Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

A proteína de interação ZW10 (ZWINT) participa no ponto de verificação mitotic do eixo e na patogénese da carcinoma. Aqui, apresentamos uma metodologia de imunocoloração de ZWINT em tecidos de câncer de pulmão humano, seguido pela digitalização digital de slides inteiros e análise de imagem. Esta metodologia pode fornecer imagens digitais de alta qualidade e resultados confiáveis.

A finalidade deste estudo é introduzir uma metodologia da imunomarcação de tecidos humanos do pulmão, seguida pela exploração digital da todo-corrediça e pela análise de imagem. A digitalização digital é uma maneira rápida de digitalizar uma pilha de slides e produzir imagens digitais com alta qualidade. Pode produzir resultados concordantes com a microscopia de luz convencional (CLM) por patologistas. Além disso, a disponibilidade de imagens digitais torna possível que o mesmo slide pode ser observado simultaneamente por várias pessoas. Além disso, imagens digitais de slides podem ser armazenadas em um banco de dados, o que significa que a deterioração a longo prazo das lâminas de vidro é evitada. As limitações desta técnica são as seguintes. Primeiramente, precisa o tecido preparado de alta qualidade e as corrediças immunohistochemistry originais (IHC) sem nenhum dano ou resíduo excedente do vedador. Em segundo, as áreas do tumor ou do Atlas devem ser especificadas por patologistas experientes antes da análise usando o software, a fim evitar toda a confusão sobre as áreas do tumor ou do Atlas durante a pontuação. Em terceiro lugar, o operador precisa de controlar a reprodução da cor durante todo o processo da digitalização na imagem latente do inteiro-corrediça.

ZW10 proteína interagindo (zwint) é um componente necessário do complexo cinetócoro que está envolvido no ponto de verificação do fuso mitótico^1,2,3. Relatou-se que a prostração de zwint conduz à segregação prematura aberrante^1,2,3do cromossoma. Estudos recentes sugerem que a zwint está envolvida na patogênese de múltiplos tumores, promovendo a proliferação de células tumorais^4,5. Nós relatamos previamente o superexpressão de zwint no cancro do pulmão⁵. Tem sido amplamente aceito que a análise de lâminas por patologistas utilizando CLM é demorada e não quantitativa^6,7,8_. Além disso, a deterioração de lâminas de vidro armazenadas pode tornar impossível a retrair slides criados anteriormente. O método emergente de imagiologia por computador, digital Whole-slide (WSI) pode superar essas limitações^6,7,8.

Para este fim, nós descrevemos uma metodologia da imunocoloração de ZWINT em tecidos humanos do cancro de pulmão, acoplados com a exploração digital da todo-corrediça e a análise de imagem software-baseada. A principal vantagem desta metodologia é a produção de resultados concordantes com a CLM. Esta tecnologia pode ser amplamente utilizada nas áreas de Pontuação patológica de coloração de hematoxilina-eosina (H & e) e IHC, hibridação in situ de fluorescência (Fish), Microarrays teciduais (TMA) e descoberta e desenvolvimento de fármacos.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética do hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan e Renmin hospital da Universidade de Wuhan.

