Un protocollo personalizzabile per String Assembly gRNA clonazione (STAgR)

Qui, presentiamo la stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR), un metodo per multiplex facilmente gRNA vettori per CRISPR/Cas9 si avvicina. STAgR rende gRNA multiplexing semplice, efficiente e personalizzabile.

Il sistema CRISPR/Cas9 batterico è aumentato sostanzialmente opzioni metodologiche per gli scienziati di vita. Dovuta al suo utilizzo, ingegneria genetica e genomica è divenuto applicabile a una vasta gamma di sistemi. Inoltre, molti trascrizionale ed epigenomic ingegneria approcci sono generalmente fattibili ora per la prima volta. Uno dei motivi per l'ampia applicabilità di CRISPR sta nella sua natura bipartito. Piccolo gRNAs determinare il target genomici del complesso, varianti della proteina Cas9 e le conseguenze molecolari locali. Tuttavia, molti approcci CRISPR dipendono la consegna simultanea di più gRNAs nelle singole celle. Qui, presentiamo un protocollo personalizzabile per stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR), un metodo che consente la generazione semplice, veloce ed efficiente di multiplex gRNA vettori di espressione in una clonazione singolo passo. STAgR è conveniente, dal momento che (in questo protocollo) le singole sequenze di targeting sono introdotti da primer sbalzo corto, mentre i modelli di DNA lunghi delle cassette gRNA espressione possono essere riutilizzati più volte. Inoltre, STAgR permette singolo passo incorporazione di un gran numero di gRNAs, così come combinazioni di gRNA diverse varianti, vettori e promotori.

Stringa Assemblea gRNA clonazione (STAgR) è un metodo consentendo notturna efficiente generazione di vettori di espressione contenenti più espressione di gRNA cassette nella clonazione di un singolo passo. Il protocollo di STAgR non dipende dalla competenza specialistica o materiali e offre molteplici opzioni per la personalizzazione.

La proteina batterica CRISPR Cas9 ha una capacità unica. È in grado di trovare e legare selettivamente solo quelle sequenze di DNA codificati in crRNAs naturale o derivati dal gRNAs¹. Suo utilizzo come strumento molecolare ha permesso un gran numero di approcci che erano impossibili, irrealizzabile o solo limitato a determinati modelli cellulari fino a poco tempo. Questi includono le mutazioni di gene bersaglio², genoma ingegneria³, epigenome modifica^4,5,6, attivazione trascrizionale e il silenziamento genico^7,8. Per quanto sappiamo che CRISPR è universalmente dispiegabili, come rapporti della sua applicazione esiste per una vasta gamma di siti di destinazione, specie e tipi di cellule. Tuttavia, molte applicazioni CRISPR dipendono direttamente o indirettamente sulla consegna di gRNAs multiple, tra cui una serie di manipolazioni genomiche (traslocazioni^9,10, media¹¹ e alterazioni genomiche su larga scala ^{12 , 13}), ingegneria del genoma (uso di Cas9 nickases¹⁴), generazione di alleli condizionali^11,15 o mutazioni seriale¹⁶e tracciare strategie¹⁷. Inoltre, per altri approcci (trascrizionale ingegneria¹⁸epigenome ingegneria^19,20) sono più siti di destinazione non strettamente obbligatoria, tuttavia raggiungono la loro massimo effetto spesso soltanto sotto questo condizione.

Sono stati descritti diversi metodi utili per generare dei vettori-gRNA contenente più di una gRNA espressione cassetta^{21,22,23,24,25,26, 27}. Qui, presentiamo un protocollo per STAgR, stringa Assemblea gRNA clonazione, che è eccezionale nella sua combinazione di semplicità e velocità (solo un pernottamento clonazione passaggio è necessario), basso costo (come modelli del DNA possono essere riutilizzate più volte), possibilità di personalizzazione (per gRNA diversi sistemi e promotori) e l'efficacia (permette la generazione di vettori contenenti un numero elevato di cassette gRNA)²⁸.

In linea di principio STAgR può essere utilizzato per generare dei vettori di espressione con pochi (1-2 gRNAs), diversi (3 – 5 gRNAs) e alcuni del più alto numero di cassette di espressione finora riportati (6 – 8 gRNAs)²⁸. Allo stesso modo, STAgR è applicabile per qualsiasi sequenza di gRNA, spina dorsale o promotore. Poiché tuttavia, STAgR è principalmente basato su reazioni a catena della polimerasi (PCR) e l'assemblaggio di Gibson, gRNAs con le somiglianze alta sequenza deve essere generato utilizzando un metodo alternativo.

