Um protocolo personalizáveis para String Assembly gRNA clonagem (STAgR)

Aqui, apresentamos a sequência montagem gRNA clonagem (STAgR), um método facilmente multiplexar gRNA vetores para CRISPR/Cas9 aproxima-se. STAgR faz a multiplexação de gRNA simples, eficiente e personalizável.

O sistema CRISPR/Cas9 bacteriano aumentou substancialmente opções metodológicas para os cientistas da vida. Devido à sua utilização, engenharia genética e genômica tornou-se aplicável a uma grande variedade de sistemas. Além disso, muitos transcriptional e abordagens de engenharia de epigenomic são geralmente viáveis agora pela primeira vez. Uma das razões para a ampla aplicabilidade do CRISPR reside na sua natureza bipartida. Pequenos gRNAs determinar os alvos genômicos do complexo, variantes da proteína Cas9 e as consequências locais moleculares. No entanto, muitas abordagens CRISPR dependem a entrega simultânea de múltiplos gRNAs em células individuais. Aqui, apresentamos um protocolo personalizável para sequência montagem gRNA clonagem (STAgR), um método que permite a geração simples, rápida e eficiente de gRNA multiplexado vetores de expressão em clonagem de um único passo. STAgR é rentável, desde que (no presente protocolo) as sequências alvos individuais introduzidas pela saliência curta primários enquanto os modelos de DNA longos das fitas de expressão gRNA possam ser reutilizados várias vezes. Além disso, STAgR permite a incorporação de passo a passo de um grande número de gRNAs, bem como combinações de gRNA diferentes variantes, vetores e promotores.

Sequência de caracteres conjunto gRNA clonagem (STAgR) é um método permitindo eficiente durante a noite geração de vetores de expressão que contém a expressão de gRNA várias fitas em um único clonagem passo. O protocolo de STAgR não depende de conhecimentos especializados ou materiais e oferece várias opções de personalização.

A proteína bacteriana CRISPR Cas9 tem uma capacidade única. É capaz de encontrar e ligam seletivamente apenas aquelas sequências de DNA codificadas em crRNAs naturais ou gRNAs engenharia¹. A sua utilização como uma ferramenta molecular permitiu que um grande número de abordagens que eram impossível, impraticável ou limitado apenas para alguns modelos de celulares até recentemente. Estes incluem de mutações do gene alvo², genoma engenharia³, Epigenoma edição^4,5,6, ativação transcricional e^7,8de silenciamento do gene. Tanto quanto sabemos que CRISPR é universalmente destacável, como relatórios de sua aplicação existem para uma grande variedade de espécies, tipos de células e sites de destino. No entanto, muitos aplicativos CRISPR dependem directa ou indirectamente a entrega de vários gRNAs, incluindo uma série de manipulações genômicas (translocações^9,10, médio¹¹ e alterações genômicas em grande escala ^{12 , 13}), engenharia de genoma (uso de Cas9 nickases¹⁴), geração de alelos condicional^11,15 ou mutações série¹⁶e traçando estratégias¹⁷. Além disso, para outras abordagens (transcriptional engenharia¹⁸, Epigenoma engenharia^19,20) vários sites de segmentação não são estritamente obrigatório, no entanto atingirem seu máximo efeito muitas vezes apenas sob este condição.

Foram descritos vários métodos úteis para gerar vetores gRNA contendo mais de uma gRNA expressão gaveta^{21,22,23,24,25,26, 27}. Aqui, apresentamos um protocolo para STAgR, sequência montagem gRNA clonagem, que é excelente em sua combinação de simplicidade e velocidade (apenas uma noite passo clonagem é necessário), baixo custo (como modelos de DNA podem ser reutilizados várias vezes), personalização (para gRNA diferentes sistemas e promotores) e eficácia (permite a geração de vetores contendo números elevados de gRNA cassettes)²⁸.

STAgR pode, em princípio, ser utilizado para gerar vetores de expressão com alguns (1 – 2 gRNAs), vários (3 – 5 gRNAs) e alguns de maior número de fitas de expressão relataram até agora (6 – 8 gRNAs)²⁸. Da mesma forma, STAgR é aplicável para qualquer sequência de gRNA, espinha dorsal ou promotor. Desde que no entanto, STAgR é principalmente baseado em reações em cadeia do polymerase (PCR) e montagem Gibson, gRNAs com similaridades de sequência alta devem ser geradas usando um método alternativo.

