Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Hedeflenen periferik dokulara kan üzerinden monosit alımı, doku hasarı, tümör gelişimi ve otoimmün hastalıklar sırasında enflamatuar süreç önemlidir. Bu onların yapışma ve transendothelial göç (hicret) temel etkilenen doku takip aktive endotel hücrelerinin luminal yüzeyine serbest akışı yakalama sürecinde kolaylaştırılmıştır. Ancak, monosit altgrupları Tercihli ve içerik bağımlı alımı destek mekanizmaları hala tam anlaşılır. Bu nedenle, aynı anda görüntülenir ve akış altında ölçülen için farklı monosit altgrupları alımı sağlayan bir yöntem geliştirdik. Hızlandırılmış confocal görüntüleme üzerinde dayalı bu yöntemi yapışık ve transmigrated monosit arasında kesin ayrım olanak sağlar. Burada, bu yöntem aynı anda pro-anjiogenik ve sigara anjiogenik monosit tüp bebek işe alım çağlayan eğitim için nasıl kullanılabileceği açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yöntem en çok üç monosit nüfus alımı farklı adımları incelemek için uzun olabilir.

Hasarlı doku, anjiogenez ve kanser^{1,2,3 de dahil olmak üzere birçok hastalığın patofizyolojisi temizlik patojenler, kavga ettiği için esastır doğuştan gelen bağışıklık fagositik bileşeni monosit teşkil} . Monosit, kanda dolaşan, ancak periferik doku iltihabı site için belirli moleküler mekanizmalar aracılığıyla işe heterojen altgrupları oluşur ve kemik iliği türevi hücrelerdir. Monosit, lökosit gelince işe alım cascades genel olarak, yakalama, inişli çıkışlı, tarama, tutuklama, transendothelial geçiş (hicret) ve geçiş damar duvarı (membran ve duvar resmi de dahil olmak üzere farklı adımları implicates hücreleri)⁴. Bu adımlar, esas olarak iltihap kaynaklı moleküller üzerinde endotel luminal yüzeyinde selectins, glikoprotein ligandlar, kemokinler, hücreler arası ve bileske adezyon molekülleri ve onların reseptörleri gibi ligandlar selektin gibi lökosit içerir ve integrinler. Ticaret yolları endotel hücre kavşak (paracellular) veya endotel hücre vücut (transcellular) aracılığıyla endotel bariyer⁵geçmeye lökositler tarafından kullanılabilir. Monosit tarihsel transcellular yönlendirme yolu transmigrate için dokümante edilmiş iken, monosit artık homojen hücre nüfus kabul edilir gibi onların göç yolu içinde olası farklılıkları gidermek önerilmiştir. Şimdi monosit çeşitlilik her onların farklılıklar ve ortak tarafından tanımlanabilir,^3,6ile ilgili olarak kendi kendine özgü ekstravazasyonu basamaklandırır açık hale geliyor. Bu nedenle, belirsizliğe yer bırakmadan monosit altgrupları arasında ayırımcılık için görselleştirmek önemlidir ve fenotip her işe alım sırasında farklı bu altgrupları davranışını işlemek.

Monosit gelen insan, domuz, fare ve fare ile belirli görev atfedilen ve özel göçmen davranış^7,8,9fenotipik altgrupları içine kentler. Örneğin, insanlarda, monosit CD14, bakteriyel lipopolysaccharide için bir coreceptor ve CD16, Fc-gama reseptör III onların yüzey ifadeye dayalı üç alt kümeleri ayrılabilir. İnsan monosit altgrupları dahil klasik CD14⁺CD16^-, orta CD14⁺CD16⁺ ve klasik olmayan CD14^dimCD16⁺ hücreleri^6,9. Klasik CD14⁺CD16^- monosit esas olarak iltihaplı olmak gösterildi ise CD16 havuzu⁺ monosit topluca TIE2 ifade ve proangiogenic işlev¹⁰sunmak için bulunmuştur. Sürekli olarak, endotel hücre stimülasyon ile inflamatuar sitokinlerin gibi insan tümör nekroz faktör (TNF) α veya interlökin (IL-1) beta (geleneksel iltihabı) klasik CD14 tam istihdamı tetiklemek yeterli⁺CD16 ^- monosit. Ancak, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) A ve TNFα (anjiogenik faktörler tahrik iltihabı) eş zamanlı eylemleri CD16 hicret kışkırtmak için gerekli olan⁺ proangiogenic havuzu monosit³. Tarihsel olarak, statik koşulları, paralel plaka akışı odası ve μ-slayt akışı odaları geleneksel Transwell sisteminde kullanılan kantitatif analiz bir lökosit nüfus bir zaman vitro^{11, işe alım ,12,13}. Bu protokoller doğrulandıktan iken, aynı anda birden fazla monosit altgrupları analizine izin daha sağlam bir yöntem daha anlayışlı olarak değerlendirilir. Böyle metodolojisi birden çok etkileşimler ve her ilgili nüfus farklı frekansları için hesap ve ayrıca her monosit tanımlamak işe alım cascades için benzerlikler ve özelliklerine mekanik bir anlayış sağlamak alt küme küme.