1. design di STAgR clonazione strategia

1. Decidere su quanti gRNA cassette sarà inclusi nel vettore di espressione e in quale ordine. Determinare quali promotori e gRNA ponteggi devono essere utilizzati per tutte le gRNAs. Progettare il gRNAs utilizzando qualsiasi strumento online (ad esempio, www.benchling.com).

2. design di STAgR clonazione primer con sporgenze

Nota: La sequenza di protospacer senso dell'ultimo gRNA e antisenso del primo gRNA rispettivamente vengono aggiunti per gli iniettori PCR usati per l'amplificazione del backbone vettoriale (Figura 1). Le sequenze rimanenti sono amplificate dalle stringhe, quindi associare il senso e antisenso gRNAs nell'ordine desiderato. La prima stringa pezzo è amplificato con un primer forward contenente il primo gRNA N20 sequenza come una sporgenza e un primer inverso con la seconda gRNA N20 sequenza (complemento inverso) come una sporgenza. Tutti i pezzi seguenti vengono generati di conseguenza.

1. Aggiungere N20 gRNA sequenze i primer di amplificazione in avanti per stringa STAgR DNA come sporgenze (tabella 1). Aggiungere senso gRNA sequenze 5' al primer forward "scf-FP" (per un ponteggio convenzionale) o "sam-FP" (per un ponteggio contenente MS2). Primer FP tempri la parte di ponteggio/MS2 della relativa stringa STAgR (Figura 1).
2. Aggiungere il complemento inverso N20 gRNA sequenza le sequenze dell'iniettore inversa. Scegliere primer RP a seconda dei promotori specifici e stringhe utilizzate (hU6-RP, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).

3. generazione di STAgR clonazione di frammenti

1. Per generare i singoli frammenti clonazione per assemblaggio di Gibson, eseguire PCRs impostando 10 µ l di tampone di alta fedeltà (HF), 1 µ l di 10 mM dNTPs, 0,25 µ l di sporgenza-primer (100 µM), 10 ng della polimerasi del DNA modello (stringa o vettoriale), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l di solfossido dimetilico (DMSO) e aggiungere H₂O per rendere un volume finale di 50 µ l.
   Nota: Utilizzare il plasmide "STAgR_Neo" come un modello per la spina dorsale PCR per incorporare gRNA patibolo per l'ultimo gRNA, se SAM Scaffold viene scelto, utilizzare "STAgR_SAM". Per un plasmide STAgR con sei gRNA cassette per esempio, sei PCRs sono necessarie, che cinque con DNA stringhe come modelli e uno con la spina dorsale di vettore come il modello.
2. Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 98 ° C per 1 min 30 s; 38 cicli di 98 ° C per 10 s, 59 ° C (per ponteggio gRNA) / 68 ° C (per ciclo di SAM) per 10 s, 72 ° C per 30 s (per inserti) / 1 min 30 s (per vettori); 1 ciclo di 72 ° C per 10 min.
3. Rimuovere 5,5 µ l dalla reazione di PCR, Aggiungi tintura di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio 1%. Carico una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (100 bp DNA ladder/1 kb DNA ladder) ed eseguire il gel in un funzionamento appropriato gel buffer (ad es., TLE buffer) a 120 V per 30 min.
4. Mentre il gel è in esecuzione, aggiungere 5 µ l di buffer fornito con l'enzima di restrizione e 0,5 µ l DpnI (10 unità) per la reazione di PCR µ 44,5 l rimanente e incubare per 30 min a 1 h a 37 ° C.
5. Eseguire la purificazione del DNA usando i branelli magnetici.
   1. Aggiungere 1,8 perline magnetico µ l per 1 µ l di prodotto PCR e Miscelare pipettando su e giù. Incubare per 2 min a temperatura ambiente (TA).
   2. Perline e frammenti di DNA separate dal liquido residuo con un magnete. Lavare perle due volte con etanolo al 70% di risciacquo il pellet senza risospendere completamente.
   3. Rimuovere tutti i etanolo con una pipetta e lasciare asciugare il pellet aria.
   4. Dissolva la pallina in 15-20 µ l H₂O pipettando su e giù e separare le perle dal liquido utilizzando un magnete. Trasferire il surnatante chiaro ad un nuovo tubo.
      Nota: In alternativa, kit di pulizia basata su colonne di reazione può essere utilizzato.
6. Determinare le concentrazioni di DNA usando uno spettrofotometro come descritto altrove²⁹.

