Dize birleştirme gRNA için özelleştirilebilir bir protokol klonlama (STAgR)

Burada, dize derleme gRNA (STAgR), klonlama mevcut CRISPR/Cas9 yaklaşıyor kolayca gRNA vektörler multiplex için bir yöntem. STAgR basit, etkili ve özelleştirilebilir gRNA çoğullama yapar.

Bakteriyel CRISPR/Cas9 sistem metodolojik seçenekleri yaşam bilim adamları için önemli ölçüde artmıştır. Onun kullanımı nedeniyle, genetik ve genomik mühendisliği sistemlerinin büyük bir aralığı için geçerli oldu. Ayrıca, birçok transkripsiyon ve epigenomic mühendislik yaklaşımlar şimdi genellikle mümkün ilk kez. CRISPR geniş uygulanabilirliği için bir neden önerebilirim, doğa yatıyor. Küçük gRNAs kompleks genomik hedefleri, protein Cas9 türevleri ve yerel moleküler sonuçları belirler. Ancak, pek çok CRISPR yaklaşım birden fazla gRNAs aynı anda teslim tek tek hücrelere göre değişir. Burada, biz dize derleme gRNA (STAgR) klonlama için özelleştirilebilir bir iletişim kuralı mevcut, çoğaltılmış gRNA basit, hızlı ve verimli nesil ifade vektörel çizimler içinde bir tek klonlama sağlayan bir yöntem adım. STAgR düşük maliyetli, çünkü gRNA ifade kaset uzun DNA şablonlar birden çok kez yeniden kullanılmış olabileceği gibi (Bu protokol için) bireysel hedefleme dizileri kısa çıkıntı astar tarafından tanıtıldı. Ayrıca, STAgR gRNAs, çok sayıda yanı sıra farklı gRNA türevleri, vektörel çizimler ve organizatör kombinasyonları tek adım birleşme olanak sağlar.

Dize birleştirme gRNA (STAgR) klonlama kaset bir tek klonlama içinde adım birden çok gRNA ifade içeren ifade vektörlerin verimli gecede üretimi sağlayan bir yöntemdir. STAgR protokol sorumlusu uzmanlık veya malzeme üzerinde bağlı değildir ve özelleştirme için birden çok seçenek sunuyor.

Bakteriyel CRISPR protein Cas9 benzersiz bir kapasitesi vardır. Bulmak ve seçmeli olarak sadece doğal olarak meydana gelen crRNAs veya mühendislik gRNAs¹kodlanmış DNA dizileri bağlamak yapabiliyor. Onun kullanımı moleküler bir araç olarak çok sayıda imkansız, olanaksız yaklaşımlar veya belirli hücresel modellere yakın zamana kadar sadece sınırlı sağlamıştır. Bunlar, hedeflenen gen mutasyonlar², genom mühendislik³,^4,5,6, transkripsiyon harekete geçirmek ve^7,8susturmak gen düzenleme epigenome içerir. CRISPR evrensel konuşlandırılabilir, uygulama raporları bildiğim kadarıyla geniş hedef siteleri, hücre tipleri ve türler için adlı biri yok. Ancak, birçok CRISPR uygulama genomik manipülasyonlar (translokasyonlar^9,10,¹¹ orta ve büyük ölçekli genomik değişiklikler bir dizi de dahil olmak üzere birden çok gRNAs teslimde doğrudan veya dolaylı olarak bağlı ^{12 , 13}), genom mühendislik (Cas9 nickases¹⁴kullanımı), koşullu allelleri^11,15 veya seri mutasyonlar¹⁶üretimi ve stratejileri¹⁷izleme. Ayrıca, birden çok hedefleme siteler değildir diğer yaklaşımlar için (transkripsiyon mühendislik¹⁸, epigenome mühendislik^19,20) kesinlikle zorunlu, ancak onlar sadece altında bu kez maksimum etkisi ulaşmak koşul.