1. projeto de STAgR estratégia de clonagem

1. Decida sobre quantos gRNA cassettes será incluídos no vetor de uma expressão e em que ordem. Determinar quais promotores e gRNA andaimes devem ser usados para cada um do gRNAs. Desenha o gRNAs usando qualquer ferramenta on-line (por exemplo, www.benchling.com).

2. projeto de STAgR clonagem Primers com saliências

Nota: A sequência de protospacer sentido de gRNA o passado e o antisentido de gRNA o primeiro respectivamente são adicionados para os primers PCR utilizados para a amplificação do backbone vector (Figura 1). As sequências restantes são amplificadas de cadeias de caracteres, assim anexar o sentido e antisentido gRNAs na ordem desejada. A primeira sequência de peça é amplificada com um primer frente contendo o primeiro gRNA N20 sequência como uma saliência e um primer reverso com a gRNA segunda sequência N20 (complemento reversa) como uma saliência. Todas as peças seguintes são geradas em conformidade.

1. Adicione N20 gRNA sequências para os primers de amplificação para a frente para sequência de ADN STAgR como saliências (tabela 1). Adicione sequências de gRNA sentido 5' para a frente da primeira demão "scf-FP" (para um andaime convencional) ou "sam-FP" (para um andaime contendo MS2). As primeiras demão FP anneal para a cadafalso/MS2 parte da cadeia de caracteres respectivos STAgR (Figura 1).
2. Adicione o complemento reverso N20 gRNA sequência para as sequências de inversa da primeira demão. Escolha as primeiras demão RP dependendo dos promotores específicos e cadeias de caracteres usadas (RP-hU6, mU6-RP, 7sK-RP, H1-RP).

3. geração de STAgR clonagem de fragmentos

1. Para gerar os fragmentos individuais de clonagem para montagem de Gibson, executar PCRs pela criação de 10 µ l de tampão de alta fidelidade (HF), 1 µ l de dNTPs 10 mM, 0,25 µ l de saliência-primer (100 µM), 10 ng de polymerase de ADN modelo (cadeia de caracteres ou vetor), 0,5 µ l HF , 1,5 µ l de Dimetilsulfóxido (DMSO) e adicionar o H₂O para fazer um volume final de 50 µ l.
   Nota: Use o plasmídeo "STAgR_Neo" como um modelo para a espinha dorsal do PCR para incorporar o andaime gRNA para a gRNA ontem, se o SAM Scaffold é escolhido, use "STAgR_SAM". Para um plasmídeo STAgR com gRNA seis fitas por exemplo, seis PCRs são necessárias, que cinco com DNA de sequências de caracteres como modelos e um com a espinha dorsal de vetor como o modelo.
2. Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 98 ° C por 1 min 30 s; 38 ciclos de 98 ° C por 10 s, 59 ° C (para andaime gRNA) / 68 ° C (para loop de SAM) por 10 s, 72 ° C por 30 s (para inserções) / 1 min 30 s (para vetores); 1 ciclo de 72 ° C por 10 min.
3. Remover a 5,5 µ l da reação de PCR, Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose 1%. Uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (100 bp DNA escada/1 kb DNA ladder) e executar o gel em um gel de adequada execução de carga Reserva (por exemplo, buffer TLE) em 120 V por 30 min.
4. Enquanto o gel está em execução, adicione 5 µ l de buffer fornecido com a enzima de restrição e 0,5 µ l DpnI (10 unidades) para a reação de PCR restante 44,5 µ l e incube por 30 min a 1 h a 37 ° C.
5. Realize a purificação de DNA usando esferas magnéticas.
   1. Adicionar 1,8 grânulos de magnético µ l por 1 µ l de produto do PCR e misture pipetando para cima e para baixo. Incube durante 2 min à temperatura ambiente (RT).
   2. Contas separadas e fragmentos de DNA de líquido residual com um ímã. Lave grânulos duas vezes com etanol 70% enxaguando a pelota sem resuspending completamente.
   3. Remover todos os etanol com uma pipeta e seque ao ar da pelota.
   4. Dissolva a pelota em 15 – 20 µ l H₂O pipetando para cima e para baixo e separar os grânulos do líquido usando um ímã. Transferi o sobrenadante claro para um tubo novo.
      Nota: Alternativamente, kits de limpeza reação baseada na coluna podem ser usados.
6. Determine as concentrações de DNA usando um spectrophotometer conforme descrito em outro lugar,²⁹.

