolları akut miyeloid lösemi (AML) patogenezinde katkısı belirlenmesi üzerinde duruldu gördüm. Geleneksel olarak, gen-bozulma AML hücrelerdeki koşullu nakavt fareler veya kısa saç tokası RNA (shRNA) kullanılarak yapılmıştır. Nakavt fareler gen-silme spatio-temporal kontrolü için gelişmiş bir sistem sunarken, gen nakavt fareler üreten emek, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, gen-knockouts rekombinasyon stratejileri kullanarak kolayca ölçeklenebilir; değildir Bu stratejileri kendilerini de paralel olarak çeşitli genler sorgulama için borç yoktur. RNA müdahale yöntemleri için küçük müdahale RNA (siRNA) veya shRNA kullanarak knock-down endojen mRNA'ların keşfi sonra birçok grup AML belirli genlerin rolünü araştırmak için RNA müdahale teknikleri kullanmaya başladı. Fare ve insan AML hücreleri geleneksel transfection lipid tabanlı yöntemleri kullanarak transfect Rootkitler zor olduğundan, çoğu gen işlevi AML hücrelerinde çalışmak için lentivirally istihdam veya retrovirally kodlanmış shRNA çalışmalar. Son keşfi düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) kümelenmiş ve ilişkili Cas enzimler (CRISPR-Cas9) teknolojileri^1,2,3gen hedefleme devrim. CRISPR-Cas9 kullanarak, belirli genler ve genomik bölgeler silinmiş, düzenlenemez veya verimliliği ve kolaylığı ile etiketlenmiş. CRISPR-Cas9-esaslı gen-düzenleme şimdi genotip fenotip ilişkileri farklı hücre tipleri basitlik, etkinlik ve bu tekniğin geniş uygulanabilirliği nedeniyle soruşturma için seçtiğiniz yöntemi olarak ortaya çıkıyor. CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri da yönteminin seçimi AML, sadece bireysel genler sorguluyor, ama birden çok gen dizilmiş veya havuza alınan genetik ekranlarda hedef için bir yol amaçlı olarak da paralel potansiyel olarak birkaç genleri araştıran hale geliyor AML-bağımlılıkları^4,5,6.

Bu makale, gen-bozulma istikrarlı CRISPR-Cas9-aracılı gen-yüksek üretilen iş akış sitometresi tarafından takip düzenleme temel alan AML hücrelerinin büyümesini üzerinde etkisini ölçmek için bir basit rekabetçi büyüme tahlil açıklar. Bu yöntem basit, verimli ve ölçeklenebilir paralel AML hücrelerinde birkaç genlerin rolünün araştırılması için orta-den geçerek deneyler için kullanılabilir.