Birkaç yararlı yöntem birden fazla gRNA ifade kaset^{21,22,23,24,25,26içeren gRNA vektörel çizimler oluşturmak için tarif var, 27}. Burada, onun sadelik birleşimindeki outstanding ve (sadece bir gecede klonlama adım gereklidir) hız, düşük mal (DNA şablonlar birden çok kez yeniden kullanılabilir gibi), bir protokol STAgR, klonlama, dize derleme gRNA için mevcut customizability (için farklı gRNA sistemleri ve rehberleri) ve etkinliği (, gRNA kaset sayısının fazlalığı içeren vektörel çizimler nesil sağlar)²⁸.

STAgR prensip olarak ifade vektörler kaç (1-2 gRNAs) ile oluşturmak için kullanılabilir, birkaç (3-5 gRNAs) ve bazı ifade kaset en yüksek sayısı (6-8 gRNAs)²⁸defa bildirdi. Benzer şekilde, STAgR herhangi bir gRNA sıra, omurga veya organizatörü için geçerlidir. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) ve Gibson derleme STAgR esas olarak ancak, dayalı olduğundan, gRNAs yüksek sıra benzerlikler ile alternatif bir yöntem kullanarak oluşturulan.

1. strateji klonlama STAgR tasarımını

1. Kaç gRNA kaset bir ifade vektör ve hangi sırada dahil olacağına karar verin. Hangi rehberleri ve gRNA belirlemek iskele her gRNAs için kullanılmalıdır. GRNAs herhangi bir çevrimiçi araç (Örneğin, www.benchling.com) kullanarak tasarlayın.

2. astar ile çıkıntılar klonlama STAgR tasarımını

Not: Son gRNA anlamda protospacer dizisi ve ilk gRNA antisens sırasıyla eklenir vektör omurga (Şekil 1) amplifikasyon için kullanılan PCR astar. Kalan dizileri böylece anlam ve istenen sırada antianlamlı gRNAs ekleme dizeleri, güçlendirilmiş. İlk dize parça ilk gRNA bir çıkıntı olarak N20 serisi içeren bir ileri astar ve ikinci gRNA N20 serisi (geriye doğru tamamlayıcı) olarak bir çıkıntı ile ters bir astar ile güçlendirilmiş. Aşağıdaki parça buna göre oluşturulur.

1. N20 gRNA dizileri ileri amplifikasyon astar (Tablo 1) sarkma gibi STAgR DNA dizesi için ekleyin. Anlamda gRNA dizileri 5' (için geleneksel bir iskele) ileri astar "scf-FP" veya "sam-FP" (için bir MS2 içeren iskele) ekleyin. FP astar ilgili STAgR dize (Şekil 1) iskele/MS2 parçası tavlamak.
2. Geriye doğru tamamlayıcı N20 gRNA sıra ters astar serileri ekleyin. RP astar belirli rehberleri ve kullanılan Dizgiler (hU6-RP, RP mU6, 7sK-RP, H1-RP) bağlı olarak seçin.

