Insan akciğer dokularında ZW10 etkileşim protein Immünoster dijital Analizi

ZW10 etkileşen protein (ZWıNT) mitotik mil kontrol noktasına ve karsinomun patogenezine katılır. Burada, insan akciğer kanseri dokularında zwınt immün boyama bir metodoloji tanıtmak, tüm slaytlar ve görüntü analizi dijital tarama izledi. Bu metodoloji, yüksek kaliteli dijital görüntüler ve güvenilir sonuçlar sağlayabilir.

Bu çalışmanın amacı, insan akciğer dokularının immunoster bir metodolojisi tanıtmak, tüm slayt dijital tarama ve görüntü analizi izledi. Dijital tarama, bir slayt yığınını taramak ve yüksek kalitede dijital görüntüler üretmek için hızlı bir yoldur. Bu, patologlar tarafından konvansiyonel ışık mikroskobu (CLM) ile uyumlu sonuçlar üretebilir. Ayrıca, dijital görüntülerin kullanılabilirliği, aynı slaytın birden çok kişi tarafından aynı anda gözlemlenmesini mümkün kılar. Ayrıca, slaytların dijital görüntüleri bir veritabanında depolanabilir, bu da cam kaydırakların uzun süreli bozulmasını önlenir. Bu tekniğin sınırlamaları aşağıdaki gibidir. İlk olarak, yüksek kaliteli hazırlanmış doku ve orijinal immünhistokimya (ıHC) herhangi bir hasar veya aşırı sızdırmazlık kalıntısı olmadan slaytlar gerekir. İkinci olarak, tümör veya nontümör alanları Puanlama sırasında tümör veya nontümör alanları hakkında herhangi bir karışıklık önlemek için, yazılım kullanarak analiz önce deneyimli patologlar tarafından belirtilmelidir. Üçüncü olarak, operatör tüm slayt görüntüleme içinde dijitalleştirme işlemi boyunca renk çoğaltılması kontrol etmek gerekir.

ZW10 etkileşime giren protein (zwint), mitotik mil kontrol noktası^1,2,3' te yer alan kinetochore kompleksinin gerekli bir bileşenidir. Bu zwint tükenmesi anormal prematüre kromozom segregasyon^1,2,3yol açmaktadır bildirilmiştir. Son çalışmalar, zwint 'in tümör hücrelerinin proliferasyonunun yaygınlaştırılması ile multipl tümörlerin patogenezine dahil olduğunu öne sürdü^4,5. Daha önce akciğer kanserinde zwınt ekspresyonu bildirdi⁵. CLM kullanarak patologlar tarafından slaytların Analizi zaman alıcı ve niceliksel^6,7,8olduğunu yaygın olarak kabul edilmiştir_. Dahası, saklanan cam slaytların bozulması daha önce oluşturulan slaytları geri çekmek imkansız hale gelebilir. Bilgisayar tabanlı, dijital tüm slayt görüntüleme (WSI) gelişmekte olan yöntem bu sınırlamalar^6,7,8üstesinden gelebilir.

Bu amaçla, insan akciğer kanseri dokularında zwınt immün boyama bir metodoloji tarif, tüm slayt dijital tarama ve yazılım tabanlı görüntü analizi ile birleştiğinde. Bu metodolojinin ana avantajı, CLM ile uyumlu sonuçlar üretilmesi. Bu teknoloji, Hematoksilin-eozin lekeleme (H & E) ve IHC, floresans in situ hibridizasyon (balık), doku mikrodizileri (TMA) ve ilaç keşfi ve gelişimi gibi patolojik skorlama alanlarında yaygın olarak kullanılabilir.

Burada açıklanan tüm yöntemler Wuhan Üniversitesi Zhongnan Hastanesi Etik Komitesi ve Wuhan Üniversitesi Renmin Hastanesi tarafından onaylanmıştır.

