Un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR)

Aquí, presentamos cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método para multiplexar fácilmente gRNA vectores para CRISPR/Cas9 enfoques. Fantasía STAgR hace gRNA multiplexación simple, eficiente y adaptable.

El sistema CRISPR/Cas9 bacteriano ha aumentado considerablemente las opciones metodológicas para que los científicos de la vida. Debido a su utilización, ingeniería genética y genómica hizo aplicable a una amplia gama de sistemas. Por otra parte, muchos transcripcional y epigenómica ingeniería enfoques ahora son generalmente factibles por primera vez. Una de las razones de la amplia aplicabilidad de CRISPR radica en su naturaleza bipartita. Pequeño gRNAs determinar los objetivos de la genómicos del complejo, variantes de la proteína Cas9 y las consecuencias moleculares locales. Sin embargo, muchos enfoques CRISPR dependen la entrega simultánea de múltiples gRNAs en células individuales. Aquí, presentamos un protocolo adaptable para cadena montaje gRNA clonación (fantasía STAgR), un método que permite la generación sencilla, rápida y eficiente de gRNA multiplexado vectores de expresión la clonación de un solo paso. Fantasía STAgR es rentable, ya que (en este protocolo) las secuencias de objetivos individuales son introducidas por cartillas de voladizo corto mientras que las plantillas de ADN largas de los cassettes de expresión gRNA pueden reutilizarse varias veces. Por otra parte, fantasía STAgR permite incorporación solo paso de un gran número de gRNAs, así como combinaciones de gRNA diferentes variantes, vectores y promotores.

Cadena montaje gRNA (fantasía STAgR) la clonación es un método eficiente la generación de vectores de expresión que contiene la expresión de gRNA varias cintas en una clonación solo paso. El protocolo de fantasía STAgR no depende de materiales o conocimientos especializados y ofrece múltiples opciones de personalización.

La proteína bacteriana de CRISPR Cas9 tiene una capacidad única. Es capaz de encontrar y atar selectivamente sólo las secuencias de ADN codificadas en crRNAs natural o gRNAs ingeniería¹. Su utilización como una herramienta molecular ha permitido un gran número de enfoques que eran imposible, inviable o limitada solamente a ciertos modelos celulares hasta hace poco. Se trata de mutaciones específicas del gen², ingeniería del genoma³, epigenoma edición^4,5,6, la activación transcripcional y^7,8el silenciamiento del gen. Por lo que sabemos que CRISPR es universalmente utilizable, como informes de su aplicación existe para una amplia gama de sitios de destino, especies y tipos celulares. Sin embargo, muchas aplicaciones de CRISPR dependen directa o indirectamente la entrega de múltiples gRNAs incluyendo una serie de manipulaciones genómicas (translocaciones^9,10, media¹¹ y alteraciones genómicas a gran escala ^{12 , 13}), ingeniería de genoma (uso de Cas9 nickases¹⁴), generación de alelos condicional^11,15 o¹⁶de la serie de mutaciones y trazar estrategias¹⁷. Por otra parte, para otros enfoques (transcripcional ingeniería¹⁸, epigenoma ingeniería^19,20) varios sitios apuntados no son estrictamente obligatorio, sin embargo alcanzan su máximo efecto a menudo solamente bajo esta condición.

Se han descrito varios métodos útiles para generar vectores de gRNA que contiene más de un gRNA expresión cassette^{21,22,23,24,25,26, 27}. Aquí, presentamos un protocolo de fantasía STAgR, cadena montaje gRNA clonación, que es excepcional en su combinación de simplicidad y velocidad (sólo una noche a la mañana paso clonación es necesario), bajo costo (como plantillas de la DNA pueden ser reutilizadas varias veces), personalización (para gRNA diferentes sistemas y promotores) y efectividad (permite la generación de vectores que contienen un número elevado de gRNA casetes)²⁸.

Fantasía STAgR puede en principio ser utilizado para generar vectores de expresión con pocos (1-2 gRNAs), varios (3 – 5 gRNAs) y algunos de la mayor cantidad de casetes de expresión registrados hasta ahora (6-8 gRNAs)²⁸. Del mismo modo, fantasía STAgR es aplicable para cualquier secuencia de gRNA, columna vertebral o promotor. Puesto que sin embargo, la fantasía STAgR se basa principalmente en reacciones en cadena de polimerasa (PCR) y Asamblea de Gibson, gRNAs con similitudes de secuencia alta deben generarse utilizando un método alternativo.