3. nesil STAgR parçaları klonlama

1. PCR Gibson derleme için bireysel klonlama parçaları üretmek için yüksek sadakat (HF) arabellek, 10 mM dNTPs 1 µL, 0,25 µL çıkıntı-astar (100 µM), 10 10 µL kadar ayarlayarak gerçekleştirmek şablonu (dize veya vektör), 0,5 µL DNA HF polimeraz ng , Dimetil sülfoksit (DMSO) 1,5 µL ve son hacmi 50 µL yapmak için H₂O ekleyin.
   Not: SAM Scaffold seçilirse plazmid "STAgR_Neo" bir şablon olarak omurga PCR için son gRNA için gRNA iskele dahil kullanmak için "STAgR_SAM" kullanın. STAgR plazmid ile altı gRNA kasetler için örneğin, altı PCR DNA ile beş şablonları ve şablon olarak vektör omurga ile dizeleri gereklidir.
2. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 98 ° C 1 döngüsü için 1 dk 30 sn; 38 98 ° C devredir 10 s, (için gRNA iskele) 59 ° C / 68 ° C (SAM döngü) 10 s, 30 72 ° C s (için ekler) / 1 dk 30 s (için vektörel çizimler); 1 çevriminde 10 dk 72 ° c.
3. 5.5 µL PCR reaksiyon gelen kaldırmak, yükleme boya eklemek ve % 1'özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Yük (100 bp DNA merdiven/1 kb DNA merdiven) işlemi ve Çalıştır uygun jel çalışan bir jel için uygun bir DNA merdiven arabellek (Örneğin, TLE arabellek) 120 V 30 dk için.
4. Jel çalışırken, Restriksiyon enzimi ve 0.5 µL ile sağlanan arabellek 5 µL eklemek Dpnkalan 44,5 µL PCR reaksiyon için ben (10 adet) ve 1 h 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
5. DNA arıtma manyetik boncuklar kullanarak gerçekleştirin.
   1. 1 µL PCR ürününün başına 1.8 µL manyetik boncuklar ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. (RT) Oda sıcaklığında 2 min için kuluçkaya.
   2. Boncuk ve DNA parçalarının bir mıknatıs ile kalan sıvı ayırmak. Boncuk % 70 etanol ile iki kez tamamen resuspending olmadan Pelet durulama ile yıkayın.
   3. Bir pipet ile tüm etanol çıkarın ve kuru Pelet hava girsin.
   4. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından 15-20 µL H₂O Pelet dağıtılması ve boncuk sıvıdan bir mıknatıs kullanarak ayırın. Açık süpernatant için yeni bir tüp aktarın.
      Not: Alternatif olarak, sütunlara göre tepki temizlik kitleri kullanılabilir.
6. Başka bir yerde²⁹açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek.

4. Gibson derleme tepki ve bakteriyel dönüştürme

Not: Aşağıdaki adımları Gibson ve ark. adapte olmuşlardır ³⁰.

1. Reaksiyon karıştırın ya da ticari bir Gibson klonlama setini kullanın ev yapımı bir Gibson hazırlayın.
   1. 3 mL 1 M Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethane) birleştirmek-HCl pH 7.5, 1 M MgCl, 100 mM dGTP (deoxyguanosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dATP (deoxyadenosine trifosfat) 60 µL, 100 mM dTTP (deoxythymidine trifosfat) 60 µL, 100 mM dCTP (60 µL 300 µL deoxycytidine trifosfat), 300 µL 1 m DTT (dithiothreitol), PEG-8000 (Polietilen glikol), 300 µL (Nikotinamid adenin dinükleotit) 100 mm NAD 1.5 g ve 6 mL 5 × izotermal tepki arabelleği elde etmek için H₂O ekleyin.
      Not: Bölünmemeli arabellek-20 ° C'de en az 12 ay süreyle saklanabilir.
   2. Gibson derleme master için mix, 5 x izotermal tepki arabelleği 320 µL H₂O 697 µL ile birleştirmek ve 10 U/µL T5 eksonükleaz 3 µL, 2 U/µL DNA polimeraz 20 µL ve 40 U/µL Taq DNA ligaz 160 µL ekleyin.
      Not: Bu karışımı bölünmemeli ve saklı-20 ° C'de en az 12 ay için olabilir.
2. Derleme ana Mix 7.5 µL Ekle ve vektör 2.5 µL ile kullanın. 2 x STAgR reaksiyon için molar vektör oranı 1:1 ama fazla 0.2 pmol DNA'ın toplam eklemek için kullanın. 2'den fazla gRNA ifade kaset, bir vektör oranı 1:3 eklemek için kullanın ama 0.5 pmol toplam DNA miktarı fazla olamaz.
   Not: Tüm güçlendirilmiş gRNA ifade kaset ekimolar miktarlarda kullanılması gerekir. Plazmid denetim vektör ama sindirilmemiş şablon vektör (ve/veya kendi kendine ligasyonu) için denetim yok ekler aynı miktarda içerir.
3. Örnekleri buz üzerinde 45-60 dk. mağaza örnekleri için 50 ° C'de veya sonraki dönüşüm-20 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Protokol burada duraklatılmış.
4. Doğrudan karışımı yarısını kimyasal olarak yetkili bakteri dönüşümü.
   1. Kimyasal olarak yetkili TOP10 E. coli bakteri buz çözme.
   2. Gibson karışımı 5 µL yetkili bakterilerin 50 µL ekleyin. Tüp alt flicking tarafından karışımı yavaşça. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
   3. Isı şok tüpü 42 ° C su banyosu ya da 45 için bir ısı blok yerleştirerek gerçekleştirmek s.
   4. Tüpler geri buza koy. SOC orta 250 µL bakteri için eklemek ve onları titreyen bir kuluçka 30-45 dk 37 ° C'de kurtarmak.
5. Sonra kurtarma, dönüştürülmüş bakteri % 1.5 lysogeny suyu (LB) ağar kaplamalar ampisilin içeren üzerine plaka (100 µg / mL) ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya

5. STAgR klonlar bakteriyel koloni PCR tarafından seçilmesi

1. 200 µL PCR reaksiyon tüpler (3 ila 24) en az iki takım da aynı şekilde etiketlenir her yapı için hazır olun.
2. Bir set ile 100 µL LB orta 100 µg içeren dolgu / mL ampisilin.
3. Bir bakteriyel koloninin biyolojik malzeme kapalı scratch için steril pipet ucu kullanın ve boş 100 µL PCR reaksiyon tüp alt kısmında yayıldı. Hemen ucunu LB orta içeren ikinci karşılık gelen tepki tüp aktarın.
4. İpucu çevresinde bazı bakteri LB medyaya transfer edilir ve daha sonra kullanmak için 37 ° C'de kuluçkaya emin olmak için yavaşça girdap.
5. PCR ana mix (reaksiyon başına 10 µL) ayarlayın.
   1. 10, birleştirmek 10 µL Taq tampon, 2 µL 10 mM dNTPs, astar (100 µM), Taq polimeraz 0.5 µL 0.5 µL ve H₂O 100 µL bir birime ekleyin.
   2. Aşağıdaki astar kullanın: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
6. Etiketli PCR reaksiyon tüpler LB ortamı olmadan 10 µL PCR ana karışımı ekleyin.
7. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir thermocycler reaksiyonlar kuluçkaya: 1 döngüsü 38 94 ° C devredir 30 94 ° C 5 min için s, 30 55 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 1 çevriminde 10 dk 72 ° c.
   Not: Uzama süresi (72 ° C adım) gRNA ifade kaset sayısı artırılmalıdır. Tablo 2 kullanarak ekler teorik boyutunu hesaplamak ve 1 kb başına 1 dk 72 ° C'de kullanın
8. Yükleme boya ekleyin ve % 1'özel jel güçlendirilmiş parçaları analiz. Boyutlandırma için uygun bir DNA merdiveni yük (1kb DNA merdiven) ve 120 V 30 dk için arabellek (Örneğin, TLE arabellek) çalıştıran içinde uygun jel çalıştırın.
9. Amplicon teorik boyutu Tablo 2 yardımı ile kullanılan rehberleri, gRNA iskele ve N20 sıraların sayısını bireysel boyutları kadar ekleyerek hesaplar. PCR koloninin sonuçlarından, doğru Grup boyutu ve bunların doğru vektörel çizimler liman olasılığı olup göre bakteriyel klonlar tanımlayın.
10. 2,5 mL gecede LB Kültür (ile 100 µg/mL ampisilin) daha önceden ayarladığı karşılık gelen 100 µL kültür ile aşılamak. 12 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
11. Plazmid DNA bir ticari plazmid mini kit ve üreticisinin yönergeleri³¹kullanarak ayıklayın.
12. Aşağıdaki primerler kullanılarak plazmid dizi: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) ve StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) tarafından Sanger sıralama.