1. üreten AML hücre satırı klonlar istikrarlı ve etkin Cas9 yüksek ifadesi ile

1. Cas9 lentivirus imalatı
   1. 0. gün: 10 mL (BSL2) DMEM % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve penisilin ve L-glutamin bir 10 cm doku kültürü tabak içinde bir Biyogüvenlik seviye 2 ile plaka 4 x 10⁶ 293T hücrelerde hücre kültür hood sertifikalı. Çanak 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
   2. 1. gün: Kaplama 293T hücreleri % 70 – 80 birleşmesi 1 gün olmalıdır. Öğleden sonra aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak transfection gerçekleştirin.
   3. Transfection orta, Kültür Medya ve transfection reaktif için oda sıcaklığında ısıtın. Transfection için tüm gerekli plazmid çözülme.
   4. PsPAX2, pMD2.G, 0.9 µg ve pLenti-Cas9 plazmid 9 µg transfection orta 5 mL tüp içinde 500 µL ile mix 9 µg.
   5. 14 ml Yuvarlak alt tüp transfection orta 1.7 mL ekleyin. Transfection reaktif 57 µL doğrudan tüp duvarına dokunmaktan kaçının için tüp transfection ortamda içine ekleyin.
   6. Yavaşça tüm plazmid mix transfection reaktif ekleyin ve hafifçe yan tüp dokunarak karıştırın. 20-30 dakika oda sıcaklığında karışımı kuluçkaya. Bu arada, orta numaralı seribaşı 293T plaka değiştirin.
   7. Transfection karıştırmak dropwise plaka ekleyin ve hafifçe etkili karıştırma için yan plaka rock. Plaka 37 ° C kuluçka makinesine koyun.
   8. 2. gün: hücreleri değil rahatsız veya plaka yerinden süpernatant transfection plaka yavaşça Aspire edin. Süpernatant atmak. 10 mL taze % 10 DMEM orta aşağı yavaşça hücreleri kekii önlemek için plaka taraftan kaydırarak ekleyin.
   9. 3. gün: transfection plaka süpernatant yavaş yavaş içeren 10 cm steril enjektör çizerek virüs toplamak. Süpernatant şırınga toplandıktan sonra steril 0,45 µM filtre şırıngaya takın ve şırınga ve filtre bir taze, steril 15 mL polipropilen konik tüp üzerinde tutun. Yavaşça süpernatant 0,45 µM filtreden 15 mL polipropilen konik tüp içine içeren virüs filtre uygulamak için şırınga Dalma.
   10. Viral şartına orta aliquots 2 ml her birinin 2 mL cryovials-80 ° C'de depolayın
2. AML hücresi satırlarının iletim
   1. Gün -1: 1 mg/mL rekombinant insan fibronektin parçası stok 10 µg/ml steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile sulandırmak. Kat sigara doku kültürü onaylı BSL2 hücre kültür mahallede 6 iyi plaka 2 mL 10 µg/mL rekombinant insan fibronektin parça çalışma çözeltisi ile tedavi. Plaka gecede buharlaşma ve mağaza oda sıcaklığında kaybını önlemek için sarılmak şal şal.
   2. 0. gün: Cas9 içeren viral süpernatant çözülme. Rekombinant insan fibronektin parçası çözüm tamamen kaplı kalenin hemen önce spinfection Aspire edin. Cas9 ile viral şartına Orta 2 mL plaka ekleyin ve 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin Bu viral parçacıkların spinfected iyi eklemek yardımcı olur.
   3. Bu arada, transduced için hücreleri saymak ve 2 x 10⁶ hücre 15 mL polipropilen konik tüp içinde aşağı spin. Süpernatant Aspire edin ve Pelet 2 mL taze kültür ortamının resuspend.
   4. Spinfection sonra tüm viral süpernatant spinfected de kaldırmak ve atın. Retroviral parçacıkları süpernatant de spinfected altına eklenir. Bu, yukarıdaki adımı ortamından 2 ml resuspended 2 x 10⁶ hücre ekle.
   5. Plaka 1.300 x g çok kısa bir süre (1-2 dk) hücreleri altındaki yerleşmek izin vermek yeterli, tekrar çevir. Plaka da kuluçka yerleştirin ve gece kuyuya bağlı spinfected viral parçacıkların ile iletim için bırakın.
   6. 1. gün: hücre yoğunluğu bağlı olarak aşırı büyüme önlemek için transduced hücrelere daha fazla orta ekleme.
   7. 2. gün: pLenti-Cas9 plazmid Blasticidin direnç işaretçisi olduğundan, 10 µg/mL doz (kontrol) MOLM13 transduced ve untransduced adlı Blasticidin veya fare MLL AF9 lösemi hücreleri hücre ifade Cas9 seçimi için ekleyin.
      Not: Ne zaman tüm untransduced kontrol hücreleri ortadan Cas9 transduced MOLM13 veya MLL AF9 lösemi hücreleri Blasticidin yelpazesi tam olarak kabul edilir. Böylece optimal bir doz istihdam MOLM13 ve MLL AF9 lösemi dışında hücre hatlarında bir doz yanıt eğrisi bu deneme önce gerçekleştirilmelidir. Titrasyon, viral süpernatant da düşük iletim hızları durumunda gerçekleştirilebilir.
3. Yüksek-Cas9 ifade hücrelerin seçimini klon.
   Not: Biz bazı AML hücre hatlarında klon seçimi gerekli olmayabilir fark etmişsinizdir: toplu Cas9-Blasticidin seçili nüfus zaten yüksek verim genom düzenleme vardır. Bu durumda, adım 1.3 atlamak ve western Blot tarafından Cas9 ifade toplu Cas9-blasticidin AML hücrelerinde değerlendirmek için adım 1.4 için devam etmek mümkündür. Hala gen düzenleme verimliliği rekabet deneyleri için devam etmeden önce bu toplu Cas9-AML hücrelerdeki (adım 1.5) değerlendirmek önemli olacaktır. Tek yüksek-Cas9 klonlar yelpazesi farklı tek Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) bir dizi test ederken özellikle önemlidir genom düzenleme değişkenliği azaltır tahmin.
   1. Tek hücreli bir nevi Cas9 Blasticidin adı bundan böyle MOLM13-Cas9 ve MLL-AF9-Cas9 hücreleri, sırasıyla, MOLM13 ve MLL AF9 lösemi hücreleri onaylı BSL2 mahallede bulunan bir FACS sıralayıcısı kullanarak seçili gerçekleştirin. Sıralama 5 – 10 yuvarlak alt doku kültürü tedavi 96 iyi kalıplara gerçekleştirilebilir.
   2. Bir kez MOLM13-Cas9 tek ve MLL-AF9-Cas9 klon seçilmiş ve tek tek adında, 10-20 klonlar 10 µg/mL Blasticidin kültür Cas9 ifade bakım sağlamak için medya ile genişletin.
4. İfade istikrarlı Cas9 protein immunoblotting tarafından kontrol edin.
   1. MOLM13 ve MLL AF9 lösemi nükleer ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanan tüm seçili Blasticidin klonların nükleer özleri olun. Cas9 protein ifade Anti-bayrak m2 antikor pLenti-Cas9 plazmid Cas9 beri bir N-terminal bayrak epitope bağlı kullanarak kontrol edin.
   2. Toplam protein 50 µg her nükleer özü Bis-Tris jel ve üst grup de ayrılır kadar 120 V jel çalıştırmak % 10 üzerine yükleyin.
   3. Membran TBST arabellek için 1s içinde %5 süt çözelti ile engelleyin.
   4. Membran ile Anti-bayrak M2 antikor gecede 4 ° C'de 1 µg/mL nihai bir konsantrasyon, 1:1,000 seyreltme kuluçkaya.
   5. Ertesi gün, membran TBST arabellek ile yıkama ve 1:5,000 (son konsantrasyon 0,16 µg/mL) 1 h için oda sıcaklığında bir seyreltme, HRP konjuge anti-fare ikincil antikor ile kuluçkaya.
   6. Membran TBST ile iyice yıkayın ve ECL substrat kullanarak leke geliştirmek.
   7. 3-4 klon Cas9 yüksek protein ifadesi ile daha fazla fonksiyonel analiz (Şekil 1) Western blot tarafından görüldüğü gibi seç.
5. Seçili klonlar yüksek Cas9 etkinliğinde sağlanması
   1. Lentiviral süpernatant bir sgRNA kodlama vektöründen insan hedefleme sgRNAs ile hazırlamak veya adım 1. 1'açıklandığı gibi AAVS1 safe Harbor anlaşmasının locus fare.
   2. Üst Cas9 ifade MOLM13 transduce veya yukarıda açıklanan spinfection yöntemini kullanarak anti-AAVS1 sgRNA lentiviral süpernatant ile MLL AF9 lösemi klonlar. 2,5 µg/mL ile puromisindir 4 gün için seçin.
   3. Genomik DNA ekstraksiyon kiti üretici yönergelerine göre kullanarak kendi vahşi tipi denetim ile birlikte puromisindir seçimden sonra genomik DNA ' MOLM13-Cas9 veya MLL-AF9-Cas9 lösemi klonlar arındırmak. 2 x Taq polimeraz ve Tablo 1' de listelenen PCR programı ana karışımı kullanarak bir PCR ile AAVS1_test_primers gerçekleştirmek için bir şablon olarak DNA'ın kullanım 50 ng.
   4. PCR ürünü üzerinde % 2 özel jel çalıştırmak ve jel-268 baz çifti grubun bir jel ekstraksiyon kiti başı olarak üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak. Sanger sıra jel AAVS1_target-frag_F astar kullanarak PCR ürünü saf.
   5. Düzenleme verimliliği tarafından düzenlenmiş AAVS1 karşılaştırılması ve wildtype dizileri online web tabanlı araçlar (Şekil 2) kullanarak değerlendirmek.