1. diseño de fantasía STAgR estrategia de clonación

1. Decidir en cuántos gRNA cassettes se incluirán en vector de una expresión y en qué orden. Determinar que promotores y gRNA andamios deben usarse para cada uno de los gRNAs. Diseño los gRNAs mediante cualquier herramienta en línea (por ejemplo, www.benchling.com).

2. diseño de fantasía STAgR clonación cartillas con voladizos

Nota: La secuencia de protospacer de sentido de la gRNA pasado y antisentido de la gRNA primer respectivamente se agregan a los cebadores PCR utilizados para la amplificación de la columna vertebral del vector (figura 1). Las secuencias restantes son amplificadas de las cadenas, de tal modo fijar el sentido y antisentido gRNAs en el orden deseado. La primera cadena pieza se amplifica con una cartilla hacia adelante con el gRNA primera secuencia N20 como una proyección y una cartilla reversa con el gRNA segunda secuencia N20 (complemento inverso) como un alero. Por consiguiente se generan las siguientes piezas.

1. Añadir secuencias de gRNA N20 a los cebadores de amplificación hacia adelante para la cadena de ADN de fantasía STAgR como voladizos (tabla 1). Añadir secuencias de gRNA sentido 5' al primer avance "scf-FP" (para un andamio convencional) o "sam-FP" (para un andamio con MS2). Cartillas FP se recuecen a la parte de andamio/MS2 de la respectiva cadena de fantasía STAgR (figura 1).
2. Agregar el complemento inverso N20 gRNA secuencia a las secuencias de la cartilla reversa. Elegir cebadores RP según los promotores específicos y cuerdas utilizados (hU6-RP, RP mU6, 7sK-RP, H1-RP).

3. generación de fantasía STAgR clonación de fragmentos

1. Para generar los fragmentos individuales de clonación para montaje de Gibson, realizar PCRs estableciendo 10 μl de tampón de alta fidelidad (HF), 1 μl de 10 mM dNTPs 0.25 μl de proyección-cartilla (100 μm), 10 ng de plantilla (cadena o vector), 0,5 μl HF polimerasa de la DNA , 1,5 μl de dimetilsulfóxido (DMSO) y H₂O para hacer un volumen final de 50 μl.
   Nota: Uso el plásmido "STAgR_Neo" como una plantilla para la columna vertebral PCR para incorporar el andamio gRNA a pasado gRNA, si SAM Scaffold es elegido, "STAgR_SAM". De un plásmido de fantasía STAgR con gRNA seis cassettes por ejemplo, seis PCRs son necesarios, que cinco con ADN cadenas como plantillas y uno con la columna vertebral de vector como plantilla.
2. Incubar las reacciones en un termociclador con las siguientes condiciones: 1 ciclo de 98 ° C por 1 min 30 s; 38 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 59 ° C (para andamio de gRNA) / 68 ° C (para el lazo de SAM) durante 10 s, 72 ° C por 30 s (para rellenos) / 1 min 30 s (de vectores); 1 ciclo de 72 ° C durante 10 minutos.
3. Saque 5.5 μl de la reacción de PCR, añadir colorante de carga y analizar los fragmentos amplificados en un gel de agarosa 1%. Carga una escalera de ADN adecuada para tamaño (100 bp ADN ladder/1 kb DNA ladder) y correr el gel en un funcionamiento adecuado del gel tampón (por ejemplo, buffer TLE) a 120 V durante 30 minutos.
4. Mientras el gel está en marcha, añadir 5 μl del tampón suministrado con la enzima de restricción y a 0,5 μl de DpnI (10 unidades) a la reacción de PCR de 44,5 μl restantes e incubar 30 min a 1 h a 37 ° C.
5. Realizar la purificación de ADN con Perlas magnéticas.
   1. Añadir granos magnéticos de 1,8 μl por 1 μl del producto de PCR y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente (RT).
   2. Separar los granos y fragmentos de ADN de líquido residual con un imán. Lavar granos dos veces con etanol al 70% lavando el precipitado sin resuspender completamente.
   3. Quite todo etanol con una pipeta y deje secar al aire de la pelotilla.
   4. Disolver la pastilla en 15 – 20 μl de H₂O mediante pipeteo arriba y abajo y separar los granos del líquido mediante un imán. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
      Nota: Alternativamente, kits de limpieza basado en la columna de reacción pueden ser utilizados.
6. Determinar las concentraciones de ADN utilizando un espectrofotómetro como se describe en otra parte²⁹.