1. preparação de slides IHC

1. Fixar a amostra de tecido pulmonar, imersando o fragmento de tecido pulmonar humano (cerca de 3 x 3 cm) em paraformaldeído a 4% em solução salina tampão fosfato (PBS) por 24 h à temperatura ambiente (RT).
2. Desidratar o tecido em 80%, 95%, e 100% etanol por 15 min, 20 min e 20 min, respectivamente, à temperatura ambiente. Finalmente, mergulhe o tecido em 100% xileno 3x por 20 min cada em temperatura ambiente.
3. Para a incorporação, mergulhe o tecido em parafina (63 ° c) durante 30 min. mude a parafina e mergulhe o tecido novamente por mais 45 min. Finalmente, mude a parafina novamente e mergulhe o tecido nele por um adicional de 1 h.
4. Utilize um micrótomo rotativo para cortar o tecido em secções de 5 μm de espessura e coloque-os em lâminas revestidas com 20 μg/mL de poli-L-lisina.
5. Para a descera, coloque as lâminas em um forno de 65 ° c por 2 h e, em seguida, mergulhe as seções em Dimetilbenzeno por 15 min, seguido de imersão em xileno 100% por 15 min.
6. Hidratar as lâminas com as secções de tecido 2x por 5 min em 100% etanol, seguido por um tratamento com etanol diluído em série de 5 min em etanol 95%, 5 min em 80% etanol, 5 min em 70% etanol, e 5 min em 50% etanol.
7. Realize o reparo do antígeno.
   1. Diluir o líquido do reparo do ácido cítrico (20x) a 1x com H₂o dobro-destilado (DDH₂o).
   2. Coloc as corrediças com as seções do tecido e o líquido do reparo do ácido cítrico 1x (300 mL) em uma caixa do reparo do antígeno e, a seguir, aqueça-os no forno de microonda na potência elevada por 2 minutos, seguido pelo aquecimento na baixa potência para sustentar a ebulição por 6 minutos.
   3. Permita que as seções esfriem naturalmente à temperatura ambiente.
   4. Substitua o líquido do reparo do ácido cítrico com 0, 1 M PBS, lave as seções 3x, cada vez por 5 minutos, no abanador giratório na temperatura ambiente.
8. Elimine a peroxidase endógena.
   1. Diluir 30% de H₂o₂ a 3% com DDH₂o, adicioná-lo aos slides (certifique-se de que cobre todos os tecidos) e incubar as lâminas em uma caixa molhada à temperatura ambiente por 30 min.
      Nota: a caixa molhada é uma caixa plástica de 10 x 15 cm e pode conter a água.
   2. Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBS no agitador rotativo à temperatura ambiente.
9. Bloqueie o antígeno não específico.
   1. Diluir o soro de cabra normal concentrado para 10% de soro de cabra com PBS com 0,1% Tween 20 (PBST).
   2. Adicionar 10% de soro de cabra às lâminas e incubar-los na caixa molhada a 37 ° c durante 30 min.
      Nota: o soro de cabra deve cobrir todos os tecidos nas lâminas.
10. Manchar os tecidos.
    1. Incubar as lâminas com o anticorpo anti-humano anti-ZWINT do coelho (1:50) em 4 ° c durante a noite.
    2. Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBST (1 mL de 0,1% Tween 20 em 1.000 mL PBS) no agitador rotativo à temperatura ambiente.
    3. Incubar as lâminas com anticorpo secundário (sistema de detecção Anticoelho, 1:200) por 30 min a 37 ° c.
    4. Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBST no agitador rotativo.
11. Para visualizar a imunocoloração, adicione as lâminas a 300 μL de 3, 3-diaminobenzidina fresca e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira à temperatura ambiente.
    Nota: o grau de tingimento é monitorado um microscópio (ampliação 10X-40X).
12. Contratura o tecido. Manchar as lâminas com hematoxilina solução de coloração para 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira para 15 min.
    Nota: o núcleo aparece azul o microscópio (ampliação 10X-40X). Se o grau de coloração azul é mais potente, a diferenciação de álcool clorídrico para 3-5 s pode ser usada, seguida de enxaguar o tecido de volta ao azul com água da torneira por 15 min para facilitar a coloração proeminente do tecido.
13. Desidratar as lâminas por 5 min em 50% etanol, 5 min em 70% etanol, 2x em 80% etanol por 5 min, 5 min em 95% etanol e, finalmente, 2x por 5 min cada em 100% etanol à temperatura ambiente.
14. Para transparência, mergulhe as seções de tecido em um tanque contendo 100% de xileno por 15 min e transfira as seções para outro tanque contendo 100% de xileno por 15 min à temperatura ambiente.
15. Para selar, tomar 50-100 μL de goma neutra e adicionar 5% de xileno à mistura (Evite misturar em bolhas). Adicionar 15 μL da mistura acima mencionada nas secções do tecido pulmonar. Selar o filme com tampa de vidro e pressione suavemente as bolhas para fora.

