CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

진 섭 동 연구 AML pathogenesis 개별 유전자의 역할을 조사 하기 위해 광범위 하 게 사용 되었습니다. 이러한 연구의 대부분을 만들었습니다 달성을 위한 완전 한 유전자 장애, 복잡 한 유전자 녹아웃 모델의 사용. 녹아웃 쥐와 이러한 연구는 유전자 형 관계를 조사 하는 우아하고 시간 시스템 제공, 후보 유전자를 평가 하기 위한 신속 하 고 확장 가능한 방법 하는 AML 세포 증식에 역할 또는 재생 AML 모델에 생존 여러 후보 유전자의 병렬 심문을 촉진 하는 것을 도울 것 이다. 게놈 편집 기술에서 최근의 진보는 극적으로 전례 없는 규모에 유전 섭 수행 하는 우리의 능력 향상 된. 편집 하는 게놈의 한 그러한 시스템 대상 셀 게놈에 신속 하 고 효과 변경을 하는 데 사용할 수 있는 CRISPR-Cas9-기반 방법입니다. 편리 하 고 CRISPR/Cas9-중재 유전자 삭제의 확장성은 유전자의 많은 수의 심문에 대 한 가장 매력적인 기술 중 하나 phenotypic 분석 실험에 있습니다. 여기, 우리 인간의 생존 또는 확산에 중요 한 역할을 재생할 수 있는 유전자의 역할을 조사 하기 위해 중재 CRISPR/Cas9 유전자-중단 높은 처리량 흐름 cytometry-기반 경쟁 분석 실험 결합을 사용 하 여 간단한 분석 결과 제시 하 고 murine AML 셀 라인입니다.

지난 몇 년간 주요 분자 경로 급성 골수성 백혈병 (AML) 병 인에의 기여를 식별에 초점을 맞춘 많은 연구 노력을 보았다. 전통적으로, 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 중단 조건부 녹아웃 쥐 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)를 사용 하 여 수행 되었습니다. 녹아웃 쥐의 유전자 삭제 spatio 시간적 제어를 위한 정교한 시스템을 제공, 유전자 녹아웃 쥐 생성 이며 노동 집약, 시간이 걸리는 비싼. 또한, 유전자 녹아웃 재결합 전략을 사용 하는 쉽게 확장할 수 없습니다; 이러한 전략 병렬로 여러 유전자의 심문에 잘 자신을 빌려 하지 않습니다. 노크 다운 생 mRNAs 작은 간섭 RNA (siRNA) 또는 shRNA 사용 하 게 RNA 방해 방법의 발견 후 많은 그룹 AML에 있는 특정 유전자의 역할을 조사 하기 위해 RNA 간섭 기법을 사용 하 여 시작 했다. 모두 인간과 murine AML 셀 악명 어려운 전통적인 지질에 기초를 둔 transfection 방법 transfect 이기 때문에, 대부분 급성 골수성 백혈병 세포에 유전자 기능 연구에 대 한 고용 lentivirally 또는 retrovirally로 인코딩된 shRNA 공부 한다. 최근 검색 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 그리고 관련된 Ca nucleases (CRISPR-Cas9) 유전자를 대상으로 기술^1,2,3에 혁명을 했다. CRISPR-Cas9를 사용 하 여, 특정 유전자 또는 genomic 지구 수 수 삭제, 편집 또는 태그와 효율성 및 용이성. CRISPR-Cas9-기반 유전자 편집은 이제 단순, 효과, 및이 기술의 광범위 한 적용 다양 한 셀 형식에 유전자 형 관계를 조사 하기 위한 선택의 방법으로 나오고 있다. CRISPR-Cas9-기반 방법은 방법의 AML, 뿐만 아니라 개별 유전자를 심문 하지만 또한 기준점과 또는 풀링된 유전 스크린에 여러 유전자를 대상 하는 방법을 위한 잠재력으로 동시에 여러 유전자 조사에 선택 되 고 또한 있다 AML 종속성^4,,56.

이 원고에서 우리는 유전자-중단 안정적인 CRISPR Cas9 중재 하는 유전자-편집 높은 처리량 cytometry 뒤에 따라 급성 골수성 백혈병 세포의 성장에 미치는 영향을 측정 하기 위한 간단한 경쟁 성장 분석 결과 설명 합니다. 이 방법은 간단 하 고 효율적인, 중간 처리 실험 조사 AML 셀에 동시에 여러 유전자의 역할에 대 한 확장입니다.