2. klonlama ve AML-Cas9 hücrelerdeki sgRNAs iletim

1. Orta-den geçerek sgRNAs klonlama
   1. 4-6 sgRNAs gene bir örümcek ağı-esaslı CRISPR tasarım yazılımı kullanarak ilgi için tasarım. Orada bir dizi CRISPR tasarım aracı kullanılabilir online sgRNA dizileri oluşturmak http://crispr.mit.edu/ bir giriş DNA sıralamasına dayanan gibi vardır.
      1. Yıldız işareti ile alanlara uygun bilgileri doldurun. Hedef genom sgRNA tasarım için tıklayın. Hedef sıra sıra kutusuna yapıştırın ve tıkırtı üstünde boyun eğmek düğme.
   2. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - klonlama için W sgRNA ifade plazmid, nükleotit "CACC" anlamda oligo ve ters çıkarılan antianlamlı oligo için "AAAC" siparişi vermeden önce önüne ekleyin. Premix sipariş anlam ve anti-anlamda oligos bir 96-şey plaka Oligo-Mix bir oligonükleotid sentez şirketten etiketli.
      Not: Biz yaptık pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - kullanımı sgRNA klonlama için BbsI kısıtlama sitenin W plazmid. -Dibi takdirde diğer sgRNA ifade plazmid kullanılır, sgRNA oligonucleotides için kullanılan çıkıntılar buna göre değiştirilmesi gerekebilir.
   3. Ayrı U alt 96-şey kalıp Tavlama plakaetiketli al. 1 µL ana bir karışımını yapmak T4 PNK, 10 T4 DNA ligasyonu arabellek x 1 µL ve reaksiyon tavlama başına su 6 µL.
   4. Ana karışımı 8 µL tavlama plaka her şey için ekleyin. 100 µM 1 µL, mantıklı ve antianlamlı oligo (veya karışık anlamda-anti-sense oligos 2 µL) ana karışıma ekleyin. 2-3 kez pipet yavaşça karıştırın için kısaca kuyu dibine karışımları almak için plaka spin.
   5. PCR makinede aşağıdaki tavlama programı kullanmak: 37 ° c, 2 dk 30 sn 95 ° C'de 30 dk takip tarafından yavaş soğutma-0,1 oranında 22 ° c ° C/s. Tavlama sonra Seyreltilmiş OligoMixetiketli taze bir 96-şey plaka almak. Bu plaka bir çok kanallı pipet kullanarak yukarıdaki tepki su (1: 200) ile gelen fosforile ve tavlanmış oligos sulandırmak.
   6. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - Özeti 5 µg BbsI Restriksiyon enzimi (10.000 adet/mL) 1,5 µL ile W vektör uygun bir arabellek 37 ° C'de 2 h için daha sonra ligasyonu linearize kullanarak.
   7. Tüp ligasyonu plaka etiketli bir taze 96 iyi tabak alıp 20 BbsI ng sindirilmiş pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - W vektör istenen sgRNA tüp ligasyonu başına bir şey için. Bu, Seyreltilmiş OligoMix plaka fosforile, tavlanmış oligos 2 µL Ekle.
   8. 10 x T4 ligaz arabelleği 1 µL ve T4 DNA ligaz enzim 1 µL ekleyin. Yavaşça ile çok kanallı pipet pipet ve ligasyonu mix 2 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
      Not: Tüp ligasyonu karışımları daha sonra dönüştürme adımı için-20 ° C'de muhafaza edilebilir.
   9. Bu arada, kimyasal olarak yetkili E. coli tezcan 90 µL buz ligasyonu adım sonundan önce 10 dk hücreleri.
   10. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yetkili hücre 10 µL aliquots ayrı 96 iyi kalıp her kuyuya olun.
   11. De yetkili hücreleri, pipet yukarı ve aşağı yavaşça içeren içine adım 2.1.8 ligasyonu karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
   12. Pipet 5 µL doğrudan bir 6 içine yukarıdaki reaksiyon gelen bakteri DNA Mix de plaka LB-agar 100 µg/mL ile ampisilin içeren. Her dönüşüm reaksiyonlar için yineleyin.
   13. Her dönüşüm reaksiyonu ayrı olarak etiketli içine de bir 6-şey plaka plaka. Yaklaşık 5-8 cam boncuk her şey ve bütün 6-şey plaka 8-10 kez dairesel hareketlerle salla ekleyin.
   14. Her şey bir steril 20 µL pipet ucu ile 1-2 tek kolonileri seçim ve LB agar ve 100 mg/mL ampisilin ile steril 10 cm Petri kabına üzerinde dikkatle etiketli bir nokta haline çizgi. LB plaka çizgiler sonra sadece alt tüp yuvarlak 14 mL içeren ortamda karşılık gelen bakteriyel klon numarası ile işaretlenmiş 3 mL LB-ampisilin clone çizgiler için kullanılan ucu dışarı atmak.
   15. Bakteriyel plaka doğrudan Sanger için göndermek insan U6 organizatörü ileri astar ile sıralama.
   16. Klonlanmış sgRNAs sıra onay sonra üreticinin yönergelerine göre Mini hazırlık seti kullanarak karşılık gelen 14 mL tüp DNA'dan arındırmak.
   17. Spektrofotometre ile konsantrasyon ve her biri mini preps kalitesini ölçmek. Her mini hazırlık'a 15 ng/µL ve pipet konsantrasyon sgRNA klonlar plakaetiketli bir 96 iyi tabak içine normalleştirmek.
       Not: Bu plaka-20 ° C'de depolanan veya doğrudan virüs hazırlık için kullanılan.
2. SgRNA yapıları ve iletim viral imalatı
   1. 96-iyi biçimde sgRNA lentiviral parçacıklar üretimi için izleyin "shRNA/sgRNA/ORF yüksek üretilen iş Viral üretim (96 iyi)" Broad Enstitüsü genetik pertürbasyon platformu (GPP web Portal) iletişim kuralından (URL: https:// Portals.broadinstitute.org/GPP/public/Resources/Protocols).
   2. Steril tüpler, viral süpernatant 200 µL aktarmak ve hemen-80 ° C'de dondurmak.
   3. Gün -1: bir düz dipli sigara-doku kültürü tedavi 96 iyi plaka ile 10 µg/mL BSL2 hücre kültür başlıklı bir konsantrasyon, rekombinant insan fibronektin parçasının 100 µL kat. Buharlaşma kaybı önlemek ve tezgah gece bırakın sarılmak wrap kullanarak plaka sarın.
   4. 0. gün: rekombinant insan fibronektin parçası her kuyudan çıkarın. Her sgRNA oda sıcaklığında viral süpernatant çözülme. Viral süpernatant ile 50 µL her tüp her iyi ve iletim levha kaplı ekleyin. İletim plaka 1.300 x g 35 ° C'de 90 dk için de spin
   5. Spinfection sonuna doğru kültür şişeye hücrelerden MOLM13-Cas9 (klon B3) saymak. Kuyuda 100 µL birim başına 10.000 hücreler kullanın. Ölü cilt göz önünde bulundurarak tüm iletim kuyuları için hücreleri saymak.
   6. 90 dk spinfection sonra 50 µL yavaş yavaş plaka eğerek ayarlanmış bir çok kanallı pipet kullanarak kuyulardan süpernatant kaldırın. MOLM13-Cas9 klon B3 hücre kültürünün 100 µL her şey yavaş yavaş aşağı belgili tanımlık kenar kayan için ekleyin.
   7. 1.300 x g 2 dk 35 ° C'de hücreler alt yerleşmek izin vermek için de plaka Döndür. Plaka da 37 ° C doku kültürü sınıf kuluçka aktarın.
   8. 1. gün: 100 µL taze orta de içeren her sgRNA için Cas9-MOLM13 transduced veya son Orta hacim 200 µL öyle ki Cas9-MLL-AF9 lösemi hücreleri ekleyin.