Burada, aynı anda confocal mikroskobu kullanılarak belirlenmesi için farklı monosit altgrupları göçmen cascades sağlayan akış altında monosit alımı zaman hata görüntüleme dayalı bir yöntem mevcut. Bu yöntem endotel hücre iltihabı, hem de sonrası kapiller venüller, monosit dolaşan hemodinami lökosit işe alım içinde vivo ana konumunu taklit bazı kritik özellikleri entegre. İnsan göbek bağları izolasyonu iyi kurulmuş bir protokol aracılığıyla oluşturulan insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), önerilen yöntem kullanır. Bu klinik kaynağın ederken aynı zamanda umbilikal ven ayrılmış olabilir endotel hücrelerinin makul bir verim sağlayan biyolojik bir yan ürün kolayca kullanılabilir olmanın avantajı var. Biz de floresan boyalar ve ayirt farklı hücresel bileşenleri ve belirsizliğe yer bırakmadan monosit (abluminal vs. luminal) konumlandırma tanımlamak için confocal mikroskobu arasında ayırt etmek için kullanılan zaman içinde. Burada sunulan Protokolü monosit altgrupları hicret düzeyde aynı anda ölçmek için geliştirilmiştir. Ayrıca, bu yöntem diğer lökositler altgrupları ve işe alım süreçleri çalışmaya farklı biyolojik ve etiketleme kullanımı ile uzatılabilir olduğunu belirtmek gerekir.

İnsan malzemeler ile aydınlatılmış onam gönüllü bağış ve İsviçre etik komiteler klinik araştırma uygun olarak kullanılmıştır.

1. izolasyon ve insan göbek dondurulması damar endotel hücreleri (HUVEC)