1. 생성 AML 셀 라인 클론 안정적이 고 적극적인 Cas9의 높은 식

1. Cas9 lentivirus의 생산
   1. 하루 0: 플레이트 4 x 10⁶ 293T 세포 (BSL2) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 페니실린 biosafety 수준 2에서에서 10cm 조직 문화 접시에 L-글루타민과 DMEM의 10 mL에 셀 문화 후드 인증. 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
   2. 제 1 일: 도금된 293T 세포 주 1 70-80% 합칠 해야 합니다. 오후에는 다음과 같은 프로토콜을 사용 하 여 transfection를 수행 합니다.
   3. Transfection 매체, 문화 미디어와 transfection 시 실내 온도를 따뜻하게. Transfection에 대 한 모든 필요한 플라스 녹여
   4. PsPAX2, pMD2.G의 0.9 µ g 5 mL 튜브에서 transfection 매체의 500 µ L 함께 pLenti Cas9 플라스 미드의 9 µ g의 믹스 9 µ g.
   5. 하단 튜브 라운드 14 ml transfection 매체의 1.7 mL를 추가 합니다. 튜브는 튜브의 벽을 만지지 마십시오 transfection 매체에 직접 transfection 시 약의 57 µ L를 추가 합니다.
   6. 부드럽게 transfection 시 솔루션 전체 플라스 미드 믹스를 추가 하 고 측면에 튜브를 부드럽게 눌러 혼합. 20-30 분 동안 실내 온도에 혼합물을 품 어. 한편, 시드 293T 접시에서 매체를 변경 합니다.
   7. 접시에 dropwise transfection 믹스를 추가 하 고 부드럽게 옆으로 효율적인 혼합 접시 바위. 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓습니다.
   8. 제 2 일: 셀 하지 방해 또는 접시에서 제거 되도록 transfection 접시에서 상쾌한 부드럽게 발음. 폐기는 상쾌한. 셀을 dislodging 피하려고 접시의 측면에서 부드럽게 아래로 슬라이딩 하 여 신선한 10 %DMEM 매체의 10 mL를 추가 합니다.
   9. 제 3 일: 10 cm 살 균 주사기로 그려서 천천히 상쾌한 transfection 접시에서를 포함 하는 바이러스를 수집 합니다. 주사기에는 상쾌한 수집 후 주사기를 살 균 0.45 μ M 필터를 연결 누르고 주사기와 필터 폴 리 프로필 렌 신선 하 고 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 있습니다. 부드럽게 상쾌한을 포함 하는 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 0.45 μ M 필터를 통해 바이러스를 필터링 하는 주사기를 찔 러.
   10. Aliquots-80 ° c.에 2 mL cryovials에서 2 mL를 각각의 바이러스 성 조절된 매체 저장
2. AML 셀 라인의 변환
   1. -1 주: 살 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 10 µ g/mL을 1 mg/mL 재조합 인간 fibronectin 조각 재고 희석. 코트 조직 문화 승인 BSL2 셀 문화 후드에서 6 잘 플레이트 10 µ g/mL 재조합 인간 fibronectin 조각 작업 솔루션의 2 개 mL를 취급. 집착 포장 손실을 방지 하기 위해 증발 하 고 실내 온도에 상점에 하룻밤 사이에 접시를 래핑하십시오.
   2. 하루 0: Cas9를 포함 하는 바이러스 성 상쾌한 녹여. 바로 전에 spinfection 코팅된 접시에서 완전히 재조합 인간 fibronectin 조각 솔루션 발음 접시에 Cas9와 함께 바이러스 성 조절된 매체의 2 개 mL를 추가 하 고 1300 x g 35 ° c.에 90 분에서 그것을 회전합니다 바이러스 성 입자 spinfected 잘 연결할 수 있습니다.
   3. 한편, 불리고 수를 셀의 개수 및 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 2 x 10⁶ 셀 아래로 회전. 상쾌한 발음 하 고 신선한 문화 미디어의 2 mL에 펠 릿을 resuspend.
   4. Spinfection, 후는 spinfected에서 모든 바이러스 상쾌한을 잘 제거 하 고 삭제 합니다. 상쾌한에서 retroviral 입자는 spinfected의 바닥에 잘 붙어 있다. 이 음, 위의 단계에서 매체의 2 ml에서 resuspended 2 x 10⁶ 셀을 추가 합니다.
   5. 1300 x g 아주 짧게 (1-2 분) 하단에 정착 셀 수 있도록 충분 한에서 다시 접시를 회전 합니다. 인큐베이터에 접시를 놓고 우물에 연결 된 spinfected 바이러스 성 입자와 변환에 대 한 하룻밤 둡니다.
   6. 제 1 일: 셀 밀도 따라 자라 난을 피하기 위해 transduced 세포에 더 많은 매체를 추가 합니다.