3. rekabetçi büyüme tahlil

1. Gün 3: 72 saat (3 gün) iletim sonrası, akış sitometresi (FACS) tarafından her şey BFP pozitif hücreleri içeren sgRNA yüzdesini kontrol edin. Bir hücre canlılığı boya işaretlemek ve ölü hücreleri çözümleme dışı bırakmak için kullanın.
2. Hücrelerin bir kısmı yeni kuyu taze orta ile aşırı büyüme sırasında tahlil önlemek için her FACS analiz sonra yeniden kaplama devam edin.
3. FACS analiz 2-3 günde BFP pozitif (BFP + ve) hücreleri BFP negatif (BFP-ve) meslektaşları (Şekil 3) karşılaştırıldığında göreli oranı kontrol etmek için yineleyin. BFP pozitif hücrelerinin (FlowJo veya benzer FACS analiz yazılımı kullanarak) her zaman için yüzdesi analiz.
   1. FCS dosyaları her örnek için FlowJo yazılım için sürükleyin. Çift tıkırtı üstünde herhangi bir örnek eğe ve yan dağılım (SSC) FSC ile X ekseni ve SSC Y ekseninde vs ileri dağılım (FSC), bir nokta Leke arsa. Tüm hücreleri kapı.
   2. Geçitli hücreler üzerinde çift tıklayın ve onları canlılığı leke (Y ekseni) FSC yüksekliği (H) veya alan (A) nokta leke vs üzerinde arsa. Kapı canlılığı olumsuz (canlı) hücreleri leke.
   3. Çift Kapılı canlı hücreleri üzerinde tıklayın ve BFP (Y ekseni üzerinde) FSC (A) vs eksen çizmek. Kapı BFP + ve hücreleri. Bu kapılardan grubu sekmesi altında Tüm örnekleri için seçilen örnek sürükleyerek tüm örnekleri için geçerlidir.
   4. Tüm örneklerin Analizi tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi üzerinde tıklatın. BFP + ve sayısı bir örnek tabloya sürükleyin ve Bordro dökümü tüm örneklerinin BFP + ve hücreleri yüzdesini gösteren bir tablo oluşturmak için Tablo Düzenleyicisi'ni görüntüle düğmesini tıklayın. Tabloyu bir xls kaydedin.
4. Orantılı artış hesaplamak veya % BFP pozitif hücreler zamanla canlı hücre nüfus içinde düşüş gösteren ve bu oran kontrol sgRNAs (örneğin, luciferase, şifreli veya GFP sgRNA) BFP pozitif hücrelerinin oranı karşılaştırın.
5. 3. gün taban çizgisi olarak kullanarak denetimlerin yanı sıra, faiz, gene(s) de dahil olmak üzere farklı sgRNAs için BFP pozitif hücrelerinin oranını arsa.