4. Gibson Assembly reação e transformação bacteriana

Nota: As etapas a seguir são adaptadas de Gibson et al . ³⁰.

1. Prepare uma Gibson caseiro reação misturar ou usar um kit de clonagem comercial Gibson.
   1. Combine 3 mL de 1 M Tris (Tris (hidroximetil) aminometano)-HCl pH 7,5, 300 µ l de 1 M de MgCl 60 µ l de 100 mM dGTP (Desoxiguanosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dATP (Desoxiadenosina trifosfato), 60 µ l de 100 mM dTTP (cromatografia trifosfato), 60 µ l de 100 mM dCTP ( Desoxicitidina trifosfato), 300 µ l de 1 M DTT (ditiotreitol), 1,5 g de 8000-PEG (polietileno glicol), 300 µ l de 100mm NAD (dinucleótido de nicotinamida e adenina) e adicionar o H₂O para obter 6 mL de tampão de reação isotérmica × 5.
      Nota: Aliquotada tampão pode ser armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses.
   2. Para o mestre de montagem Gibson misturar, combinar 320 µ l de tampão de reação isotérmica x 5 com 697 µ l de H₂O e adicionar 3 µ l de 10 do exonuclease T5 U / µ l, 20 µ l de 2 U / µ l de DNA polimerase e 160 µ l de 40 ligase do ADN de Taq U / µ l.
      Nota: Esta mistura pode ser aliquotadas e armazenado a-20 ° C durante pelo menos 12 meses.
2. Use 7,5 µ l do mix de mestre de montagem com 2,5 µ l de inserção e vetor. Para uma reação de x STAgR 2 usa um vetor de molar para inserir a proporção de 1:1, mas não mais de 0,2 pmol de DNA total. Por mais de 2 fitas de expressão gRNA, usar um vetor para inserir a proporção de 1:3 mas não exceda uma quantidade de DNA total de 0,5 pmol.
   Nota: Todas as fitas de expressão amplificada gRNA devem ser usadas em montantes equimolar. Inclua um controle de shRNA com o montante idêntico do vetor, mas sem inserções de controle para o modelo não digerida vector (e/ou ligadura self).
3. Incube as amostras a 50 ° C para amostras de 45 a 60 min. loja no gelo ou a-20 ° C para posterior transformação.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Diretamente transforme metade da mistura em bactérias quimicamente competentes.
   1. Descongele quimicamente competentes TOP10 Escherichia coli bactérias no gelo.
   2. Adicione 5 µ l do mix Gibson para 50 µ l de bactérias competentes. Misture suavemente por agredir o fundo do tubo. Incube no gelo por 30 min.
   3. Executar um choque térmico, colocando o tubo no banho maria a 42 ° C ou um bloco de calor por 45 s.
   4. Calce os tubos de gelo. Adicionar 250 µ l de meio SOC para as bactérias e deixá-los a recuperar a 37 ° C numa incubadora de agitação por 30-45 min.
5. Após a recuperação, placa as bactérias transformadas em placas de ágar de caldo (LB) 1,5% lisogenia contendo ampicilina (100 µ g / mL) e incubar durante uma noite a 37 ° C.