   7. 제 2 일: pLenti Cas9 플라스 미드 Blasticidin 저항 마커 있기 때문에, 10 µ g/mL 복용량을 불리고 untransduced (제어) MOLM13에 Blasticidin 또는 마우스 MLL AF9 백혈병 세포 세포를 표현 하는 Cas9의 선택에 대 한 추가 합니다.
      참고: Untransduced 컨트롤의 모든 셀을 제거 하는 때 Blasticidin 선택 Cas9 불리고 MOLM13 또는 MLL AF9 백혈병 세포의 완전 한 여겨진다. 최적의 복용량을 사용할 수 있도록 MOLM13과 MLL AF9 백혈병 이외의 셀 라인, 복용량 응답 곡선이이 실험 전에 수행 해야 합니다. 바이러스 성 상쾌한의 적정도 낮은 변환 속도 경우 수행할 수 있습니다.
3. 높은 Cas9 표현 세포의 클론.
   참고: 우리 일부 급성 골수성 백혈병 세포 라인에 클론 선택 되지 않을 수도 있습니다 필요 것으로 나타났습니다: 대량 Cas9 Blasticidin 선정 인구는 이미 높은 게놈 편집 효율을 하고있다. 이 경우 1.3 단계를 생략 하 고 서 부 blotting에 의해 대량 Cas9 blasticidin AML 셀에 Cas9 식 평가 단계 1.4 이동 가능 하다. 그것은 여전히 경쟁 분석 실험을 진행 하기 전에 대량 Cas9 AML 셀 (단계 1.5)에 유전자 편집 효율성을 평가 하는 중요 한 것입니다. 우리는 높은 Cas9 단일 클론의 선택 다른 단일 가이드 RNAs (sgRNAs)의 수를 테스트 하는 경우 특히 중요 한 게놈 편집 가변성 감소 육 신.
   1. 일종의 Cas9-Blasticidin MOLM13과 MLL AF9 백혈병 세포 이제부터 불리고 MOLM13 Cas9 MLL AF9 Cas9 세포, 각각, FACS 정렬 승인 BSL2 후드에 포함 된를 사용 하 여 선택한 단일 셀을 수행 합니다. 정렬 하는 것은 5-10 둥근 바닥 조직 문화 치료 96 잘 접시에 수행할 수 있습니다.
   2. 일단 MOLM13 Cas9 단일 MLL AF9 Cas9 클론 선택 되었습니다 하 고 개별적으로 명명 된, 10 µ g/mL Blasticidin의 Cas9 식의 유지 보수를 보장 하기 위해 문화 미디어에 10-20 클론 확장.
4. 식은 immunoblotting 여 안정적인 Cas9 단백질의 확인 합니다.
   1. 제조 업체의 프로토콜에 의하여 핵 추출 키트를 사용 하 여 MOLM13과 MLL AF9 백혈병의 모든 Blasticidin 선택 클론의 핵 추출 물 확인 합니다. Cas9 단백질 표정을 반대로 플래그 pLenti Cas9 플라스 미드에 Cas9부터 M2 항 체는 N 맨끝 플래그 epitope에 연결을 사용 하 여 확인 하십시오.
   2. 10% 두번째-트리 스 젤과 위 밴드는 잘 분리까지 120 V에서 젤을 실행에 각 핵 추출에서 총 단백질의 50 µ g를 로드 합니다.
   3. 5% 우유 솔루션 1 h TBST 버퍼에 막을 차단 합니다.
   4. 하룻밤에 4 ° C에서 1 µ g/mL의 최종 농도에 반대로 플래그 M2 항 체의 1:1,000 희석와 막 품 어.
   5. 다음 날, TBST 버퍼 막 세척 하 고 HRP 활용된 반대로 마우스 2 차 항 체로 1 시간에 대 한 실 온에서 1:5,000 (최종 농도 0.16 µ g/ml)의 희석에 품 어.
   6. TBST 가진 철저 하 게 막 세척 하 고 오 점 ECL 기판을 사용 하 여 개발.
   7. 추가 기능 분석 (그림 1)에 대 한 서 부 blotting에 의해 보이는 것과 같이 Cas9의 가장 높은 단백질 식이 3-4 클론을 선택 합니다.
5. 선택 된 클론에서 높은 Cas9 활동 보장
   1. 인간을 대상으로 하는 sgRNAs와 sgRNA 인코딩 벡터에서 lentiviral 상쾌한 준비 또는 단계 1.1에 설명 된 대로 AAVS1 세이프 하버 로커 스 마우스.
   2. 상단 Cas9 표현 MOLM13 transduce 또는 위에서 설명한 spinfection 메서드를 사용 하 여 안티 AAVS1 sgRNA lentiviral 상쾌한와 함께 복제 하는 MLL AF9 백혈병. 4 일 동안 2.5 µ g/mL Puromycin 선택 합니다.
   3. MOLM13-Cas9에서 게놈 DNA를 정화 또는 제조업체의 지침에 따라 게놈 DNA 추출 키트를 사용 하 여 각각 야생-타입 컨트롤 함께 Puromycin 선택 후 복제 하는 MLL AF9 Cas9 백혈병. Taq 중 합 효소 및 표 1에 나열 된 PCR 프로그램의 마스터 믹스 x 2를 사용 하는 AAVS1_test_primers와 PCR을 수행 하는 템플릿으로 DNA의 사용 50 ng.
   4. 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 실행 하 고 젤 정화 268 기본적인 쌍 밴드 제조 업체의 프로토콜에 따라 젤 추출 키트를 사용 하 여. 생어 시퀀스 젤 AAVS1_target frag_F 뇌관을 사용 하 여 PCR 제품을 정화.
   5. 편집 편집 AAVS1의 비교 및 wildtype 시퀀스 온라인 웹 기반 도구 (그림 2)를 사용 하 여 효율성을 평가 합니다.