4. Gibson Asamblea reacción y transformación bacteriana

Nota: Los siguientes pasos son adaptados de Gibson et al. ³⁰.

1. Preparar a un Gibson casero reacción de mezclar o utilizar un kit de clonación comercial de Gibson.
   1. Combinar 3 mL de 1 M Tris (Tris (hidroximetil) aminometano)-HCl a pH 7.5, 300 μL de MgCl M 1, 60 μL de 100 mM dGTP (trifosfato de desoxiguanosina), 60 μL de 100 mM de dATP (desoxiadenosina trifosfato), 60 μL de dTTP (deoxythymidine trifosfato) de 100 mM, 60 μL de (dCTP) 100 mM desoxicitidina trifosfato), 300 μL de 1 M DTT (Ditiotreitol), 1,5 g de PEG-8000 (polietilenglicol), 300 μL de 100 mM de NAD (nicotinamida adenina dinucleótido) y H₂O para obtener 6 mL de tampón de reacción isotérmico × 5.
      Nota: Buffer alícuotas puede almacenarse a-20 ° C durante al menos 12 meses.
   2. Para el maestro de la Asamblea de Gibson mezclar, combinar 320 μl de tampón de reacción isotérmica de 5 x con 697 μl de H₂O y agregar 3 μl de 10 U/μl T5 exonucleasa, 20 μl de 2 U/μl de ADN polimerasa y 160 μl de 40 U/μl Taq ADN ligasa.
      Nota: Esta mezcla puede ser alícuotas y almacenado a-20 ° C durante al menos 12 meses.
2. Utilizar 7,5 μl de la mezcla principal Asamblea con 2,5 μl de inserto y el vector. Para una reacción de x STAgR 2 utilizar un vector molar para insertar relación de 1:1 pero no más de 0,2 pmol de ADN total. Para más de 2 cassettes de expresión gRNA, utilizar un vector para insertar la relación de 1:3 pero no exceder una cantidad total de ADN de 0.5 pmol.
   Nota: Deben utilizarse cassettes de expresión amplificada gRNA todos en cantidades equimolares. Incluir un control plásmido con la idéntica cantidad de vectores pero no aros de control de vector de plantilla sin digerir (o uno mismo-ligadura).
3. Incubar las muestras a 50 ° C para las muestras de tienda de 45 a 60 minutos en hielo o a-20 ° C para la transformación posterior.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí.
4. Directamente la mitad de la mezcla de transformar bacterias químicamente competentes.
   1. Descongelar químicamente competentes TOP10 de e. coli las bacterias en el hielo.
   2. Añadir 5 μl de la mezcla de Gibson a 50 μl de bacterias competentes. Suavemente mezcle agitando el fondo del tubo. Incubar en hielo durante 30 minutos.
   3. Realizar un choque térmico, colocando el tubo en un baño de agua de 42 ° C o un bloque de calor para 45 s.
   4. Colocar los tubos en hielo. Añadir 250 μl de medio SOC a la bacteria y que recupera a 37 ° C en un incubador de agitación durante 30 – 45 minutos.
5. Después de la recuperación, la placa de las bacterias transformadas en placas de agar 1.5% Lisogenia caldo (LB) que contiene ampicilina (100 μg / mL) e incubar durante la noche a 37 ° C.