5. seleção de Clones de STAgR por PCR de colônia bacteriana

1. Prepare pelo menos dois conjuntos de 200 µ l reação da polimerase (entre 3 e 24) para cada construção, que são rotulados de forma idêntica.
2. Preencher um conjunto com meio LB 100 µ l contendo 100 µ g / ampicilina mL.
3. Use uma ponta de pipeta estéril para raspar o material biológico de uma colônia bacteriana e espalhá-lo no fundo do tubo de reação de PCR de 100 µ l vazio. Transferi imediatamente a ponta para o segundo tubo de reação correspondente, contendo o meio LB.
4. A ponta ao redor agitar suavemente o frasco para assegurar algumas bactérias são transferidas para a mídia LB e incubam a 37 ° C para uso posterior.
5. Prepare uma mistura de mestre de PCR (10 µ l por reação).
   1. Para 10 reações, combinar 10 µ l de buffer de Taq , 2 µ l 10mm dNTPs, 0,5 µ l de primer (100 µM), 0,5 µ l de Taq polimerase e adicionar um volume de 100 µ l de H₂O.
   2. Use os seguintes primers: StAgR_seq_fwd2: ACTGGATCCGGTACCAAGG, StAgR_seq_rev: TTACGGTTCCTGGCCTTTTG.
6. Adicione 10 µ l da mistura mestre PCR para os tubos de reação de PCR rotulados sem a mídia LB.
7. Incubar as reações em um thermocycler usando as seguintes condições: 1 ciclo de 94 ° C por 5 min, 38 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 1 ciclo de 72 ° C por 10 min.
   Nota: O tempo de alongamento (etapa de 72 ° C) deve ser aumentado com o número de fitas de expressão gRNA. Calcular tamanho teórico de inserções usando a tabela 2 e usar 1 min por 1 kb a 72 ° C.
8. Adicionar corante de carregamento e analisar os fragmentos amplificados em um gel de agarose a 1%. Carregar uma escada de DNA apropriada para dimensionamento (1kb DNA Ladder) e executar o gel apropriado em reserva (por exemplo, o Buffer) em execução em 120 V por 30 min.
9. Calcule o tamanho teórico do amplicon com a ajuda da tabela 2 por somando os tamanhos individuais de promotores usados, gRNA andaimes e número de sequências de N20. Partir dos resultados da colônia do PCR, identifica os clones bacterianos baseados o tamanho correto da banda e se eles são propensos a abrigar vetores corretos.
10. Inocule a cultura correspondente de 100 µ l, configurada anteriormente, uma cultura LB 2,5 mL durante a noite (com 100 ampicilina µ g/mL). Incube a 37 ° C, durante 12 h.
11. Extrair o DNA do plasmídeo usando um kit de mini plasmídeo comercial e de instruções do fabricante³¹.
12. Sequenciar os plasmideos usando os seguintes primers: StAgR_seq_fwd1 (GAGTTAGGGGCGGGACTATG), StAgR_seq_fwd2 (ACTGGATCCGGTACCAAGG) e StAgR_seq_rev (TTACGGTTCCTGGCCTTTTG) por sequenciamento Sanger.

Seguindo o protocolo na mão faz a geração de personalizado multiplexação gRNA vetores viáveis (Figura 1). Resultados representativos das abordagens STAgR usando seis fitas de gRNA diferentes são representados na Figura 2. Figura 2 A mostra um resultado típico de PCRs usado para obter as peças STAgR (protocolo de 3.1-3.3). Os seis amplicons (BB, S1-S5) representam lineares pedaços de DNA que contém as sequências individuais gRNA N20 em suas extremidades. A espinha dorsal do plasmídeo (BB) é agora alargada com as sequências alvos de gRNA1 e gRNA6 e, portanto, possui as sobreposições necessárias para dois outros PCRs (S1 e S5) para montagem de Gibson (Figura 2, tabela 3). Após a purificação pode ser alcançado um rendimento de DNA de pelo menos 1 µ g para vetores e inserções.

Após a montagem de Gibson, transformação bacteriana deve resultar em 100 a 700 colônias bacterianas. Figura 2 B mostra uma análise representativa de 10 colônias bacterianas através de colônia PCR, seguindo um protocolo STAgR com seis gavetas de gRNA. Eletroforese em gel indica que três clones mostram o tamanho esperado amplicon para assembly completo (tabela 2). Outros clones provavelmente recebido STAgR vetores contendo fitas de gRNA de um a cinco anos, Considerando que um clone (Figura 2B, no. 18) está vazio.

Figura 1 : Visão geral do projeto da primeira demão de STAgR. Primeiro número gRNA e andaimes são escolhidos, então gRNA e promotor e a última, qual tipo de vetor deve ser usado. Para cada gRNA, destina-se um primer específico para a frente com a gRNA segmentação sequência na orientação de sentido e a parte comum do "scf-FP" ou "sam-FP". Da mesma forma, para gerar o primer reverso individual a correspondente sequência de promotor (RP) é fundido com o complemento reverso da sequência do próximo gRNA N20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Resultados representativos das abordagens STAgR usando seis fitas de diferentes gRNA. (A) exemplo representativo de um PCR de cinco inserções, bem como o vetor STAgR_Tomato. (B) PCR de colônia de um 6 x STAgR reação usando promotores de hU6 e mU6 e gRNA canônica, bem como SAM andaimes. 22 colônias bacterianas foram analisadas, dos quais 7 mostrou a banda esperada indicando o conjunto completo. Escada: 1kb e números em pares de bases (bp). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Sequências de Primer para andaimes gRNA e promotores.