1. 5 mL kaplama çözeltisi (0.1 mg/mL kollajen G ve fosfat tamponlu tuz PBS pH %7,4 0,2 jelatin) T75 şişesi için 37 ° C'de 30 dk HUVEC yalıtım işlemini başlatmadan önce ekleyin.
2. PBS sahip kablo temiz, steril kompres ile silin ve bir steril 20 cm Petri kabına yerleştirin. Kablonun ucu steril makasla kesme.
3. Tek büyük damar ve iki küçük arterlerin tanımlar. Yavaşça bir kanül kendisine ven ekstremitelerde kordon ucunda içine iliştirilmiş bir üçlü stopcock yerleştirin.
4. Kablo ve tel uzunluğu ile sıkıca kanül bağlantı sıkın.
5. İki kez 20 mL ile kordon RPMI orta 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ve 250 ng/mL kordon 's damarlar yıkamayı Amfoterisin B içeren sıvı. Bu işlem daha beyaz ve daha net kablosunu görünümünü sağlar. Ven collagenase ek Önce bir ucunda bir şırınga RPMI toplayarak boş.
6. Ven ile 1 mg/mL collagenase türü 12 mL sıvı ben (0,22 µm filtre).
7. Yakın stopcock, göbek bağını sona erer ve kordon 12 dk için 37 ° C'de kuluçkaya.
8. Yavaşça endotel hücrelerinden damar lümen ayırmak için kordon masaj.
9. 30 mL % 10 fetal buzağı serum 50 mL şırınga içeren RPMI almak ve göbek kordonu bir ucunu bağlayın.
10. Bir boş 50 mL şırınga göbek kordonu diğer ucunu takın
11. Stopcock açın ve damar bir ucundan diğer ucundan karşılıklı toplama iken sıvı.
    Not: Toplanan süspansiyon endotel hücreleri içerir.
12. Bu hücre süspansiyon 200 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
13. Süpernatant atmak ve hücre Pelet tam M199 Orta (M199 içeren % 20 FCS, 15 µg/mL endotel hücre büyümesini takviyeleri, 100 µg/mL heparin sodyum, 0.5 µM hidrokortizon, 10 µg/mL L-askorbik asit, 100 U/mL penisilin, 100 U/mL 10 mL ile resuspend streptomisin ve 250 ng/mL Amfoterisin B).
14. Kaplama çözüm T75 balonun kaldırmak ve bir kez PBS ile durulayın.
15. Tohum hücreleri T75 şişesi adım 1,13 toplanan ve % 5 CO₂37 ° C'de kuluçka yerleştirin.
16. Ertesi gün, şişeye kalan kırmızı kan hücreleri kaldırmak ve sonra Orta 2 günde izdiham kadar değiştirmek için 3 kez tam M199 orta ile yıkayın.
17. % 80-90 izdiham, HUVEC monolayer kez 5 mL de PBS ile durulayın ve 5 mL 1 mM EDTA M199 5 dk. eklemek 4 mL ve 1 mL tripsin eylemi durdurmak için FCS için 37 ° C'de % 0.05 tripsin de hücrelerle bağlantısını kesin. Tüm HUVEC ayırmak için şişeye boşalt.
18. Bir aliquot VE-cadherin, PECAM-1 ve gp38 boyama için kullanılan ve HUVEC saflık kontrol etmek için akış sitometresi tarafından çözümlemek için 50 µL toplamak.
19. HUVEC kalan 200 x g oda sıcaklığında 5 min için adımda 1,18 15 mL tüp ve santrifüj toplamak.
20. Adım 1.19 süpernatant atmak, 5 x 10⁵ hücre/mL cryotubes yoğunluğu, çözüm (FCS % 10 DMSO içeren) dondurma hücre Pelet resuspend ve-80 ° C'de veya sıvı azot kullanımı kadar dondurmak.
21. HUVEC saflık denetlemek için:
    1. Anti-insan VE-cadherin-FITC antikor 1 µL, Anti-insan PECAM1-PE antikor 1 µL ve anti-insan Podoplanin-APC antikor 1 µL 1,18 adımda toplanan HUVEC 50 µL aliquot ekleyin.
    2. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    3. PBS ve santrifüj 100 µL 400 x g 30 eklemek s.
    4. Süpernatant atın ve PBS 100 µL içinde resuspend. Veri akış sitometresi teknikleri tarafından şimdi elde edilebilir.
       Not: HUVEC VE-cadherin ve PECAM-1 için pozitif ve negatif Podoplanin için.

2. HUVEC buz çözme

Not: HUVEC düşük geçiş deneyler için (en fazla 5 pasajlar) kullanın.

1. Bir T75 şişesi 1 mL 30 dk 37 ° C'de kaplama çözeltisi ile kat.
2. Hızla 2 min için 37 ° C'de HUVEC defreeze ve tam M199 10 mL hücrelerde resuspend.
3. Hücreleri 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
4. Hücre Pelet tam M199 10 mL resuspend.
5. Önceden kaplanmış şişeye hücre süspansiyon aktarın. Kuluçka %5 CO₂37 ° C'de şişeye koyun. Hücre kültür orta 2 günde değiştirin.