4. Gibson Assembly reazione e trasformazione batterica

Nota: I seguenti passaggi sono adattati da Gibson et al. ³⁰.

1. Preparare una fatta in casa Gibson reazione mescolare o utilizzare un kit di clonazione commerciale di Gibson.
   1. Combinare 3 mL di 1 M Tris (Tris (idrossimetil) amminometano)-HCl a pH 7.5, 300 µ l di 1 M MgCl, 60 µ l di 100 millimetri di dGTP (deossiguanosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dATP (deossiadenosina trifosfato), 60 µ l di 100 millimetri di dTTP (deossitimidina trifosfato) e 60 µ l di 100 mM dCTP ( deossicitidina trifosfato), 300 µ l di 1 M DTT (dithiothreitol), 1,5 g di PEG-8000 (polietilene glicole), 300 µ l di 100 mM NAD (nicotinamide adenina dinucleotide) e aggiungere H₂O per ottenere 6 mL di buffer di reazione isotermica × 5.
      Nota: Aliquotati tampone può essere conservato a-20 ° C per almeno 12 mesi.
   2. Per il master di montaggio Gibson mescolare, unire 320 µ l di tampone di reazione isotermica x 5 con 697 µ l di H₂O e aggiungere 3 µ l di 10 esonucleasi T5 U / µ l, 20 µ l di 2 U / µ l DNA polimerasi e 160 µ l di 40 U / µ l Taq DNA ligasi.
      Nota: Questo mix può essere aliquotati e conservati a-20 ° C per almeno 12 mesi.
2. Utilizzare 7,5 µ l di mix master Assemblea con 2,5 µ l di insert e vettoriale. Per una reazione di x STAgR 2 utilizzare un vettore molare per inserire il rapporto di 1:1 ma non più di 0,2 pmol di DNA in totale. Per più di 2 cassette di espressione gRNA, utilizzare un vettore per inserire il rapporto di 1:3, ma non superare una quantità di DNA totale di 0,5 pmol.
   Nota: Tutte le cassette di espressione amplificata gRNA devono essere utilizzate in quantità equimolari. Includere un controllo di plasmide con l'identica quantità di vettore ma senza inserti di controllo per non digerito template vettoriale (e/o auto-legatura).
3. Incubare i campioni a 50 ° C per 45-60 min. esempi di Store su ghiaccio o a-20 ° C per la successiva trasformazione.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Direttamente trasformare metà del mix in batteri chimicamente competenti.
   1. Scongelare chimicamente competenti TOP10 Escherichia coli batteri sul ghiaccio.
   2. Aggiungere 5 µ l della miscela Gibson per 50 µ l di batteri competenti. Mescolare delicatamente, spostando il fondo della provetta. Incubare in ghiaccio per 30 min.
   3. Eseguire una scossa di calore inserendo il tubo in bagnomaria a 42 ° C o un blocco di calore per 45 s.
   4. Rimontare i tubi sul ghiaccio. Aggiungere 250 µ l di terreno SOC per i batteri e far loro recuperare a 37 ° C in un incubatore d'agitazione per 30 – 45 min.
5. Dopo il recupero, piastra i batteri trasformati su piastre di agar brodo (LB) di 1,5% Lisogenesi contenente ampicillina (100 µ g / mL) e incubare per una notte a 37 ° C.