1. ıHC slaytlarının hazırlanması

1. Akciğer dokusu örneğini, insan akciğer dokusu parçası (yaklaşık 3 x 3 cm),% 4 civarında formaldehite fosfat-tamponlu tuz (PBS) içinde 24 saat oda sıcaklığında (RT) daldırarak düzeltin.
2. % 80,% 95 ve% 100 etanol, sırasıyla, oda sıcaklığında 15 dakika, 20 dakika ve 20 dakika içinde doku dehydrate. Son olarak, her oda sıcaklığında 20 dk için 100% ksilon 3x içinde doku batırın.
3. Gömme için, parafin (63 °C) dokusunu 30 dakika boyunca batırın. parafin değiştirin ve başka bir 45 dakika için tekrar doku batırın. Son olarak, parafin yeniden değiştirin ve ek bir 1 h için doku batırın.
4. Dokuyu 5 μm kalınlığında bölümlere kesebilir ve 20 μg/mL Poly-L-lizin-kaplamalı slaytlara yerleştirebilirsiniz.
5. Ağlatma için, 2 h için 65 °C ' lik bir fırında slaytları yerleştirin ve daha sonra 15 dakika boyunca dimetilbenzen bölümlerine batırın ve ardından 15 dk için 100% Ksilin içinde ıslatın.
6. 100% etanol içinde 5 dakika için doku bölümleri 2x ile slaytlar hidrat,% 95 etanol içinde 5 dk seri seyreltilmiş etanol ile bir tedavi izledi,% 80 etanol 5 dk,% 70 etanol 5 dk, ve 5 dk içinde 50% Etanol.
7. Antijen onarımı gerçekleştirin.
   1. Çift distile H₂o (DDH₂o) ile 1x için seyreltik sitrik asit onarım sıvı (20X).
   2. Bir antijen onarım kutusunda doku bölümleri ve 1x sitrik asit onarım sıvı (300 mL) ile slaytlar yerleştirin ve daha sonra, 2 dakika boyunca yüksek güç mikrodalga fırında ısı, 6 dakika kaynatma sürdürmek için düşük güce Isıtma izledi.
   3. Bölümlerin doğal olarak oda sıcaklığında soğumasını bekleyin.
   4. 0,01 M PBS ile sitrik asit tamir sıvısının yerine, oda sıcaklığında döner shaker içinde, 5 dakika için her zaman, 3x bölümleri yıkayın.
8. Endojen peroksidaz ortadan kaldırır.
   1. % 30 H₂o₂ Ila 3% DDH₂o, Slaytlar (tüm dokularda kapsar emin olun) ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında ıslak bir kutuda slaytlar inkük.
      Not: ıslak kutu 10 x 15 cm plastik bir kutu ve su içerebilir.
   2. Oda sıcaklığında Rotary shaker içinde 0,01 M PBS ile, 5 dakika boyunca her zaman, 3x slaytlar yıkayın.
9. Nonspesifik antijen engelleyin.
   1. 0,1% Tween 20 (PBST) ile PBS ile konsantre normal keçi serumu% 10 keçi serumu ile seyreltin.
   2. Slaytlara% 10 keçi serumu ekleyin ve 37 °C ' de ıslak kutuda 30 dakika boyunca inküye yapın.
      Not: keçi serumu slaytlardaki tüm dokuları kapsamalıdır.
10. Dokuları lekeleyin.
    1. Bir gecede 4 °C ' de tavşan anti-insan anti-ZWINT antikor (1:50) ile slaytları kulyur.
    2. Oda sıcaklığında Rotary shaker içinde 0,01 M PBST (1 mL 0,1% ara 20 ' de 1.000 mL PBS) ile 5 dakika boyunca her seferinde 3 adet slayt yıkayın.
    3. 37 °C ' de 30 dakika boyunca sekonder antikor (Anti-tavşan algılama sistemi, 1:200) ile slaytları kulbe etme.
    4. Rotary Shaker 0,01 M PBST ile, 5 dakika boyunca her zaman, 3x slaytlar yıkayın.
11. İmmunostan görselleştirmek için, slaytlar ekleyin 300 μL taze 3, 3-diaminobenzidin ve sonra, oda sıcaklığında musluk suyu ile slaytlar yıkayın.
    Not: boyama derecesi mikroskop altında izlenir (büyütme 10X-40X).
12. Dokusu karşı. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca hematoksinlin boyama çözeltisi ile slaytları lekeleyin ve daha sonra 15 dakika boyunca musluk suyu ile slaytları yıkayın.
    Not: Kernel, mikroskop altında mavi renkte görünür (büyütme 10X-40X). Mavi boyama derecesi daha güçlü ise, 3-5 s için hidroklorik alkol farklılaşma, doku belirgin boyama kolaylaştırmak için 15 dakika için musluk suyu ile mavi geri doku durulama takiben kullanılabilir.
13. 50% etanol içinde 5 dakika,% 70 etanol 5 dk, 5 dk için% 80 etanol,% 95 etanol içinde 5 dk ve son olarak, oda sıcaklığında% 100 etanol içinde 5 dk için 2x için slaytlar susuz.
14. Şeffaflık için,% 100 Ksilin içeren bir tanktaki doku bölümlerini 15 dakika boyunca batırın ve bölümleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 100 ksilen içeren başka bir tanka aktarın.
15. Sızdırmazlık için, 50-100 μL nötr sakız alın ve karışımı% 5 ksile ekleyin (kabarcıklar karıştırma kaçının). Akciğer dokusu bölümlerine yukarıda bahsedilen karışımı 15 μL ekleyin. Filmi kapak camıyla mühürleyin ve kabarcıkları hafifçe bastırın.