2. 복제 및 AML Cas9 셀에 sgRNAs의 변환

1. 보통 처리량 sgRNAs의 클로닝
   1. 웹 기반 CRISPR 디자인 소프트웨어를 사용 하 여 관심사의 유전자에 대 한 4-6 sgRNAs 디자인. 있다 다양 한 CRISPR 디자인 도구 사용 가능한 온라인 입력된 DNA 시퀀스를 기반으로 하는 sgRNA 시퀀스를 생성 하는 http://crispr.mit.edu/와 같은.
      1. 별표와 필드에 적절 한 정보를 입력. SgRNA 디자인에 대 한 대상 게놈에 클릭 합니다. 순서 상자에 대상 시퀀스를 붙여 하 고 제출 버튼을 클릭 합니다.
   2. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-에서 복제에 대 한 W sgRNA 식 플라스 미드, 뉴클레오티드 "CACC" 감각 올리고 하 "AAAC" 역방향 보충된 센스 oligo 앞에 추가 주문 하기 전에. 96 잘 접시에 혼합 순서와 반대로 감각 oligos oligonucleotide 종합 회사에서 올리고-혼합 이라는.
      참고: 우리가 만든 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-U6gRNA5 pKLV2의 사용 W 플라스 미드, sgRNA 복제 BbsI 제한 사이트 있다. 다른 sgRNA 식 플라스 미드를 사용 하는 경우에 sgRNA oligonucleotides 사용 돌출부 적절 하 게 변경 해야 합니다.
   3. 어 닐 링 플레이트를 붙인 별도 U 아래 96 잘 접시를 가져가 라. 1 µ L의 마스터 믹스 만들기 T4 PNK, T4 DNA 결 찰 버퍼 x 10의 1 µ L 및 어 닐 링 반응 당 물의 6 µ L.
   4. 어 닐 링 플레이트의 각 음을 마스터 믹스의 8 µ L를 추가 합니다. 100 µ M의 1 µ L, 감각 및 센스 올리고 (또는 혼합된 감각 안티 감지 oligos의 2 µ L) 마스터 믹스를 추가 합니다. 2-3 번 플라스틱 부드럽게 잘 섞어, 우물의 바닥에 믹스를 잠시 접시를 회전.
   5. 다음과 같은 어 닐 링 프로그램을 사용 하 여 PCR 기계에: 2 분 30 s 95 ° C에서 37 ° C에서 30 분 뒤에 느린 냉각 속도 0.1의 22 ° C에 ° C/s. 어 닐 링, 후 희석 OligoMix이라는 신선한 96 잘 접시를 가져가 라. 이 접시에 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 물 (1: 200)로 위의 반응에서 phosphorylated 고 단련 oligos 희석.
   6. PKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-의 다이제스트 5 µ g W 벡터 BbsI 제한 효소 (10000 단위/mL)의 1.5 µ L 사용 하 여 적절 한 버퍼를 37 ° C에서 2 시간에 대 한 결 찰 나중에 대 한 선형화.
   7. 신선한 96 잘 접시 결 찰 격판덮개 를 표시 하 고 추가 20 ng는 BbsI의 소화 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-pKLV2-U6gRNA5 W 벡터 원하는 sgRNA 결 찰 당 하나의 잘 하. 이 희석 OligoMix 접시에서 phosphorylated, 단련 oligos의 2 µ L를 추가 합니다.
   8. 10 x T4 리가 버퍼의 1 µ L 및 T4 DNA 리가 효소의 1 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 멀티 채널 피 펫과 플라스틱 하 고 2 시간에 대 한 실 온에서 결 찰 믹스를 품 어.
      참고: 결 찰 믹스-20 ° C 변환 단계를 나중에 저장할 수 있습니다.
   9. 한편, 화학적으로 유능한 대장균 의 해빙 90 µ L 얼음 10 분 전에 결 찰 단계 끝에 세포.
   10. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 별도 96 잘 접시의 각 음에 유능한 세포의 10 µ L aliquots를 확인 합니다.
   11. 2.1.8에는 잘 포함 된 유능한 세포, 피 펫 아래 위로 부드럽게 단계에서 결 찰 혼합물을 추가 하 고 실 온에서 10 분 동안 품 어.
   12. 피 펫 5 µ L 6으로 위의 반응에서 직접 박테리아 DNA 혼합의 잘 접시 파운드-한 천 100 µ g/mL 암 피 실린 포함 하. 변환 반응의 각각에 대해 반복 합니다.
   13. 6 잘 플레이트의 개별적 이라는으로 각 변환 반응 접시 각각 약 5-8 유리 구슬 잘 원형 운동에 있는 8-10 번 전체 6 잘 플레이트를 흔들어 추가 합니다.
   14. 살 균 20 µ L 피 펫 팁 각 우물에서 1-2 단 하나 식민지를 선택 하 고 파운드 agar와 100 mg/mL 암 피 실린 살 균 10 cm 배양 접시에서 신중 하 게 이라는 자리에 행진. 파운드 플레이트에 질주 후 단순히 하단 튜브 라운드 14 mL에 포함 매체 표시 해당 세균성 복제 수 클론 파운드-암 피 실린의 3 mL로 질주 사용 팁을 꺼냅니다.
   15. 생어에 직접 세균 접시를 보내 인간의 U6 발기인 앞으로 뇌관 시퀀싱.
   16. 복제 sgRNAs의 시퀀스 확인, 후 제조업체의 지침에 따라 소형 예비 키트를 사용 하 여 해당 14 mL 튜브에서 DNA를 정화.
   17. 분 광 광도와 농도 미니 preps의 각각의 품질을 측정 합니다. 각 소형 예비 sgRNA 클론 판표시 96 잘 접시에 15 ng / µ L와 피 펫의 농도를 정상화.
       참고: 이 접시-20 ° C에 저장 하거나 바이러스 준비에 대 한 직접 사용 될 수 있습니다.
2. SgRNA 구문 및 변환의 바이러스 성 생산
   1. 96-잘 형식에서 sgRNA lentiviral 입자의 생산에 따라는 "shRNA/sgRNA/ORF 높은 처리량 바이러스 생산 (96 잘)" 광범위 한 연구소의 유전 섭 동 플랫폼 (GPP 웹 포털)에서 프로토콜 (URL: https:// portals.broadinstitute.org/gpp/public/resources/protocols)입니다.
   2. 무 균 튜브에 바이러스 상쾌한의 200 µ L를 전송 하 고 즉시-80 ℃에서 동결.
   3. 주-1: 플랫 바닥 비 조직 문화 취급 96 잘 접시 BSL2 셀 문화 후드에서 10 µ g/mL의 농도에서 재조합 인간 fibronectin 조각의 100 µ L로 코트. 격판덮개 증발 손실을 방지 하 고 벤치에 그것을 떠나 하룻밤을 집착 포장을 사용 하 여 포장.
   4. 하루 0: 각 우물에서 재조합 인간 fibronectin 파편을 제거 합니다. 실 온에서 각 sgRNA의 바이러스 상쾌한 녹여 잘 변환 접시의 코팅 각 각 튜브에서 바이러스 상쾌한의 50 µ L를 추가 합니다. 1300 x g 35 ° c.에 90 분에서 변환 접시를 회전
   5. Spinfection의 끝 문화 플라스 크에서 MOLM13-Cas9 (클론 b 3) 셀을 계산 합니다. 100 µ L 볼륨에 잘 당 10000 셀을 사용 합니다. 죽은 볼륨을 고려 모든 변환 우물에 대 한 셀을 계산 합니다.
   6. 90 분 spinfection 후에 상쾌한 접시를 기울이기로 50 µ L를 천천히 조정 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 우물에서 제거 합니다. 각 잘 천천히 아래로 슬라이딩 가장자리에서에 MOLM13 Cas9 클론 b 3 셀의 문화의 100 µ L를 추가 합니다.
   7. 셀 아래에 정착 하 게 35 ° C에서 2 분 동안 1300 x g 에서 접시를 회전 합니다. 37 ° C 조직 문화 학년 인큐베이터에 접시를 전송.
   8. 주: 1 각 잘 포함 sgRNA 신선한 매체의 100 µ L 불리고 Cas9 MOLM13 또는 Cas9-MLL-AF9 백혈병 세포는 최종 중간 볼륨 200 µ L를 추가 합니다.