Eldeki protokol sonrası özelleştirilmiş çoğullama gRNA vektörler uygulanabilir (Şekil 1) üretimi yapar. Altı farklı gRNA kaset kullanarak STAgR yaklaşımların temsilcisi sonuçları Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Resim 2 A STAgR adet (3.1-3.3 iletişim kuralı) elde etmek için kullanılan PCR tipik bir sonucu gösterir. Altı amplicons (BB, S1-S5) amaçları bireysel gRNA N20 dizileri içeren doğrusal DNA parçaları temsil eder. Plazmid omurga (BB) şimdi gRNA1 ve gRNA6 hedefleme dizileri ile genişletilir ve bu nedenle iki diğer PCR (S1 ve S5) Gibson derleme (Şekil 2A, Tablo 3) için için gerekli örtüşmelere sahip olur. Arıtma sonra en az 1 µg vektörel çizimler ve ekler için bir DNA verim elde edilebilir.

Sonra Gibson derleme, bakteriyel dönüştürme 100-700 bakteriyel kolonilerde sonuçlanmalıdır. Resim 2 B koloni PCR, altı gRNA kasetler ile STAgR protokol sonrası üzerinden 10 bakteri kolonileri temsil edici bir analizini gösterir. Jel Elektroforez üç klonlar göstermek belgili tanımlık beklenen amplicon büyüklük için tam derleme (Tablo 2) gösterir. Bir klon (Şekil 2B, No.18) boş ise diğer bir ile beş gRNA kasetler, içeren büyük olasılıkla alınan STAgR vektörler klonlar.

Resim 1 : STAgR astar tasarım bakış. İlk gRNA numarası ve iskele seçilmiş, sonra gRNA sipariş ve organizatörü ve son olarak, ne tür bir vektör kullanılması gereken vardır. Her gRNA için belirli bir ileri astar anlamda yönlendirme ve "sam-FP" ya da "scf-FP" ortak parçası sırayla hedefleme gRNA ile tasarlanmıştır. Benzer şekilde, bireysel ters astar karşılık gelen organizatörü sıra oluşturmak için (RP) sonraki gRNA N20 sırasını ters tamamlayıcı ile eritilmiş olan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Temsilcisi sonuçları altı farklı gRNA kaset kullanarak STAgR yaklaşımların. (A)bir ÇSYİ beş ekler hem de vektör STAgR_Tomato temsili örneği. 6 STAgR tepki hU6 ve mU6 rehberleri ve kurallı gRNA gibi SAM iskele kullanarak x (B) koloni PCR. 22 bakteri kolonileri analiz edildi, bunların tam derleme gösteren beklenen Grup 7 gösterdi. Merdiven: 1 kb birlikte, sayı baz çifti (bp) içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Astar dizileri gRNA iskele ve rehberleri için.

Tablo 2: Koloni PCR sonucu hesaplamak için her ifade kaset teorik boyutlarda.

Tablo 3: Organizatör ve iskele boyutlarda.

Tablo 4: STAgR adet PCR sonra hesaplanan boyutlarda.