5. selezione dei cloni STAgR di PCR della colonia batterica

1. Preparare almeno due insiemi di 200 provette di reazione di PCR di µ l (tra 3 e 24) per ogni costrutto, che sono etichettati in modo identico.
2. Riempire un set con 100 µ l LB contenente 100 µ g / ampicillina mL.
3. Utilizzare una pipetta sterile per grattare il materiale biologico di una colonia batterica e si è diffuso nella parte inferiore del tubo di reazione di PCR 100 µ l vuoto. Trasferire immediatamente la punta per il secondo tubo di reazione corrispondente contenente il mezzo LB.
4. Agitare delicatamente la punta intorno affinché alcuni dei batteri vengono trasferiti ai media LB e incubare a 37 ° C per un uso successivo.
5. Impostare un mix master di PCR (10 µ l per reazione).
   1. Per 10 reazioni, unire 10 µ l di tampone di Taq , 2 µ l 10 mM dNTPs, 0,5 µ l di primer (100 µM), 0,5 µ l di Taq polimerasi e aggiungere un volume di 100 µ l di H₂O.
   2. Utilizzare i seguenti primer: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
6. Aggiungere 10 µ l di master mix PCR di provette di reazione PCR senza il supporto LB.
7. Incubare le reazioni in un termociclatore usando le seguenti condizioni: 1 ciclo di 94 ° C per 5 min, 38 cicli di 94 ° C per 30 s, 55 ° C per 30 s, 72 ° C per 2 min; 1 ciclo di 72 ° C per 10 min.
   Nota: Tempo di allungamento (passo di 72 ° C) dovrebbe essere aumentato con il numero di cassette espressione gRNA. Calcolare la dimensione teorica di inserti utilizzando la tabella 2 e utilizzare 1 min a 1 kb a 72 ° C.
8. Aggiungere il colorante di caricamento e analizzare i frammenti amplificati su gel di agarosio all'1%. Caricare una scaletta di DNA appropriata per dimensionamento (1kb DNA Ladder) ed eseguire il gel appropriato in tampone (ad es., TLE Buffer) di corsa a 120 V per 30 min.
9. Calcolare la dimensione teorica del amplicon con l'aiuto della tabella 2 sommando le dimensioni individuali dei promotori usati, gRNA scaffolds e numero delle sequenze di N20. Dai risultati della Colonia PCR, identificare i cloni batterici basati sulla taglia corretta e se sono propensi a vettori corrette del porto.
10. Inoculare una cultura LB pernottamento 2,5 mL (con 100 ampicillina µ g/mL) con la corrispondente cultura 100 µ l, impostata in precedenza. Incubare a 37 ° C per 12 ore.
11. Estrarre il DNA plasmidico utilizzando un kit mini commerciale plasmide e istruzioni^{31 del produttore}.
12. Sequenza i plasmidi utilizzando i seguenti primer: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) mediante sequenziamento Sanger.

Seguendo il protocollo a portata di mano rende la generazione di personalizzato multiplexing gRNA vettori fattibile (Figura 1). Risultati rappresentativi degli approcci STAgR utilizzano sei gRNA diverse cassette sono rappresentati in Figura 2. Figura 2 A Mostra un tipico risultato di PCRs utilizzato per ottenere i pezzi di STAgR (protocollo 3.1-3.3). Gli sei ampliconi (BB, S1-S5) rappresentano pezzi di DNA lineari contenenti le sequenze individuali gRNA N20 sulla loro estremità. La spina dorsale del plasmide (BB) è ora estesa con le sequenze di targeting di gRNA1 e gRNA6 e quindi possiede il necessario si sovrappone a due altri PCRs (S1 e S5) per l'assemblaggio di Gibson (Figura 2A, tabella 3). Dopo la purificazione può essere ottenuto un rendimento del DNA di almeno 1 µ g per vettori e inserti.

Dopo l'assemblaggio di Gibson, trasformazione batterica dovrebbe risultare in colonie batteriche 100-700. Figura 2 B Mostra una rappresentativa analisi di 10 colonie batteriche tramite PCR, seguendo un protocollo STAgR con sei gRNA cassette della Colonia. Elettroforesi del gel indica che tre cloni mostrano la dimensione amplicone previsto per il montaggio completo (tabella 2). Altri cloni probabilmente ricevuto STAgR vettori contenenti un massimo di cinque cassette gRNA, considerando che un clone (Figura 2B, n ° 18) è vuoto.

Figura 1 : Panoramica di disegno dell'iniettore di STAgR. Prima gRNA numero e ponteggi sono scelti, poi gRNA ordine e promotore e ultimo, deve essere utilizzato quale tipo di vettore. Per ogni gRNA, un primer specifico in avanti con il gRNA targeting sequenza in orientamento di senso e la parte comune delle "scf-FP" o "sam-FP" è stato progettato. Allo stesso modo, per generare il primer reverse individuo la corrispondente sequenza del promotore (RP) si fonde con il complemento inverso della sequenza della prossima gRNA N20. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Risultati rappresentativi degli approcci STAgR utilizzano sei gRNA diverse cassette. (A) esempio rappresentativo di una PCR di cinque inserti come pure il vettore STAgR_Tomato. (B) Colony PCR di un 6 x STAgR reazione usando promotori hU6 e mU6 e canonico gRNA così come SAM impalcature. 22 colonie batteriche sono state analizzate, di cui 7 ha mostrato la band prevista che indica il gruppo completo. Scaletta: 1KB plus, numeri in coppie di basi (bp). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenze Primer per gRNA scaffolds e promotori.

Tabella 2: Dimensioni teoriche di ogni cassetta di espressione per calcolare il risultato PCR di Colonia.

Tabella 3: Misure di promotori e scaffold.