Bizim çalışmada, ilk MLL-AF9 translocation Cas9-blasticidin lentiviral plazmid kodlama yüksek titresi virüs taşıyan MOLM13 insan AML hücre kültürünü transduced. Elimizde, sıralanmamış MOLM13-Cas9 hücreleri yüksek düzey Cas9 ifade Western blot tarafından göstermedi ve aynı zamanda ne zaman de verimli gen için düzenleme yöntemi kullanılarak denenecektir gerçekleştirmedi toplu⁷daha önce açıklanan. Bu nedenle, tek hücre klonlar kurmak ve Western blot (Şekil 1) tarafından görüldüğü gibi Cas9 yüksek seviyede olan klonlar sadece seçmek için devam etti. Biz 2 ayrı klonlar aldı ve onları AAVS1 safe Harbor anlaşmasının odağı olarak açıklanan önceki⁷bir site hedefleme sgRNAs ile transduced. Puromisindir tarafından seçilen MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA--dan hulâsa genomik DNA'yı kullanarak klonlar, biz bir PCR site kesmek AAVS1 sgRNA kapsayan primerler kullanılarak gerçekleştirilen ve belirli bir 268 bp PCR ürünü her MOLM13 klon için 10 izole kolonilerden sanger sıralı. Ebeveyn serisi ile hizalama sonra MOLM13-Cas9 klon B3 ve MLL-AF9-Cas9 klon 8 bir verimlilik % 100 (veri gösterilmez) olduğu bulundu. Biz o zaman yüksek Cas9-aracılı genom düzenleme yeteneği bizim sgRNA rekabet deneyleri için görüntüleme bu klonlar seçildi. Bu çalışmalar yapılmıştır iken, hızla genom düzenleme verimliliği Sanger dizilerinden test için web tabanlı araçları gelgit⁸ (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) veya buz (https://ice.synthego.com/#/) gibi farklı gruplar tarafından geliştirilmiştir. Bu araçlar son derece kolay ve bireysel parçaları klon ve sıralama birden fazla klon gerçekleştirmek zorunda kalmadan genom düzenleme verimliliği değerlendirmek için uygun maliyetli hale. Bu nedenle, toplu Cas9 ifade hücreleri ilk düzenleme bu yöntemleri kullanarak verimliliği genom için test edilmelidir. Genom düzenleme verimliliği yüksek olması durumunda, o zaman tek hücre klonlama gerekli değildir. Ayrıca, tek hücre klonlama çalışmalarımız görüldüğü gibi gereklidir diye, bu örümcek ağı-esaslı mutational frekans tahmini araçları birkaç klonlar paralel olarak test etmek için çok daha hızlı bir yöntem sunar.

SgRNA klonlama için yaptık plazmid pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - klonlama sgRNA kullanın transduced sgRNA hücreleri ve ifade sürücüler bir RNA polimeraz III odaklı insan U6 organizatörü izlemek için bir mavi flüoresan protein (BFP) limanlar W klonlanmış sgRNAs izleyici RNA (tracRNA) iskele ile birlikte. Biz 2 sgRNAs DOT1L, gen ekspresyonu epigenetik Yönetmelikte önemli bir rol oynamak için bilinen bir protein hedefleme klon için bu sistemi kullanılır. DOT1L mono, di ve tri-metilasyonu hedef genlerin^9,10mevduat histon metiltransferaz var. Çalışmalar DOT1L MLL-fusion oncogenes tarafından tahrik AML önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu nedenle, CRISPR-Cas9 kullanarak DOT1L nakavt fare MLL AF9 lösemi hücre çoğalması önceki çalışmalar^11,12,13,14doğrultusunda önemli ölçüde zarar yol bekleniyor. Biz iki sgRNAs PPP1R12C gen intron içinde olduğunu AAVS1 güvenli liman locus hedefleme kullanılır. Bu sitedeki genomik değişiklikler üreten sgRNAs MLL-lösemi hücre hatları proliferatif kapasitesi üzerinde herhangi bir etkileri için olası değildir. Pozitif kontrol, DNA çoğaltma ilişkili gen RPA3 hedefleme sgRNAs klonladım. RPA3 birkaç AML hücre hatları^4,15,16 yayılması için önemli olduğu gösterilmiştir bir pan-temel gen olduğunu. Anti-RPA3 sgRNAs bu nedenle güçlü anti-proliferatif efektleri AML hücrelerinde görüntülemek ve genellikle olumlu bir denetim olarak kullanılır. Anti-AAVS1 ve anti-RPA3 sgRNA plazmidleri ile iletim sonra BFP + ve göreli oranı şiddetindeydi sgRNA transduced hücreleri BFP-ve meslektaşlarına göre 2-3 günde Kültür (Şekil 3). Yukarıda açıklanan protokolüyle 60-%70 iletim verimliliği ile untransduced kalan % 30 – 40 hücreleri bırakarak hazırlıklarımız viral veya BFP-ve her şey içinde MOLM13 veya MLL AF9 AML hücre iletim sonuçlandı. Bu göreceli vahşi tipi hücreler aynı genom düzenlenmiş hücrelerin çoğalması incelenmesi için de sağlar. SgRNA fonksiyonel etkisini yansıtmak için bir ölçü gen-silme MOLM13-Cas9 hücrelerdeki aracılı gibi orantılı artma veya azalma transduced sgRNA hücre yüzdesi olarak kullanıldı. İlgi, gen testi AML hücrelerin çoğalması için önemli ise, o zaman bu gen sgRNA-aracılı bozulma sgRNA ifade BFP + ve hücreleri BFP-ve hücreleri ile karşılaştırıldığında göreceli azalma tahlil süresince olacak yol, sgRNAs, luciferase hedefleme GFP veya gerekli olmayan genler korur, ancak BFP + ve zaman içinde /-ve oranı.