3. 경쟁 성장 분석 결과

1. 주 3: 72 시간 (3 일) 변환, cytometry (FACS)에 의해 각 잘에서 BFP 긍정적인 세포를 포함 하는 sgRNA의 비율을 확인 하십시오. 세포 생존 능력 염료를 사용 하 여 표시 하는 분석에서 제외 하는 죽은 세포.
2. 다시 도금 셀의 비율으로 새로운 우물 신선한 매체와 동안을 피하기 위해 자라 난 분석 결과 모든 FACS 분석 후 계속 합니다.
3. BFP 부정적인 (BFP-ve) 대응 (그림 3)에 비해 BFP 긍정적인 (BFP + ve) 세포의 상대적 비율을 확인 하려면 FACS 분석 2-3 일 마다 반복 합니다. BFP (FlowJo 또는 유사한 FACS 분석 소프트웨어를 사용 하 여) 각 시간 지점에 대 한 긍정적인 세포의 비율을 분석 합니다.
   1. FlowJo 소프트웨어를 각 샘플에 대 한 Fcs 파일을 끕니다. 어떤 하나의 샘플 파일에 더블 클릭 하 고 측면 분산형 (SSC)에 FSC SSC X 축 Y 축 대 앞으로 분산형 (FSC)의 점 오 점 플롯. 모든 셀 게이트
   2. 문이 셀을 두 번 클릭 하 고 금감위 높이 (H) 또는 지역 (A) 점 오 점 대 (Y 축)에 생존 얼룩에 플롯. 게이트는 생존 얼룩 네거티브 (라이브) 세포.
   3. 문이 라이브 셀을 두 번 클릭 하 고 플롯 BFP (Y 축)에 FSC (A) 대에 X 축. 게이트 BFP + ve 셀입니다. 그룹 탭에서 모든 샘플 을 선택한 샘플을 드래그 하 여 모든 샘플에 이러한 모든 게이트를 적용 합니다.
   4. 모든 샘플의 분석 테이블을 만드는 테이블 편집기 를 클릭 하십시오. 드래그 BFP + ve 테이블에 하나의 샘플에서 계산 하 고 보고서를 만들 일괄 처리의 모든 샘플 BFP + ve 세포의 백분율을 표시 하는 테이블 테이블 편집기 표시 버튼을 클릭. xls로 테이블을 저장 합니다.
4. 비례 증가 계산 또는 시간이 지남에 라이브 셀 인구 내의 %BFP 긍정적인 세포 감소 하 고이 비율 (luciferase, 발진 등 GFP sgRNA) 제어 sgRNAs에 있는 BFP 긍정적인 세포의 비율을 비교.
5. BFP 관심 기준으로 3 일을 사용 하 여 컨트롤의 gene(s)를 포함 하 여 다른 sgRNAs에 대 한 긍정적인 세포의 비율을 플롯 합니다.

우리의 연구에서 우리는 먼저 MOLM13 인간의 AML 셀 라인 높은 titer 바이러스 Cas9 blasticidin lentiviral 플라스 미드를 인코딩 MLL AF9 전 곰 불리고. 우리의 손에서 정렬 되지 않은 MOLM13 Cas9 셀 서쪽 blotting에 의해 높은 수준의 Cas9 표현식을 표시 하지 않았다 고 또한 효율적인 유전자 편집 사용 하는 방법에 대 한 분석 하는 경우에 잘 실행 하지 않았다 대량⁷이전 설명. 따라서, 우리가 단일 세포 클론을 구축 하 고 서쪽 더 럽 히 (그림 1)에 의해 보이는 것과 같이 Cas9의 상부를 가진 클론을 선택 하였다. 우리가 2 다른 클론을 포착 하 고 기술 이전⁷AAVS1 세이프 하버 소재 시에 사이트를 대상으로 하는 sgRNAs로 불리고. MOLM13-Cas9-AAVS1 Puromycin 선정 sgRNA에서 추출한 게놈 DNA를 사용 하 여 클론, 우리는 사이트 잘라 AAVS1 sgRNA 스패닝 뇌관을 사용 하 여 PCR을 수행 하 고 생어 시퀀싱 각 MOLM13 클론 10 고립 된 식민지의 특정 268 bp PCR 제품. 후 부모의 시퀀스 정렬, 우리 발견 MOLM13 Cas9 클론 b 3과 MLL AF9 Cas9 클론 8 100% (데이터 표시 되지 않음)의 효율성을 했다. 우리는 다음 높은 Cas9 중재 게놈 편집 기능 우리의 sgRNA 경쟁 분석 실험에 대 한 표시이 클론 선택. 이러한 연구를 실시 되 고 있었다, 하는 동안 빠르게 생어 시퀀스에서 게놈 편집 효율 테스트를 위한 웹 기반 도구 조 수⁸ (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) 또는 아이스 (https://ice.synthego.com/#/)와 같은 다른 그룹에 의해 개발 되었다. 이러한 도구 하기가 매우 간단 하 고 개인적인 파편을 복제 하 고 여러 클론의 시퀀싱을 수행 하지 않고도 게놈 편집 효율성을 평가 하는 비용 효율적인. 따라서, 대량 Cas9 표현 셀 먼저 이러한 메서드를 사용 하 여 효율을 편집 하는 게놈에 대 한 테스트 해야 합니다. 게놈 편집 효율 높은 경우에, 다음 단일 셀 복제는 필요 하지 않습니다. 또한, 경우에 복제 하는 단일 셀이 우리의 연구에서 보듯이 필요, 이러한 웹 기반 mutational 주파수 추정 도구 병렬로 여러 클론을 테스트 하기 위한 훨씬 더 빠른 방법을 제공 합니다.

우리가 만든 sgRNA 복제, 복제 플라스 미드 pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-sgRNA의 사용 추적 불리고 sgRNA 세포는 RNA 중 합 효소 III 기반 인간 U6 발기인을의 표현에 대 한 파란색 형광 단백질 (BFP) 항구 W 추적 프로그램 RNA (tracRNA) 비 계 함께 복제 sgRNAs. 우리는 2 sgRNAs DOT1L, 유전자 발현의 epigenetic 조절에 중요 한 역할을 알려진 단백질을 대상으로 복제를이 시스템을 사용. DOT1L 대상 유전자^9,10모노, 디, 트라이-메 틸 화를 예금 하는 히스톤 methyltransferase입니다. 연구는 DOT1L 중요 한 역할 MLL 퓨전 oncogenes에 의해 구동 하는 AML에 나타났습니다. 따라서, CRISPR-Cas9를 사용 하 여 DOT1L 녹아웃 마우스 MLL AF9 백혈병 세포 증식 이전 연구^11,12,,1314라인을 크게 저하로 이어질 전망 이다. 우리는 PPP1R12C 유전자의 intron에 AAVS1 세이프 하버 소재 시를 대상으로 하는 2 개의 sgRNAs를 사용 합니다. sgRNAs이이 사이트에 있는 genomic 변경을 생산 MLL 백혈병 세포의 증식 능력에 어떤 효과를 있지 않습니다. 긍정적인 통제로 우리는 DNA 복제 관련 유전자 RPA3를 대상으로 하는 sgRNAs 복제. RPA3는 팬-필수 유전자 여러 AML 셀 라인^4,,1516 의 확산에 대 한 중요 한 것으로 표시 되었습니다. 따라서 안티-RPA3 sgRNAs 급성 골수성 백혈병 세포에 강한 안티-증식 효과 표시 하 고 일반적으로 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리 BFP + ve의 상대적 비율을 측정 하는 안티-AAVS1 및 안티 RPA3 sgRNA 플라스 미드와 변환 후 sgRNA 불리고 BFP ve 들에 비해 셀 문화 (그림 3)에서 2-3 일 마다. 위에서 설명한 프로토콜, MOLM13 또는 MLL AF9 AML 셀의 변환 untransduced 나머지 30-40% 셀을 떠나 우리의 바이러스 성 준비와 60-70% 변환 효율 또는 BFP-ve 모든 잘에서 귀착되는. 잘 야생-타입 셀 같은 게놈 편집 셀의 상대적 확산의 연구에 대 한 수 있습니다. MOLM13 Cas9 세포에 유전자 삭제를 중재 하는 sgRNA의 기능 효과 반영 하는 척도 비례 증가 또는 감소 불리고 sgRNA 세포의 비율에 사용 했다. 관심사의 유전자 테스트 급성 골수성 백혈병 세포의 확산에 대 한 중요 한 경우, 다음이 유전자의 sgRNA 중재 중단으로 이어질 것입니다 sgRNA 표현 BFP + ve BFP ve 세포에 비해 세포의 상대적 감소 분석 결과, 과정 반면 sgRNAs luciferase 타겟팅, GFP 또는 비 필수적인 유전자 유지 BFP + ve/ve 비율 시간이 지남에.