Burada gRNA ifade plazmid büyüklü küçüklü hızlı ve basit nesil izin STAgR için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı için gRNA Plasmid'ler ile 2 – 8 gRNA ifade kaset (veya iki MS2 RNA aptamers olmadan), tek adımlı nesil gRNA ifade vektör STAgR_Neo ve insan U6, fare U6, insan 7sK ve insan H1 Rehberleri^{28 kullanımı içine kullanılabilir ,32,33}. Dörtten fazla kaset istenirse, bu verimliliği artırmak için en az iki farklı organizatörü/iskele türü kullanmak için tavsiye edilir. Başka vektörler, organizatör ve organizatörü kombinasyonları yanı sıra fazla 8 gRNA kasetler de mümkün olabilir; Ancak, bu test edilmemiştir. Her ne kadar Yöntem güvenilir ve tekrarlanarak çalışır deneyim, biz kritik adımlar belirlemiştir ve sorun giderme stratejileri beklenen sonucu hemen olmamalıdır. Deneyimlerimize göre bazı yaklaşım başarısı için çok önemli adımlardır: her şeyden önce vektör omurgasına ekler doğru molar oranları Gibson derleme adım (3:1) kullanılması önemlidir. Ancak, biz bile gRNA kaset numarası iki aştığında bazı gRNA setleri için ekler vektör 1:1 oranında yararlı olduğunu fark ettim. İkinci olarak, Gibson derleme tepki süresi yeterince uzun olmalıdır (en az 45 dk önerilir).

STAgR çok sayıda değişiklikleri ile istihdam edilebilir. Hedef sıraları, gRNA sayı ve iskele, organizatör ve vektör omurgalarına özelleştirilebilir ve serbestçe kombine. Ancak, her kombinasyon biraz farklı gereksinimleri olabilir. Bizim deneyim, orta veya yüksek sayıda gRNA kaset (> 4) istenen ama elde değil hemen, genellikle bireysel gRNA kaset vektör sırasını değiştirmek için bu sorunu aşmak için en hızlı yol olduğunu. Benzer şekilde, farklı gRNA rehberleri ve iskele birleştirerek daha etkili olmasını sağlar (ve böylece toplam zorunda koloni PCR gerekli sayıda düşürür) ne zaman birçok gRNA kasetler klonlanmış. Biz yanlış klonlar genellikle Gibson derleme sırasında yinelenen dizileri spontan birlikte tarafından oluşturulan bulundu. Her ne kadar bu yöntem verimliliğini azaltabilir, vektörel çizimler fonksiyonel gRNA alt kümeleri²⁸ile eşzamanlı nesil aynı zamanda sonuçlanır.

GRNA vektörel çizimler içeren birden fazla gRNA ifade kaset çoğullama nesil farklı yöntemler^{21,22,23,24,25bir dizi ile bildirilmiştir, 26,27}. Bazı aynı anda veya ardışık gRNA çiftleri^22,34klonlama istihdam ederken, diğerleri Golden Gate derleme ve birkaç sıralı klonlama adımları^25,35bağlıdır. Özel bir yaklaşım tarafından Xie vd., bir tek yaratıcı transkript³⁶dışarı birkaç gRNAs kesmek için endojen hücresel tRNA işleme sistemi istihdam ederek kullanılmıştır. Advangetage bu yöntemin yalnızca bir organizatörü gereksinimdir; Yeni sentezlenmiş DNA parçalarının ihtiyacını her gRNA kombinasyon dezavantajıdır. Her gRNA yöntemi çoğullama avantajları ve dezavantajları vardır; STAgR verimlilik, düşük maliyetle mümkün gRNA kaset sayısının yüksek sadeliği birleştirir.

STAgR (ve diğer çoğullama sistemleri) büyük olasılıkla zebra balığı beyin²⁸öncülük birden çok gen vivo, verimli (ve eşzamanlı) çalışmasının etkinleştirme vesile olacaktır. Başka bir gelecek gRNA çoğullama vektörel çizimler indüksiyon veya baskı tek gen aksine tam transkripsiyon programları manipülasyon için söz uygulamadır. Büyük olasılıkla, bu yaklaşımların dönüşüm hücre ve organların, bugün mümkün olduğundan çok daha yüksek bir dereceye kadar olacak izin verir.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yazarlar Prof. Dr. Stephan Beck ve Prof. Dr. Jovica Ninkovic giriş için teşekkür ederiz, yardım ve STAgR yöntemi gelişmekte olan destek istiyorum. Tobias Klötzer, Anna Köferle ve Valentin Baumann yararlı yorumlar için. İş DFG (STR 1385/1-1) tarafından desteklenmiştir.