2 ayrı anti-RPA3 sgRNAs kullanarak, biz BFP yüzdesi ilerici ve önemli bir düşüş gözlenen + ve hücreleri ile karşılaştırıldığında BFP ve untransduced meslektaşları. Buna ek olarak, anti-AAVS1 sgRNA BFP hücreleri ifade etme yüzdesi zamanla AAVS1 hedefleme MOLM13 hücrelerin (4a rakam) çoğalması üzerinde etkisi yoktur gösteren nispeten sabit kaldı. Benzer şekilde, fare MLL-AF9-Cas9 hücrelerde, Rhodopsin (Rho1), bir negatif kontrol ve Dot1l, zaman içinde MLL AF9 lösemi hücrelerin çoğalması için gerekli olduğu bilinen bir epigenetik regülatör göz pigmentasyon gen hedefleme sgRNAs etkilerini test ettik . Bu çalışma, BFP + ve fare MLL-AF9-Cas9 hücreleri ile 2 ayrı anti-DOT1L sgRNAs transduced bir dramatik ve ilerici kaybı BFP-ve sigara transduced sgRNA hücrelere (Şekil 4b) göre zaman içinde gösterdi. Buna ek olarak, anti-Rho1 sgRNA oranını zaman içinde nispeten değişmeden kaldı. Bu sonuçlar MLL-fare lösemi hücreleri Dot1l tükenmesi için ifade, daha önce yayımlanmış sonuçları teyit AF9 güvenlik açığı gösterilmektedir.

Şekil 1: temsilcisi Western blot sonuçları gösteren farklı Cas9 düzeyleri. Tek hücre klonlar CAS9 ile transduced MOLM13 AML hücresi satırının Anti-bayrak antikorları kullanarak bayrak-Cas9 ifade düzeyleri için probed. Cas9 yüksek ifadesi gösterilen klonlar daha fazla çalışmalar için seçildi. HEK293-T hücreleri ifade plazmid negatif denetimleri kullanılan olumlu denetim ve Cas9 sigara transduced MOLM13 hücreler bir Cas9 ile transfected. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: buz analizi ile değerlendirilmesi Dot1l odağı, genom düzenleme temsilcisi analiz. Dot1l sgRNA hedef sitenin etrafında merkezli bir PCR amplicon Sanger sıralı ve buz analizi kullanılarak analiz yapıldı. Sigara hedefli DNA dizisi (yeşil hat) sgDot1l dizisine (turuncu çizgi) karşılaştırılması düzenleme verimliliği sgRNA hedef site çevresinde sgDot1l hedef hücrelerdeki yüksek düzeyini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: önerilen yöntemlerden şematik iş akışı. sgRNAs Co BFP gibi floresan bir protein ifade sgRNA ifade vektör klonlanır. Hedef hücrelerin % 30-60 iletim oranlarda transduced ve akış-sitometresi tarafından 2-3 günde izledi. AML hücre çoğalması için gerekli genler hedefleme sgRNAs zaman içinde göreli tükenmesi gösterildiği gibi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: temsilcisi sonuçlar rekabet deneyleri insan ve fare AML hücreleri. (bir) sonuçları istatistiksel olarak son derece önemli bir ilerici düşüş RPA3 MOLM13-Cas9 klon B3 hücrelerini transduced gösteriyor. Buna ek olarak, sgRNAs AAVS1 site hedefleme etkisi yoktur. (b) sgRNAs Dot1l hedef sgRNAs Rhodopsin (Rho) hedefleme aksine rekabetçi yayılması dikkat çekici ve ilerici bir düşüş gösterir. p > 0.05. p < 0.05. Hata çubukları demek (SD)'in standart sapması temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: iletişim kuralının genel hatları. (bir) Cas9 virüs ve sgRNA açıklanan klonlama üretiminde her adımın zamanı. Tasarım ve sgRNAs klonlama istikrarlı Cas9 ifade ile AML hücresi satırlarının tek klonları oluştururken gerçekleştirilebilir. (b) genel protokol AML hücre satırları sgRNAs ve rekabetçi büyüme tahlil FACS kullanarak iletim için gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: AAVS1 locus güçlendirme genomik DNA PCR programı. PCR program genomik DNA test kesme verimliliği Cas9 Cas9 klonlar ifade etmek için gelen AAVS1 locus güçlendirme için kullanılır.