2 별도 안티-RPA3 sgRNAs 사용 하 여, 우리 BFP의 비율에서 진보와 중요 한 감소를 관찰 + ve 셀에 비해 BFP-ve untransduced 대응. 반면, BFP 셀을 표현 하는 안티-AAVS1 sgRNA의 비율 남아 상대적으로 일정 시간이 지남에, AAVS1 타겟팅 하는 것이 (그림 4a) MOLM13 세포의 확산에 영향을 주지는 시연. 마찬가지로, 마우스 MLL AF9 Cas9 셀에 Rhodopsin (Rho1), 부정적인 컨트롤 및 Dot1l, 후 레 귤 레이 터 시간이 지남에 MLL AF9 백혈병 세포의 증식에 필요한 것으로 알려져 눈 색소 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs의 효과 테스트 . 이 연구, BFP + ve 마우스 MLL AF9 Cas9 셀 2 별도 안티-DOT1L sgRNAs로 불리고 BFP ve 비 불리고 sgRNA 셀 (그림 4b)에 비해 시간이 지남에 극적이 고 진보적인 손실을 보였다. 반면, 안티 Rho1 sgRNA의 비율 유지 시간이 지남에 상대적으로 변경 되지 않습니다. 이러한 결과 MLL-AF9 Dot1l 소모 마우스 백혈병 세포를 표현, 이전에 게시 결과 확인의 취약점을 보여 줍니다.

그림 1: 대표 서쪽 오 점 결과 보여주는 다른 Cas9 수준. CAS9로 불리고 MOLM13 AML 셀 라인의 단일 세포 클론 플래그 Cas9 식 레벨 안티 플래그 항 체를 사용 하 여 조사 했다. 클론 Cas9의 가장 높은 표현을 보여주는 추가 연구에 대 한 선정 됐다. HEK293 T 세포는 플라스 미드 식 부정적인 컨트롤로 긍정적인 제어 및 Cas9 비 불리고 MOLM13 셀으로 사용 되었다 Cas9와 페. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 얼음 분석 평가 Dot1l 소재 시에 편집 하는 게놈의 대표적인 분석. Dot1l sgRNA 대상 사이트를 중심으로 PCR amplicon 생어 시퀀싱 및 얼음 분석을 사용 하 여 분석 했다. -타겟 DNA 순서 (녹색 선)을 sgDot1l 시퀀스 (오렌지 라인)의 비교 편집 sgRNA 대상 사이트 sgDot1l 대상 셀에 효율성의 높은 수준을 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: 제안 된 방법의 도식 워크플로. sgRNAs 공동 BFP 같은 형광 단백질을 표현 하는 sgRNA 식 벡터에 복제 됩니다. 대상 셀 30-60% 변환 속도에서 불리고 있으며-cytometry 매 2-3 일 뒤. 급성 골수성 백혈병 세포 증식에 필요한 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs 같이 시간이 지남에 상대적 소모를 보여줄 것 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 인간의 경쟁 분석 및 마우스 급성 골수성 백혈병 세포에서 유래한 다 대표. (한) 결과 감소 RPA3 MOLM13 Cas9 클론 b 3 셀을 불리고 통계적으로 매우 중요 한 진보를 보여 줍니다. 대조적으로, sgRNAs AAVS1 사이트를 대상으로 아무런 영향을 미치지가 있다. (b) sgRNAs Dot1l를 대상으로 sgRNAs Rhodopsin (Rho)를 대상으로 달리 경쟁 확산에 놀라운 및 진보적인 감소를 표시 합니다. p > 0.05입니다. p < 0.05입니다. 오차 막대 (SD)의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 프로토콜의 일반적인 개요. (한) Cas9 바이러스와 sgRNA 복제 설명의 생산에 각 단계를 위한 시간. 안정적인 Cas9 식으로 AML 셀 라인의 단일 클론을 생성 하는 동안 디자인 및 sgRNAs의 복제를 수행할 수 있습니다. (b) 일반 프로토콜 AML 셀 라인 sgRNAs와 경쟁 성장 분석 결과 FACS를 사용 하 여 변환에 대 한 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: Genomic DNA에서 AAVS1 로커 스 확대를 위한 PCR 프로그램. PCR 프로그램 AAVS1 로커 스 클론 표현 Cas9에서 Cas9의 테스트 절단 효율성에 대 한 genomic DNA에서 증폭에 사용.