5. selección de Clones de fantasía STAgR por Colonia bacteriana PCR

1. Preparar al menos dos conjuntos de 200 μL PCR los tubos de reacción (entre 3 y 24) para cada construcción, que están marcados de manera idéntica.
2. Llenar un sistema con 100 μl de medio LB que contiene 100 μg / ampicilina mL.
3. Utilizar una pipeta estéril para raspar el material biológico de una colonia bacteriana y extenderlo en la parte inferior del tubo vacío de reacción de PCR de 100 μl. Transferir inmediatamente la punta al segundo tubo de reacción correspondiente que contiene el medio LB.
4. Girelo suavemente la punta alrededor de algunas de las bacterias se transfieren a los medios de comunicación LB y incuban a 37 ° C para su uso posterior.
5. Configurar una mezcla maestra de PCR (10 μl por reacción).
   1. Para las 10 reacciones, combinar 10 μl de tampón de Taq , 2 μl 10 mM dNTPs, 0.5 μl de cebador (100 μm), 0.5 μl de Taq polimerasa y agregar H₂O a un volumen de 100 μl.
   2. Utilice los siguientes primers: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
6. Añadir 10 μl de la mezcla principal de PCR a los tubos de reacción de PCR etiquetados sin los medios de comunicación LB.
7. Incubar las reacciones en un termociclador con las siguientes condiciones: 1 ciclo de 94 º C por 5 min, 38 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 1 ciclo de 72 ° C durante 10 minutos.
   Nota: Tiempo de elongación (paso de 72 ° C) debe aumentarse el número de casetes de expresión gRNA. Calcular tamaño teórico de insertos usando la tabla 2 y uso 1 minuto por 1 kb a 72 ° C.
8. Agregar colorante de carga y analizar los fragmentos amplificados en un gel de agarosa al 1%. Una escalera de ADN apropiada para el tamaño de la carga (1kb DNA Ladder) y ejecutar el gel adecuado en funcionamiento tampón (por ejemplo, TLE Buffer) 120 V durante 30 minutos.
9. Calcular el tamaño teórico de los productos con la ayuda de la tabla 2 sumando los tamaños individuales de promotores utilizados, gRNA andamios y número de secuencias de N20. De los resultados de la Colonia PCR, identificar los clones bacterianos basados en el tamaño correcto de la banda y que sean capaces de albergar vectores correcto.
10. Inocular una cultura 2,5 mL LB durante la noche (con ampicilina 100 en μg/mL) con la correspondiente cultura de 100 μl, configurada anteriormente. Incubar a 37 ° C durante 12 h.
11. Extraer DNA plasmídico utilizando un kit de mini plásmido comercial y de las instrucciones del fabricante³¹.
12. La secuencia de la plásmidos utilizando los siguientes cebadores: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) y StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) mediante la secuenciación de Sanger.

Siguiendo el protocolo a mano hace que la generación de modificado para requisitos particulares multiplexación gRNA vectores factibles (figura 1). Resultados representativos de fantasía STAgR enfoques utilizando seis casetes de gRNA diferentes están representados en la figura 2. Figura 2 A muestra un resultado típico de las PCRs para obtener las piezas de fantasía STAgR (protocolo 3.1-3.3). Los seis amplicones (BB, S1-S5) representan pedazos de ADN lineales que contienen las secuencias individuales gRNA N20 en sus extremos. La columna vertebral del plásmido (BB) se amplía ahora con las secuencias de objetivos de gRNA1 y gRNA6 y por lo tanto posee los solapes necesarios para dos otros PCRs (S1 y S5) para montaje de Gibson (figura 2A, tabla 3). Después de la purificación se logra un rendimiento de ADN de al menos 1 μg de vectores y los partes movibles.

Después del montaje de Gibson, transformación bacteriana debe resultar en colonias bacterianas de 100 a 700. Figura 2 B muestra un análisis representativo de colonias bacterianas 10 via Colonia PCR, siguiendo un protocolo de fantasía STAgR con seis casetes de gRNA. Electroforesis en gel indica que tres clones muestran el tamaño de amplicón esperado para el conjunto completo (tabla 2). Otros clones de vectores de fantasía STAgR probablemente recibidos que contienen cintas de gRNA de uno a cinco, mientras que un clon (figura 2B, No.18) está vacío.

Figura 1 : Resumen de fantasía STAgR primer diseño. Primera gRNA número y andamios son elegidos, entonces gRNA orden y promotor y último, debe utilizarse el tipo de vector. Para cada gRNA, se diseña un primer avance específico con el gRNA focalización secuencia en orientación de sentido y de la parte común de "scf-FP" o "sam-FP". Del mismo modo, para generar el primer revés individual la secuencia promotor correspondiente (RP) se fusiona con el complemento reverso de la secuencia N20 de la gRNA siguiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Resultados representativos de fantasía STAgR enfoques utilizando seis casetes de gRNA diferentes. (A) ejemplo de una PCR de cinco insertos, así como el vector de STAgR_Tomato. PCR de Colonia (B) de 6 x reacción de fantasía STAgR hU6 y mU6 promotores y gRNA canónica así como andamios de SAM. 22 colonias bacterianas fueron analizadas, que 7 mostraron la esperada banda indicando el conjunto completo. Escala: 1 kb plus, números en pares de bases (PB). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Secuencias de la cartilla de gRNA andamios y promotores.

Tabla 2: Tamaños teóricos de cada cassette de expresión para calcular el resultado PCR de Colonia.