Tabela 2: Teóricos tamanhos de cada gaveta de expressão para calcular o resultado PCR de colônia.

Tabela 3: Tamanhos de promotores e andaimes.

Tabela 4: Calculados tamanhos das peças STAgR após a PCR.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para STAgR permitindo a geração rápida e simples de plasmídeo de expressão gRNA de tamanhos variados. Este protocolo pode ser usado para a geração de uma etapa de gRNA plasmídeos com fitas de expressão de gRNA 2 – 8 (com ou sem duas aptamers MS2 RNA) para o vetor de expressão de gRNA STAgR_Neo e o uso de U6 humano, rato U6, 7sK humano e humano H1 promotores^{28 ,}de^32,33. Se mais de quatro fitas são desejadas, é recomendável usar pelo menos dois tipos diferentes de promotor/andaime para aumentar a eficiência. Outros vetores, promotores e combinações do promotor, bem como mais de 8 fitas gRNA também podem ser viáveis; no entanto, isso não foi testado. Embora em nossa experiência, o método funciona reproducibly e confiável, nós determinamos passos críticos e estratégias de resolução de problemas o resultado esperado não imediatamente caso ocorra. Em nossa experiência, alguns passos são cruciais para o sucesso da abordagem: primeiro e acima de tudo, é importante usar os rácios molares correctos de pastilhas para o backbone de vetor na etapa de montagem Gibson (3:1). No entanto, notamos que uma proporção de 1:1 de inserções de vetor é benéfica, mesmo quando o número de gaveta gRNA exceda dois para alguns conjuntos de gRNA. Em segundo lugar, o período da reação montagem Gibson deve ser suficientemente longo (pelo menos 45 min recomendado).

STAgR pode ser empregado com um grande número de modificações. Direcionamento de sequências, gRNA números e andaimes, promotores e backbones de vetor podem ser personalizados e livremente combinados. No entanto, cada combinação pode ter requisitos ligeiramente diferentes. Em nossa experiência, se médio ou elevado números de gRNA cassettes (> 4) são desejados, mas não obteve imediatamente, geralmente o caminho mais rápido para superar este problema é para alterar a ordem das fitas gRNA individuais do vetor. Da mesma forma, combinar diferentes gRNA promotores e andaimes melhora a eficiência (e, portanto, reduz o número necessário de colônia PCRs que têm de ser marcados) quando muitos gRNA fitas são clonadas. Nós achamos que clones incorretas são geralmente gerados pela conjunção espontânea de sequências repetidas durante a montagem de Gibson. Embora isto pode reduzir a eficiência do método, isto também resulta na geração simultânea de vetores com gRNA funcional subconjuntos²⁸.

Geração de multiplexação gRNA vetores que contenham mais de uma gaveta de expressão gRNA tem sido relatada com um número de diferentes métodos^{21,22,23,24,25, 26,},²⁷. Enquanto alguns empregam simultânea ou sequencial de clonagem de gRNA pares^22,34, outros dependem de montagem de Golden Gate e vários sequencial clonagem passos^25,35. Uma abordagem especial tem sido usada por Xie et al., empregando o sistema de processamento de tRNA celular endógena para cortar várias gRNAs de um único progenitor transcrição³⁶. O advangetage desse método é a exigência de apenas um promotor; a desvantagem é a necessidade de fragmentos de DNA recém sintetizados para cada combinação de gRNA. Cada gRNA multiplexação método tem vantagens e desvantagens; STAgR combina simplicidade com eficiência, o elevado número de possíveis gRNA cassettes com baixo custo.

STAgR (e outros sistemas de multiplexação) provavelmente será instrumentais no sentido de permitir interrupção eficiente (e simultânea) de vários genes na vivo, como foi o pioneiro no zebrafish cérebros²⁸. Uma outra aplicação futura de multiplexação vetores gRNA é a promessa para a manipulação de programas completos de transcriptional em contraste com a indução ou repressão de genes único. Provavelmente, essas abordagens permitirá transformar células e órgãos em vão a um grau muito maior do que é possível hoje.

Os autores não têm nada para divulgar.

Os autores gostaria de agradecer sua entrada ao Prof. Dr. Stephan Beck e Prof. Dr. Jovica Ninkovic, ajuda e suporte no desenvolvimento do método STAgR. Tobias Klötzer, Anna Köferle e Valentin Baumann para comentários úteis. O trabalho foi apoiado pelo DFG (STR 1385/1-1).