Ek dosya: sgRNA oligo dizileri. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Bu makale, biz aday genler akış sitometresi insan/antikorundan AML hücrelerinde (Şekil 5) kullanarak AML hücre hatlarında rolünü araştırmak için bir CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet büyüme tahlil yürütmek için detaylı bir protokol tanımlamak. Testin amacı iki ya da üç hafta boyunca bir orta-den geçerek ölçekte bakım gen silinmesiyle AML hücre çoğalması etkisini belirlemektir. Bazı kritik adımlar dikkatle açıklanan protokolünden yükseltme kolaylaştırmak için izlenmesi gereken. Cas9 lentivirus üretiminde şartına virüs orta süpernatant içeren virüs hücrelere 293T ertelenmiş önlemek için 0,45 µM filtre ile filtre uygulamak gereklidir. Spinfection sırasında spinfection plaka sarılmak şal veya parafilm ile kaydırma sırasında Santrifüjü potansiyel kirlenmesini önlemek yardımcı olur. Ancak, şal spinfected plaka geri doku kültürü kuluçka makinesine koymadan önce kaldırılmalıdır. Cas9 ifade klonlar düzenleme verimliliği için değerlendirmek çok önemlidir. Klonlar düşük-genom düzenleme verimliliği ile yetersiz Cas9 etkinliğini yansıtır ve deneme başarı oranını etkileyebilir. Bizim deneylerde ilk insan AML Cas9 klonlar AAVS1 odağı hedefleme sgRNAs ile transduced ve düzenleme verimliliği için onların genomik DNA'lar sıralı. Düzenlenmiş AAVS1 karşılaştırılması ve wildtype dizileri gelgit⁸ (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) veya buz (https://ice.synthego.com/#/) gibi online web tabanlı araçları kullanarak tespit edilebilir. Bu programlar düzenlenmemiş wildtype veya başvuru sırası parçası ve frekans değişiklikleri tahmin etmek potansiyel olarak düzenlenmiş PCR izleri sıra Sanger karşılaştırın. Bu ölçü hücresel Cas9 aktivitesinin olduğu test sgRNA tarafından getirdiği mutational değişiklikleri değerlendiriliyor hızlı bir yoludur. Vektör klonlama künt TOPO yapılabilir gibi alternatif olarak, PCR klonlama PCR klonlama plazmid üründe Sanger tarafından takip dizi hizalaması için her klonu tarafından genom düzenleme verimliliği değerlendirmek için bireysel kolonileri sıralama vahşi-türü. Biz, kolaylık ve maliyet-etkililik klonlama yöntemine göre verilen eski yöntemi tercih ederler. Genellikle, baz çifti keşfi değiştirir nokta mutasyonlar, indels, vbgibi., ya da büyük bir çoğunluğu sgRNA kesme sitedeki çevresinde sıralanmış klonlar göstermek son derece etkin bir Cas9 varlığı. Böylece, MOLM13 veya MLL AF9 lösemi B3 ve 8, sırasıyla, daha fazla deneyler için en yüksek düzenleme verimliliği ile klonlar seçti.

Biz farklı genler http://crispr.mit.edu/, sgRNAs bir listesini verir web tabanlı bir yazılım kullanarak iletişim kuralında belirtilen hedefleme sgRNAs tasarlanmıştır. Bu sgRNAs üst Puanlama bu öngörülen hedef kapalı efektleri ile ortadan kaldırmak için listeden seçmek için önerilir. Gibi olan (http://www.addgene.org/67974/) Web sitesinde yayımlanan iletişim kurallarından herhangi birini kullanarak tasarlanmış sgRNAs kopyalanmış. Anlam ve antisens oligos ilk fosforile ve tavlanmış 2.1.5 adım başı olarak. İlk adım 37 ° C'de oligos T4 kinaz ile phosphorylating için önemlidir ve sonraki PCR döngüleri anlam ve anti-anlamda oligonucleotides dsDNA tavlama için önemlidir. Transduced sgRNA hücrelerde rekabet deneyleri daha sonra izlemek için çok önemli olan sgRNA klonlama vektör floresan bir protein olması önemlidir. sgRNA klonlama tavlama ve ligasyonu dahil olmak üzere tüm adımları 96 iyi plaka kullanımı ile ölçeklenir. Onlar çok kanallı pipetler ile uyumlu olduğundan tüp ligasyonu için temiz PCR microtube şeritler de kullanılabilir. Büyük sgRNA klonlar çeşitli dönüştürme gereklidir, hangi 10 μL yetkili hücrelerinin bir 96-şey plaka öncesi bölünmemeli her kuyuya ve-80 ° C'de donmuş tüm süreci hızlandırmak için kullanılabilir. 96-iyi biçimde gerçekleştirilmesi güç olan bireysel koloniler, almak için ligasyonu reaksiyonlar kaplama amacı dür. Bu nedenle, bakteriyel dönüştürme için kaybıdır bir hafif ölçeklenebilirlik. Yine de, tüm bir 96-şey plaka reaksiyonlardan dönüştürme kaplama için bile, bu sadece on altı 6-şey plakaları tüm projeye ait toplam gerektirecektir. Bir sonraki adımda kolonileri dönüştürme plakalar üzerinden malzeme çekme dikkatli olmak zorunda. Bir koloni etiketli bir leke çizgiler ise, spot diğer noktalardan açıkça izole olduğundan emin olun. Bir kareden oluşan bir kılavuz Petri kabına dibindeki karanlık kalıcı bir kalem ile işaretleme çapraz bulaşma bakteriyel klonların önlemeye yardımcı olur.