보조 파일: sgRNA 올리고 시퀀스. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

이 원고에서 우리는 AML 셀 라인-cytometry 인간/murine 급성 골수성 백혈병 세포 (그림 5)에서 사용 하 여 후보 유전자의 역할을 조사 하는 CRISPR-Cas9-기반 경쟁 성장 분석 결과 실시 하기 위한 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 분석 결과의 목표는 급성 골수성 백혈병 세포 증식의 유지 보수에 유전자 삭제의 효과 매체 처리량 규모에 2 ~ 3 주 이상입니다. 몇 가지 중요 한 단계 설명된 프로토콜 확장을 촉진 하기 위하여 신중 하 게 지켜질 필요가 있다. Cas9 lentivirus의 생산, 그것은 바이러스 조절 매체 carryover 293T 세포 상쾌한 포함 된 바이러스를 피하기 위해 0.45 μ M 필터를 통해 필터링 하는 데 필요한. Spinfection, 동안 집착 포장 또는 parafilm spinfection 접시 포장 원심 분리 동안 잠재적인 오염을 방지할 수 있습니다. 그러나, 포장은 조직 문화 인큐베이터에서 다시 spinfected 접시를 배치 하기 전에 제거 되어야 한다. 그것은 매우 Cas9 표현 클론 편집 효율성을 평가 하는 것이 중요입니다. 낮은-게놈 편집 효율 클론 부적당 한 Cas9 활동을 반영 하 고 실험의 성공률에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 실험에서 우리는 먼저 인간의 AML Cas9 클론 AAVS1 로커 스를 대상으로 하는 sgRNAs로 불리고 하 고 효율을 편집 하기 위해 그들의 게놈 DNAs를 시퀀스. 편집 AAVS1의 비교 및 wildtype 시퀀스는 조 수⁸ (https://www.deskgen.com/landing/tide.html) 또는 아이스 (https://ice.synthego.com/#/) 등 온라인 웹 기반 도구를 사용 하 여 평가 될 수 있다. 이러한 프로그램 생어 잠재적으로 편집 된 PCR의 시퀀스 추적 편집 되지 않은 wildtype 또는 참조 순서에 그리고 변화의 주파수 견적 비교. 이것은 mutational 변화에 대 한 가져온 테스트 sgRNA 세포질 Cas9 활동의 측정은 평가의 급속 한 방법. 또는, PCR의 복제 제품 PCR 클로닝 플라스 미드에 TOPO 클로닝 벡터 무딘 수행할 수 있습니다, 같은 다음 생어 시퀀싱을 각 클론의 시퀀스 정렬에 의해 게놈 편집 효율성을 평가 하기 위해 개별 식민지의는 와일드-형식입니다. 우리는 그것의 용이성과 비용 효율성 복제 방법에 비해 주어진 전 방법 선호. 일반적으로, 기본적인 쌍의 발견 지점 돌연변이, indels, 등변경., 또는 sgRNA 절단 사이트의 대다수에서 시퀀스 클론 매우 활성 Cas9의 존재를 나타냅니다. 따라서, 우리는 MOLM13 또는 MLL AF9 백혈병 클론 b 3과 8, 각각, 더 실험에 대 한 높은 편집 효율으로 선택 했다.

우리는 sgRNAs http://crispr.mit.edu/, sgRNAs의 목록을 제공 하는 웹 기반 소프트웨어를 사용 하 여 프로토콜에서 언급 하는 다른 유전자를 대상으로 설계. 그 예측된 대상 오프 효과 제거 하려면 목록에서 최고 점수 sgRNAs를 선택 하는 것이 좋습니다. 설계 된 sgRNAs 같은 (http://www.addgene.org/67974/) 웹사이트에 게시 된 프로토콜 중 하나를 사용 하 여 복제 될 수 있습니다. 감각과 antisense oligos 먼저 phosphorylated 고 2.1.5 단계에 의하여 단련. 37 ° C에서 첫 번째 단계는 phosphorylating T4 키와 oligos에 대 한 중요 고 후속 PCR 주기 dsDNA에 의미와 반대로 감각 oligonucleotides의 어 닐 링을 위해 중요 하다. 경쟁 분석 실험의 뒷부분에 나오는 불리고 sgRNA 셀을 추적 하기 위한 중요 한 sgRNA 클로닝 벡터에는 형광 단백질을 중요 하다. sgRNA 복제 어 닐 링 및 결 찰 등 모든 단계에서 96 잘 접시의 사용과 스케일 됩니다. 결 찰, 깨끗 한 PCR microtube 스트립 수 있습니다 또한 사용 이후 그들은 멀티 채널 펫와 호환. SgRNA 클론의 더 큰 세트의 변화 필요, 유능한 세포의 어느 10 μ에 96 잘 접시는 각 잘에서 사전 aliquoted 경우에-80 ° C에서 냉동 전체 프로세스를 신속 하 게 사용할 수 있습니다. 도금 결 찰 반응의 목적은 개별 식민지를 선택 하는 96-잘 형식에서 수행 하기 어려운. 따라서, 세균의 변화를 위한가 약간의 확장성입니다. 그래도, 전체 96 잘 접시에서 변환 반응의 도금에도 그것만 전체 프로젝트에 대 한 16 6 잘 플레이트의 총이 필요 합니다. 하나는 변환 플레이트에서 식민지를 따기의 다음 단계에서 조심. 질주 하는 동안 이라는 자리에 식민지 자리 명확 하 게 다른 장소에서 격리 된 있는지 확인 합니다. 어두운 영구 표시와 함께 표시 하는 페 트리 접시의 바닥에 사각형 그리드 세균성 복제품의 교차 오염을 방지할 수 있습니다.