2. varredura automática da todo-corrediça de corrediças de IHC

1. Deixe os slides selados secar por 12 h à temperatura ambiente para dessecá-los.
2. Selecione o campo brilhante manualmente a opção e incorpore a interface de exploração manual.
3. Revise o nome dos slides e selecione um caminho de armazenamento para as imagens.
4. Defina a área de digitalização e escolha a opção digitalizar amostras usando limites definidos pelo usuário. O limiar é de cerca de 50 com um valor de expansão de área de digitalização de 200 μm.
5. Defina o valor do foco de digitalização, selecione o foco automaticamente — ele varia de 1050 a 2650 — e, finalmente, selecione o modo de camada única.
6. Carregue os slides IHC na estação de trabalho e inicie a digitalização automática.
   Nota: Certifique-se de que os slides não estão danificados. Manter os slides limpos e translúcidos e evitar poeira, confetes e resíduos de selante em excesso nas lâminas. A corrediça de vidro e o lamela devem ser desprovidos das marcas. Não limpe as lâminas com xileno. O tamanho das lâminas é fornecido na tabela 1.
7. Digitalize automaticamente toda a seção de tecido em um slide com ampliação de 20X, 40X ou 100X.
8. Colete e armazene as imagens no final da digitalização do slide inteiro.

3. análise dos slides por Imaging Software

1. Inicie o software de análise de imagem histopatológica e selecione computador local.
2. Abra o arquivo que armazena os dados de digitalização.
3. Selecione o nível de zoom adequado do intervalo de 2X a 40X.
4. Ajuste a cor para definir o contraste ideal através de alternância de cor ajustar.
5. Circule manualmente e nomeie as porções de interesse em cada imagem.
   Nota: por exemplo, você pode circundar uma área e nomeá-la como a área do tumor.
6. Selecione plugins e QC. Neste momento, o Construtor de cenários aparece.
7. Selecione densidade Quant e ajuste a barra de detecção .
   Nota: este processo deve ser realizado com cuidado. A barra de tolerância azul é usada para ajustar a cor do núcleo celular. A barra de tolerância marrom é usada para ajustar a saturação da cor de preenchimento na imagem. Os resultados das imagens após ajustes devem ser consistentes com as contrapartes originais.
8. Ajuste os níveis de Pontuação para tornar a intensidade de coloração das áreas circuladas semelhantes às das imagens originais.
   Nota: marrom escuro indica forte positivo, amarelo acastanhado é moderadamente positivo, luz amarela é fracamente positivo, e branco é negativo.
9. Armazene e nomeie o modelo como um arquivo. Aplique o modelo a outros slides e selecione a anotação selecionada".
10. Deixe o software calcular automaticamente o H-Score para as áreas circuladas na imagem.

4. quantificação dos escores utilizando o sistema de Pontuação H^9,10

1. Calcule a percentagem de imunocoloração e a intensidade de coloração (0: negativo, 1 +: fraco, 2 +: moderado, 3 +: forte).
2. Use um sistema de Pontuação (H-score) para calcular a pontuação patológica do tumor e áreas adjacentes não tumorais.
   Nota: H-Score = (% das células com intensidade fraca x 1) + (% das células com intensidade moderada x 2) + (% das células com intensidade forte x 3). Portanto, o escore H máximo é 300 se 100% das células forem quantificadas com intensidade forte.