2. otomatik tüm-slayt tarama ıHC slaytlar

1. Mühürlü slaytlar onları kurutmak için oda sıcaklığında 12 saat kurumaya izin verin.
2. El Ile parlak alan seçeneğini seçin ve manuel tarama arayüzünü girin.
3. Slaytların adını gözden geçirin ve görüntüler için bir depolama yolu seçin.
4. Tarama alanını ayarlayın ve Kullanıcı kümesi eşikleri kullanarak tarama örnekleriseçeneğini belirleyin. Eşik 200 μm bir tarama alanı genişletme değeri ile yaklaşık 50.
5. Tarama odağı değerini ayarlayın, odağı otomatik olarak seçin — 1050 ile 2650 arasında değişmektedir — ve son olarak, tek katmanlı moduseçin.
6. IFC slaytlarını iş istasyonunda yükleyin ve otomatik taramayı başlatın.
   Not: slaytların zarar görmediğinden emin olun. Slaytları temiz ve saydam tutmak ve slaytlarda toz, konfeti ve aşırı sızdırmazlık kalıntılarının önlenmemesi. Cam slayt ve lamel magazini işaretler yoksun olmalıdır. Slaytları ksilene ile temizlemeniz gerekmez. Slaytların boyutu Tablo 1' de verilir.
7. Otomatik olarak 20X, 40X veya 100X büyütme ile bir slayt üzerindeki tüm doku bölümünü tarayın.
8. Tüm slayt taramasının sonunda görüntüleri toplayın ve saklayın.

3. görüntüleme yazılımı tarafından slaytların Analizi

1. Histopatolojik görüntü analiz yazılımını başlatın ve yerel bilgisayarıseçin.
2. Tarama verilerini depolayan dosyayı açın.
3. 2X ile 40X aralığında uygun yakınlaştırma seviyesini seçin.
4. Renk ayarı ile en uygun kontrastı ayarlamak için rengi ayarlayın.
5. El ile daire ve her görüntü ilgi bölümlerini adlandırın.
   Not: Örneğin, bir alan daire ve tümör alanıolarak adlandırın.
6. Eklentileri ve qcseçin. Şu anda, senaryo Oluşturucusu açılır.
7. Yoğunluk Quant seçin ve algılama çubuğunu ayarlayın.
   Not: Bu işlem dikkatle yapılmalıdır. Mavi tolerans çubuğu hücresel çekirdeğin rengini ayarlamak için kullanılır. Kahverengi tolerans çubuğu, görüntüde dolgu renginin doygunluğunu ayarlamak için kullanılır. Düzelttikten sonra görüntülerin sonuçları Orijinal meslektaşları ile tutarlı olmalıdır.
8. Puan düzeylerini ayarlamak için orijinal görüntülerin benzer çember çevrelenen alanların boyama yoğunluğunu yapmak.
   Not: koyu kahverengi güçlü pozitif gösterir, kahverengimsi sarı orta pozitif, açık sarı zayıf pozitif, ve beyaz negatiftir.
9. Modeli bir dosya olarak depolar ve adlandırın. Modeli diğer slaytlara uygulayın ve Seçili detaylandırmayıseçin ".
10. Yazılım otomatik olarak resimde çember alanları için H-Puanını hesaplamak izin verin.

4. H-Puanlama sistemi kullanılarak puanların ölçülmesini^9,10

1. İmmunostlama ve boyama yoğunluğu yüzdesini hesaplayın (0: negatif, 1 +: zayıf, 2 +: Orta, 3 +: güçlü).
2. Tümör ve bitişik nontümör alanlarının patolojik puanlamasını hesaplamak için bir puanlama sistemi (H-Score) kullanın.
   Not: H-Score = (zayıf yoğunluk x 1 olan hücrelerin yüzdesi) + (orta yoğunluklu x 2 olan hücrelerin yüzdesi) + (güçlü yoğunluğa sahip hücrelerin% x 3). Bu nedenle, maksimum H-Score 300 ise 100% hücrelerin güçlü yoğunluğu ile nicelik.