SgRNA 구문 minipreps 준비 되 면, 96-잘 형태로 바이러스를 만들 수 있습니다. 처리량의이 수준, 그것은 상쾌한을 포함 하는 바이러스의 200 µ L 필터링 하입니다. 따라서, 바이러스 상쾌한은 상쾌한에 월 293T 셀에서 교차 오염을 피하기 위하여 적어도 하룻밤 냉동 한다. 그것은 또한 저장 될 수 있다 살 균 PCR 튜브에 50 µ L aliquots에을 피하기 위해 스트립은 상쾌한의 재개 동결. 또한, 이러한 바이러스 단련 supernatants AML 셀 시험 사용 됩니다. 경우에 그의 titers 낮은 바이러스 성 변환 관찰 된다, 셀, BFP + ve의 낮은 주파수에 의해 평가 다음 바이러스 titer 감염 (MOI) 40-60%를 위해의 다른 다양성에서 테스트 transductions를 결정 하는 것이 중요 있을 수 있습니다. 변환 속도입니다. 바이러스 titer 결정과 나 계산 설명에 자세히 여기¹⁷. 경쟁 분석 결과, 프로토콜의 3 단계에서에서 설명한 대로 그것이 매우 비 BFP 비율 BFP 분석 하는 동안 자동 형광에서 가짜 유물을 방지 하기 위해 비 실행 가능한 세포를 제외 하는 것이 중요. 테스트 샘플을 분석 하기 전에 FACS, 시 BFP 부정 및 BFP 긍정적인 컨트롤의 사용이 좋습니다 정확 하 게 전압을 설정 하. 각 다시 도금 시간이 시점에서 다시 도금 될 셀의 볼륨에서 주어진된 시간 포인트 셀의 농도에 따라 달라 집니다. 우리가 일반적으로 다시 도금 총 200 μ에서에서 20 μ 각 시간 점에서 신선한 잘으로 신선한 매체의 180 μ와. 부드럽게 아래로 다시 도금 직전 pipetting으로 셀의 철저 한 혼합이 좋습니다. 일반적으로, 우리는 분석 결과를 15-20 일 동안 실시 될 필요가 관찰 강한 통지 변경 BFP + ve/ve 비율,이 유전자에서 유전자를 변화 하더라도.

이 실험 설정은 생존에 후보 유전자의 역할 또는 급성 골수성 백혈병 세포의 확산을 신속 하 게 식별 하는 여러 AML 셀 라인에서 동시에 여러 가지 유전자 테스트에 적합 합니다. 여기에서 설명한 경쟁 확산 분석 결과의 하나 주의할 그 그것은 고려 하지 않습니다 같은 내 비 타겟 세포 인구에 영향을 미칠 수 있는 유전자를 대상 세포에서 이벤트 신호 paracrine 같은 잠재적인 셀 외부 요인 잘 이다. 비록이 드문 될 수도,이 분석 결과 할 때이 요소가 마음에 부담 한다. 비록 우리가 한 예로 AML 사용이 원고에 설명 된 CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험에 대 한이 방법을 사용할 수 있습니다 어떤 암 세포 라인 병렬로 여러 유전자의 역할을 확인 하. 유전자 삭제의 다양 한 이점이 있다 유전자 최저 이상 CRISPR-Cas9를 사용 하 여 간섭 RNA를 사용 하 여. 첫째, 일반적으로 광범위 한 대상 mRNA 금지 표시, shRNAs 달리 sgRNAs Cas9 nuclease 함께 대상 유전자의 완전 한 녹아웃 유효. 이 CRISPR-Cas9-기반 방법, 비록 개인 sgRNAs shRNAs의 대상 효율성 광범위 하 게 달라질 수 있습니다 경고 합니다 더 극적이 고 일관 된 고기에 발생할 수 있습니다.

교류 cytometry-기반 경쟁 분석 결과 셀의 고정된 수는 유전자 불안정 셀의 상대적인 증식 활동을 측정 하 도금 전통적인 확산 분석 실험을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. 장점 중 하나는 세포의 상대 증식 활동 측정 될 수 있다 쉽고 빠르게-cytometry에 의해 몇 일 동안 모든 도금 단계에서 계산 하는 셀에 대 한 필요성을 우회입니다. 이 성가신와 부정확성으로 이어질 수 있습니다 많은 후보 sgRNAs 우물의 모든 계산으로 여러 유전자를 대상으로 테스트 하는 경우에 유용 합니다. 와 달리, 세포 성장에 대 한 분석 실험 ATP-기반 측정, cytometry이 메서드는 장기 분석에 대 한 유용한 라이브 셀의 샘플링에 수행할 수 있습니다. 이 epigenetic 변조기, 급성 골수성 백혈병 세포의 증식에 늦은 연기 효과 보여줄 수 있으며 장기 분석 실험 필요할 수 있습니다 같은 요인의 연구에 특히 도움이 됩니다. 둘째, 같은 내 비 불리고 세포의 존재는 잘 분석 결과 대 한 초기 계획을 설정 하는 데 사용할 수 있는 잘 통제 세포 인구에 대 한 수 있습니다. 셋째, 96-잘 형식으로 분석 결과 설정 거의 완전히 다중 채널 펫을 사용 하 여 수행할 수 있습니다 때 실질적으로 속도를 전체 프로세스 sgRNAs 바이러스 준비 및 결국의 흐름-cytometric 평가의 복제에서 형광입니다.

여기 설명 하는 방법을 효율적으로 수직 기준점과 화면에 동시에 최대 96 sgRNAs의 조사에 대 한 수 있습니다. 유전자 당 4-6 sgRNAs 가정,이 방법은 따라서 사용할 수 있습니다 동시에 적어도 16-24 유전자의 급속 한 심문을 위해. 급성 골수성 백혈병 세포에 심문 하는 전체 분자 경로 같은 유전자의 큰 숫자의 경우 풀링된 CRISPR-Cas9-기반 화면 더 유용할 것 이다.

A.J.D는 A2A 제약 (뉴저지) 및 Salgomed 치료제 (샌디에고) 컨설턴트 이다. 다른 작성자 선언 충돌이 없는 있어야 합니다.

PCW Cas9 플라스 미드 에릭 랜더 & 데이비드 사바 티 니 (Addgene 플라스 미드 # 50661)와 pKLV2-U6gRNA5 (BbsI)-PGKpuro2ABFP-에서 선물 했다 な 연구소 (Addgene 플라스 미드 # 67974에서에서 플라스 미드 W. 우리에 대 한 적시 흐름 분석 및 정렬 SBP 의료 디스커버리 연구소에서 Cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 우리 인정 서에 레이디 타 타 기념 재단의 지원 하 고 싶습니다. 우리는 다음 자금 출처의 지원 인정 하 고 싶습니다: NIH/NCI P30 CA030199 암 센터 후원 그랜트, V-기초와 샌디에고 NCI 암 센터 (C3) #PTC2017to A.J.D.