Nós medimos os níveis da expressão de zwint em 28 pares de espécimes do cancro do pulmão da não-pequeno-pilha (NSCLC) (tumor e de tecidos Atlas adjacentes), incluindo 14 carcinomas de pilha Squamous (SCCs) e 14 adenocarcinomas (ADCs), por IHC. A digitalização digital do slide inteiro das lâminas forneceu imagens digitais de alta qualidade (Figura 1a). Os resultados mostraram que o escore-H do câncer de pulmão foi significativamente maior que o dos tecidos adjacentes não oncológicos (P < 0, 1, teste tde duas caudas) (Figura 1a e 1B). Adicionalmente, verificou-se que o nível de expressão de ZWINT em SCCs foi significativamente maior do que nos ADCs (Figura 1C).

Figura 1 : Immunohistochemical que mancha para tecidos do cancro do pulmão. Este número foi modificado de Yuan et al. ⁵ com permissão de Dove Press. (A) este painel mostra imagens imunoistoquímicas representativas de pacientes com câncer de pulmão (amplificações: 10x e 40x). (B) este painel mostra o H-escore de câncer de pulmão e tecidos adjacentes não oncológicos. (C) este painel mostra o H-score de ADCS e SCCs. As barras de erro indicam o desvio padrão. * P < 0, 5; P < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: tamanhos de slide.

A digitalização de slides inteiros está se tornando um tema quente para sua digitalização robusta e produção de imagens de alta qualidade para fins clínicos e de pesquisa^11,12,13. As imagens podem ser produzidas por microscópios de slide-scanning dentro dos minutos^11,12,13. Aplicando esta metodologia, nós obtivemos imagens de alta qualidade para corrediças de zwint IHC e comparamos o H-escore entre o tumor e os tecidos Atlas. No protocolo aqui apresentado, as etapas mais críticas são a preparação dos slides IHC de alta qualidade, a aquisição da imagem e a especificação das áreas tumorais e não tumorais antes da Pontuação patológica^{13,14 , 15 anos} de ^, a ¹⁶.

O método atual tem algumas vantagens em comparação com (CLM). A digitalização digital é rápida o suficiente (~ 20 slides/hora) para digitalizar uma pilha de slides e produzir imagens digitais de alta qualidade. Ele pode produzir resultados concordantes com CLM, mas leva relativamente menos tempo. A disponibilidade de imagens digitais torna possível que o mesmo slide pode ser observado simultaneamente por várias pessoas. Imagens digitais de slides podem ser armazenadas em um banco de dados, o que significa que a deterioração a longo prazo das lâminas de vidro é evitada.

As limitações desta técnica incluem a necessidade para o tecido de alta qualidade e os deslizamentos de IHC^6,8,11 e perícia técnica para especificar as amostras do tecido do tumor ou do Atlas antes da análise usando o software da imagem latente , a fim de evitar qualquer confusão sobre as áreas tumorais ou não tumorais durante a pontuação^6,7. O operador igualmente precisa de monitorar a reprodução da cor durante todo o processo da digitalização na imagem latente do inteiro-corrediça¹⁷.

Esse método pode ser aplicado ativamente em peixes, TMA e descoberta e desenvolvimento de fármacos^6,18. Tabata et al. investigaram o uso de WSI em diagnósticos patológicos primários¹⁹. Analisaram retrospectivamente 1070 espécimes de WSI de nove hospitais em Japão e confirmaram a validação do uso de WSI em diagnósticos preliminares. Uma das principais vantagens do WSI é que ele permite a visualização simultânea dos slides por vários alunos²⁰. Portanto, a validação de imagens de digitalização de slides inteiros pode contribuir para o desenvolvimento de diagnósticos digitais para fins educacionais e de pesquisa^6,18,21.

Os autores não têm nada a revelar.

Este projeto foi apoiado pela Fundação Nacional natural da China (no. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 e 81501352) e da Fundação natural da província de Hubei (China) (no. 2017CFB631). Os autores expressam sua apreciação a Guo Qin, Chang min, Li Hui, e seus colegas na tecnologia biológica Co. de Wuhan Google, LTD para seu apoio técnico. Os autores também agradecem a Muhammad Jamal pela edição da linguagem.