Minipreps sgRNA yapıları, hazır olduğunda, virüs 96-iyi biçimde yapılabilir. Üretilen iş bu düzeyde, şunun süpernatant içeren 200 µL filtre uygulamak için zordur. Bu nedenle, viral süpernatant çapraz kontaminasyon süpernatant taşınır herhangi bir 293T hücrelerden en az gece dondurulmuş olması. Da saklanabilir önlemek için şeritler 50 µL aliquots steril PCR tüp süpernatant çözdürme dondurmak. Ayrıca, bu virüs şartına supernatants AML hücreleri transducing için kullanılır. Bu titreleri, düşük diye viral iletim gözlenen, hücreleri BFP + ve düşük frekans tarafından değerlendirildi gibi o zaman viral titresi ve farklı çokluğu, test transductions enfeksiyonlar (40-60 oranında sağlamak için MOI) belirlemek için önemli olabilir iletim hızları. Viral titresi belirlenmesi ve MOI hesaplama açıklanmıştır ayrıntılı olarak burada¹⁷. Rekabet assay olarak, iletişim kuralının, adım 3'te açıklandığı gibi bu otomatik floresans üzerinden sahte eserler BFP BFP sigara oranı analiz edilirken önlemek için uygun olmayan hücreleri dışlamak önem arz etmektedir. FACS, zaman test örnekleri, analiz önce BFP negatif ve pozitif BFP kontrolleri kullanımı doğru gerilim ayarlamak için önerilir. Yeniden kaplama her zaman noktada hücreleri konsantrasyon verilen zamanda noktada cilt hücrelerinin yeniden kaplama olmak bağlıdır. Biz genellikle 200 μL toplam üzerinden 20 μL her zaman-nokta taze bir kuyunun içine taze orta 180 μL ile yeniden kaplama. Kapsamlı hücreleri karıştırma yavaşça yukarı ve aşağı yeniden kaplama önce pipetting tarafından önerilir. Genellikle, tahlil 15-20 gün içinde yürütülen gerekir gözlemledim haber güçlü değiştirir BFP + ve/ve oranları, her ne kadar bu gen gen değişir.

Bu deneysel kurulum paralel süratle AML hücrelerin çoğalması ya da rolü hayatta kalma aday genlerin tanımlamak için birden çok AML hücre satırlarını birkaç genler test için uygundur. Burada açıklanan rekabetçi yayılması testin bir uyarı bu olaylar aynı içinde olmayan hedef hücre nüfus etkileyebilir gen hedef hücrelerden sinyal parakrin gibi potansiyel hücre ekstrensek faktörler iyi dikkate almaz ki var. Bu nadir bir olay olabilir rağmen bu faktör bu tahlil iletken zaman kaynaklı. Her ne kadar biz-si olmak kullanılmış AML örnek olarak paralel olarak birden çok genlere rolünün tanımlamak için herhangi bir kanser hücre satırı için bu yöntem kullanılabilir Bu el yazması açıklanan CRISPR-Cas9-tabanlı rekabet deneyleri için. Gen-silme çeşitli avantajları vardır CRISPR Cas9 gen-nakavt üzerinde kullanarak RNA girişim kullanma. İlk olarak, genellikle geniş bir hedef mRNA inhibisyon gösteren shRNAs aksine tam nakavt hedef genlerin Cas9 nükleaz ile birleştiğinde sgRNAs transpozisyonlar. Bireysel sgRNAs yanı sıra shRNAs hedefleme verimliliğini yaygın olarak değişebilir uyardı gerekir olsa bile bu CRISPR-Cas9-tabanlı yöntemleri ile daha dramatik ve tutarlı fenotipleri neden olabilir.

Akış Sitometresi-tabanlı rekabet tahlil hangi hücreleri sabit sayıda gen tedirgin hücreleri göreli proliferatif aktivitesini ölçmek için kaplama geleneksel proliferasyon deneyleri birkaç avantaj sunar. Hücre göreli proliferatif aktivite kolay ve hızlı akış-sitometresi tarafından birkaç gün için her kaplama adımda sayma hücre ihtiyacını atlayarak ölçülebilir bir üstünlüktür. Çok sayıda aday sgRNAs tüm Wells sayma olarak birkaç genler, hedefleme test hantal ve yanlışlıklar için neden olabilir bu yararlıdır. Aksine, hücre büyümesi için ATP tabanlı ölçüm deneyleri, akış sitometresi bu yöntem uzun vadeli analiz için yararlı kılan bir örnekleme canlı hücrelerin üzerinde gerçekleştirilebilir. Bu çalışmada AML hücrelerin çoğalması oyunculuk geç etkiler gösterebilir ve uzun vadeli deneyleri gerektirebilir epigenetik modülatörler gibi faktörler, özellikle faydalıdır. İkinci olarak, aynı içinde sigara transduced hücrelerinin de tahlil için temel ayarlamak için kullanılan bir iyi kontrollü hücre nüfus için sağlar. Ne zaman kurulum bir 96-iyi biçimde, tahlil neredeyse tamamen çok kanallı pipetler kullanarak yapılabilir, üçüncü olarak, önemli ölçüde tüm işleminizi sgRNAs virüs hazırlık ve sonunda akış sitometrik değerlendirilmesi için klonlama hızlandırmak Floresan.

Burada anlatılan yöntem verimli ölçekli-up içinde koşut dizilmiş bir ekran içinde 96 sgRNAs incelenmesi için olabilir. 4-6 sgRNAs gen başına varsayarsak, bu yöntem bu nedenle paralel en az 16-24 genlerin hızlı sorgulama için kullanılabilir. Sayıda AML hücrelerinde sorgulanma ihtiyacı tüm bir moleküler yolu gibi genler durumunda havuza alınan CRISPR-Cas9-esaslı ekranlar daha faydalı olacaktır.

A.J.D A2A ilaç (New Jersey) ve Salgomed tedavi (San Diego) için bir danışmandır. Diğer yazarların herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için vardır.

PCW-Cas9 plazmid Eric Lander & David Sabatini (Addgene plazmid # 50661) ve pKLV2-U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - hediyesiydi W plazmid Yusa laboratuarından (Addgene plazmid #67974. Akış Sitometresi çekirdek SBP tıbbi Discovery Enstitüsü'nde akışı analizi ve sıralama ile zamanında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Bayan Tata Anıtı Vakfı A.D. için destek kabul etmek istiyoruz Ayrıca aşağıdaki finansman kaynakları destek kabul etmek istiyoruz: NIH/ncı P30 CA030199 Kanser Merkezi Grant sponsorluğunda, V-Vakfı ve San Diego ncı kanser merkezleri (C3) #PTC2017to A.J.D.