Tabla 3: Tamaños de los promotores y andamios.

Tabla 4: Tamaños calculados de fantasía STAgR piezas después de la polimerización en cadena.

Aquí presentamos un protocolo detallado para fantasía STAgR permitiendo la generación rápida y sencilla de gRNA plásmidos de expresión de diferentes tamaños. Este protocolo puede ser utilizado para la generación de un solo paso de gRNA plásmidos con casetes de expresión de la gRNA 2 – 8 (con o sin dos ARN MS2 aptámeros) en el vector de expresión de gRNA STAgR_Neo y el uso de humano U6, U6 del ratón, 7sK humano y humana H1 promotores^{28 ,32,33}. Si se desean más de cuatro cintas, se recomienda utilizar al menos dos tipos diferentes de promotor/andamio para aumentar la eficiencia. Otros vectores, promotores y combinaciones promotor así como más de 8 casetes de gRNA podrían ser factibles sin embargo, esto no ha sido probado. Aunque en nuestra experiencia el método funciona de forma fiable y reproducible, hemos determinado los pasos críticos y estrategias de resolución de problemas el resultado esperado no inmediatamente ocurriera. En nuestra experiencia algunos pasos son fundamentales para el éxito de la estrategia: primero y principal, es importante utilizar las correcta relaciones molares de inserciones en la espina dorsal del vector en el paso de montaje de Gibson (3:1). Sin embargo, notamos que para algunos conjuntos de gRNA una relación 1:1 de inserciones a vector es beneficiosa, incluso cuando el número de cassettes de gRNA exceda de dos. En segundo lugar, el período de la reacción de la Asamblea de Gibson debe ser suficientemente largo (por lo menos 45 min recomendado).

Fantasía STAgR puede emplearse con una gran cantidad de modificaciones. Dirigidas a secuencias, gRNA números y andamios, promotores y redes troncales de vector se pueden personalizar y combinar libremente. Sin embargo, cada combinación puede tener requisitos un poco diferentes. En nuestra experiencia, si medio o alto número de cassettes de gRNA (> 4) son deseados pero no obtiene inmediatamente, generalmente la manera más rápida de resolver este problema es cambiar el orden de los cassettes de gRNA individuales en el vector. Del mismo modo, combinar la gRNA diferentes promotores y andamios mejora la eficiencia (y así disminuye el número de PCR de Colonia que se anotó) cuando se clonan muchos casetes de gRNA. Encontramos que clones incorrecta son generados generalmente por la conjunción espontánea de secuencias repetidas durante el montaje de Gibson. Aunque esto puede reducir la eficacia del método, esto también resulta en la generación simultánea de vectores con gRNA funcional subconjuntos²⁸.

Se ha reportado generación de multiplexación gRNA vectores que contienen más de un cassette de expresión gRNA con un número de diversos métodos^{21,22,23,24,25, 26,27}. Mientras que algunos emplean simultánea o secuencial de clonación de gRNA pares^22,34, otros dependen de ensambladura de la puerta de oro y varias secuencial clonación pasos^25,35. Un enfoque especial ha sido utilizado por Xie et al., empleando endógeno tRNA procesamiento sistema celular para cortar gRNAs varios de un solo progenitor transcripción³⁶. La advangetage de este método es la exigencia de un único promotor; el inconveniente es la necesidad de los fragmentos de DNA recién sintetizadas de cada combinación de gRNA. Cada gRNA multiplexación método tiene ventajas y desventajas; Fantasía STAgR combina simplicidad con la eficacia, alto número de cassettes de gRNA posible con bajo costo.

Fantasía STAgR (y otros sistemas de multiplexación) será fundamental para permitir la interrupción eficiente (y simultánea) de múltiples genes en vivo, como pionero en el pez cebra cerebros²⁸. Otra futura aplicación de gRNA vectores multiplexación es la promesa para la manipulación de programas completos transcripcionales en contraste con la inducción o represión de genes individuales. Probablemente, estos enfoques permitirá transformar las células y órganos en el va a un grado mucho mayor de lo que hoy es posible.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores quisieran gracias Prof. Dr. Stephan Beck y Prof. Dr. Jovica Ninkovic por sus aportes, ayuda y apoyo en el desarrollo del fantasía STAgR método. Tobias Klötzer, Anna Köferle y Valentin Baumann para comentarios. El trabajo ha sido apoyado por DFG (STR, 1385, 1-1).