ZWıNT 'in ifade düzeylerini, ıHC tarafından 14 skuayöz Hücre Karsinomu (SCCs) ve 14 adenokarsinomları (ADCs) dahil olmak üzere, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) numunelerinin (tümör ve bitişik nontümör dokularında) 28 çifti olarak ölçtük. Slaytların tüm slayt dijital tarama yüksek kalitede dijital görüntüler (Şekil 1a) sağladı. Sonuçlar, akciğer kanserinin H-skoru komşu noncancer dokulardan önemli ölçüde daha yüksek olduğunu gösterdi (P < 0,0001, iki kuyruklu t-test) (Şekil 1a ve 1B). Ayrıca, biz SCCs içinde ZWıNT ifade düzeyini önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulundu ADCs (Şekil 1C).

Şekil 1 : Akciğer kanseri dokularında Immunohistokimyasal boyama. Bu rakam Yuan et al değiştirildi. Dove Press 'in izni ile ⁵ . (A) Bu panel, akciğer kanseri hastalarının temsili immünhistokimyasal görüntülerini gösterir (büyütme: 10X ve 40X). (B) Bu panel, akciğer kanseri ve komşu noncancer dokularının H-Puanını gösterir. (C) Bu panel, ADCS ve SCCS 'nin H-Puanını gösterir. Hata çubukları standart sapma gösterir. * P < 0,05; P < 0,001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: slayt boyutları.

Tüm slayt tarama güçlü tarama ve klinik ve araştırma amaçlı yüksek kaliteli görüntüler üretimi için sıcak bir konu haline geliyor^11,12,13. Görseller,^11,12,13dakika içinde slayt tarama mikroskopları tarafından üretilebilmektedir. Bu metodolojisi uygulayarak, ZWıNT ıFC slaytları için yüksek kaliteli görüntüler elde ettik ve tümör ile nontümör dokularının arasındaki H-Puanını karşılaştırdık. Burada sunulan protokolde, en kritik adımlar, patolojik Puanlama^13,14 önce yüksek kaliteli IHC slaytlar, görüntü edinme ve tümör ve nontümör alanların belirtimi hazırlanması vardır ^{, 15 , 16 yaşında}.

Geçerli Yöntem (CLM) ile karşılaştırıldığında bazı avantajları vardır. Dijital tarama yeterli hızlı (~ 20 slaytlar/saat) bir slayt yığını taramak ve yüksek kaliteli dijital görüntüler üretmek için. Bu CLM ile uyumlu sonuçlar üretebilir ama nispeten daha az zaman alır. Dijital görüntülerin kullanılabilirliği, aynı slaytın birden çok kişi tarafından aynı anda gözlemlenmesini mümkün kılar. Slaytların dijital görüntüleri bir veritabanında depolanabilir, bu da cam kaydırakların uzun süreli bozulmasını önlenir.

Bu tekniğin sınırlamaları, görüntüleme yazılımını kullanarak analizden önce tümör veya nontümör doku örneklerini belirlemek için yüksek kaliteli doku ve IFC slaytlar^6,8,11 ve teknik uzmanlık ihtiyacını içerir ,^6,7skorlama sırasında tümör veya nontümör alanları hakkında herhangi bir karışıklık önlemek için. Operatör aynı zamanda tüm slayt görüntüleme¹⁷dijitalleştirme işlemi boyunca renk çoğaltılması izlemek gerekir.

Bu yöntem aktif olarak balık, tma ve ilaç keşfi ve geliştirme^6,18' de uygulanabilir. Tabata ve ark. primer patolojik TANıNDA WSI kullanımını araştırdılar¹⁹. Japonya 'da dokuz hastanelerden 1070 WSı numunelerini retrospektif olarak analiz ettiler ve WSı 'nin primer tanıyla kullanımını doğrulandığını doğruladı. WSı ana avantajlarından biri de birden fazla öğrenci tarafından slaytların eşzamanlı görüntüleme sağlar²⁰. Bu nedenle, tüm slayt tarama görüntüleri doğrulama eğitim ve araştırma amaçlı^6,18,21için dijital tanılama gelişimine katkıda bulunabilir.

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu proje Çin 'in ulusal doğal Vakfı (No. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 ve 81501352) ve Hubei eyaleti (Çin) doğal temeli (No. 2017CFB631) tarafından destekleniyordu. Yazarlar Guo Qin, Chang Min, li Hui ve Wuhan Google biyolojik teknoloji Co, LTD onların teknik destek için meslektaşları onların takdir ifade. Yazarlar da dil düzenleme için muhammed Jamal teşekkür ederiz.