Tabella 4: Dimensioni calcolate di STAgR pezzi dopo PCR.

Qui presentiamo un protocollo dettagliato per STAgR consentendo la generazione veloce e semplice di gRNA plasmidi di espressione di varie dimensioni. Questo protocollo può essere utilizzato per la generazione di uno stadio di gRNA plasmidi con cassette di espressione di gRNA di 2 – 8 (con o senza due RNA MS2 aptameri) verso il vettore di espressione gRNA STAgR_Neo e l'utilizzo di umano U6, mouse U6, 7sK umano e umano H1 promotori^{28 ,32,33}. Se più di quattro cassette sono desiderati, si consiglia di utilizzare almeno due tipi di diverso promotore/impalcatura per aumentare l'efficienza. Altri vettori, promotori e combinazioni di promotore, nonché più di 8 gRNA cassette potrebbero essere fattibile pure; Tuttavia, questo non è stato testato. Sebbene nella nostra esperienza che il metodo funziona in modo affidabile e riproducibile, abbiamo determinato passaggi critici e strategie di risoluzione dei problemi deve il risultato atteso non immediatamente verificarsi. Nella nostra esperienza alcuni passaggi sono di fondamentale importanza per il successo dell'approccio: innanzitutto, è importante utilizzare il corretti rapporti molari di inserti per la spina dorsale del vettore presso il punto di montaggio di Gibson (3:1). Tuttavia, abbiamo notato che per alcuni set di gRNA un rapporto di 1:1 di inserti a vector è vantaggioso, anche quando il numero di cassette gRNA superare due. In secondo luogo, il periodo della reazione Assemblea Gibson dovrebbe essere sufficientemente lungo (almeno 45 min consigliato).

STAgR può essere impiegato con un gran numero di modifiche. Targeting per sequenze, gRNA numeri e impalcature, promotori e dorsali di vettore possono essere personalizzati e combinati liberamente. Tuttavia, ogni combinazione può avere esigenze leggermente diverse. Nella nostra esperienza, se medio o alto numeri di gRNA cassette (> 4) sono desiderato ma non ottenuti immediatamente, solitamente il modo più veloce per superare questo problema è quello di modificare l'ordine delle cassette gRNA individuali nel vettore. Allo stesso modo, combinando diversi gRNA promotori e scaffold migliora l'efficienza (e quindi abbassa il numero richiesto di PCRs Colonia che devono essere segnati) quando molti gRNA cassette vengono clonati. Abbiamo trovato che non corretti cloni sono solitamente generati dalla congiunzione spontanea di sequenze ripetute durante l'assemblaggio di Gibson. Anche se questo può ridurre l'efficienza del metodo, causando anche la generazione simultanea di vettori con funzionale gRNA sottoinsiemi²⁸.

Generazione di multiplexing gRNA vettori contenenti più di una cassetta di espressione gRNA è stato segnalato con un numero di metodi differenti^{21,22,23,24,25, 26,27}. Mentre alcuni impiegano simultanea o sequenziale clonazione di gRNA coppie^22,34, altri dipendono da Golden Gate Assemblea e clonazione sequenziale diversi passaggi^25,35. Un approccio speciale è stato utilizzato da Xie et al., impiegando il sistema di elaborazione tRNA cellulare endogeno per tagliare diversi gRNAs fuori un singolo progenitore trascrizione³⁶. Il advangetage di questo metodo è il requisito di un solo promotore; lo svantaggio è la necessità di frammenti di DNA di nuova sintesi per ogni combinazione di gRNA. Ogni gRNA multiplexing metodo ha vantaggi e svantaggi; STAgR combina semplicità con efficienza, elevato numero di possibili gRNA cassette con basso costo.

STAgR (e altri sistemi di multiplexing) sarà probabilmente strumentale nel rendere possibile l'interruzione efficiente (e simultanea) di più geni in vivo, come sperimentato in zebrafish cervelli²⁸. Un'altra applicazione futura di gRNA multiplexing vettori è la promessa per la manipolazione di programmi completi trascrizionale in contrasto con l'induzione o repressione di singoli geni. Probabilmente, questi approcci verranno permetterà di trasformare cellule e organi a saranno molto più elevato di quanto oggi è possibile.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Gli autori piacerebbe ringraziare Dr. Stephan Beck e Dr. Jovica Ninkovic per il loro contributo, guida e supporto nello sviluppo del metodo STAgR. Tobias Klötzer, Anna Köferle e Valentin Baumann per utili commenti. L'opera è stata sostenuta da DFG (STR 1385/1-1).