3. HUVEC kültür 0.4 µ-slayt odasında

1. Akış deney başlamadan önce beş gün önceden 0.4 µ-slayt chambers ile 0.1 mg/mL kollajen G, 30 dk 37 ° C'de % 0,2 jelatin içeren PBS 30 µL kat.
2. Chambers PBS 100 µL ile yıkayın.
3. Bir T75 şişesi bir % 80 – 90 konfluent HUVEC hücrelerden bağlantısını kesin.
4. PBS ile 5 mL HUVEC durulama ve onları 5 mL 5 min için 37 ° C'de % 0.05 tripsin ile bağlantısını kesin.
5. Temizleme ve tam M199 hücre süspansiyon toplamak ve en uygun yöntemi tarafından hücreleri saymak. 200 x g oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
6. Hücre Pelet 10⁶ hücre/mL resuspend ve oda başına 30 µL (30.000 hücreleri) dağıtın.
7. 1s için % 5 CO₂ 37 ° C'de bir kuluçka hücrelerde kuluçkaya.
8. Tam M199 150 µL her odasına ekleyin ve kuluçka CO₂37 ° C ve % 5, 5 gün boyunca hücreler kültür. Orta 2 günde değiştirin.

4. HUVEC monosit işe alım tahlil akış altında için boyama

1. M199 ve CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) 1 µM etiketleme orta hazırlamak ve 5 min için 37 ° C'de hücre etiketleme önce sıcak.
2. 37 ° C'de yıkama HUVEC M199 orta ile iki kez ısındı
3. Orta CMFDA 1 µM içeren ısıtılan etiketleme orta 30 µL ile değiştirin ve 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka makinesi 10 dakika yerleştirin.
4. Bir kez yıkama ile tam M199 ve 37 ° C ve % 5 CO₂ kuluçka 30 dk için tam M199 hücrelerle kuluçkaya.
   Not: Serum etiketleme çözüm eklenmesi önce tüm izlerini silmek önemlidir, aksi takdirde HUVEC boyama değiştirebilir.
5. Her iki insan TNFα içeren orta tam M199 ile değiştirin (500 U/mL) veya insan TNFα karışımı (500 U/mL) insan VEGFA ile (1 µg/mL) bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂6 h için.

5. yalıtım insan Pan monosit ve altgrupları boyama

1. Yoğun insan kanı buffy bir kat veya 20 mL EDTA Tüp tüpler deneyde gününde toplanan taze izole insan kanı kullanın.
2. PBS-1 mM EDTA (1:1) kanda sulandırmak ve yavaşça seyreltilmiş kan yoğunluk gradient medya 20 mL üstüne 20 mL pipet. Vasıl 400 x g oda sıcaklığında yavaş hızlanma ve fren olmadan 30 dk santrifüj kapasitesi.
3. Periferik kan mononükleer hücre (PBMC) toplamak-(arasında yoğunluk gradient medya ve plazma katmanları) trombosit katmanına 40 mL PBS - 1 mm EDTA içeren yeni bir 50 mL tüp. 50 mL PBS - 1 mM EDTA ile top.
4. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.
5. Hücre Pelet boyama arabellek (1 mM % 0.5 Sığır serum albümin BSA içeren PBS - EDTA) 10 mL ile resuspend.
6. 5 dakika süreyle 200 x g oda sıcaklığında, santrifüj süpernatant atmak.
7. 5.5 ve 5.6 adımları yineleyin.
8. Hücre Pelet arabellek boyama 10 mL ile resuspend. 10 µL hücre sayısı için bir aliquot almak.
9. PBMC nüfus kontrol edin ve hızla bir akış sitometresi içeren hücreleri saymak.
   Not: Karakteristik lenfosit ve monosit nüfusu (Şekil 1A) görülebilir. Hakkında taze insan kanı 50 mL bekliyoruz 50-100 10 x⁶ PBMC.
10. CD14 + karşı CD14-PBMC akış altında alımı için:
    1. Üç kez ile akış arabellek Pelet yıkayın (M199% 0.5 BSA içeren) ve akış arabellek, 6 x 10 mL başına⁶ hücre mononükleer hücrelerde resuspend.
    2. Her tahlil için 200 µL aliquots olun. Önce tahlil 20 dk kadar 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. 5 µL anti-CD14-PE ve Höchst 33342 2 µM son bir konsantrasyon, her aliquot için ekleyin. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.
    5. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 200 µL ile resuspend.
11. Monosit altgrupları akış altında alımı için:
    1. Monosit üretici yönergelerine uygun bir pan monosit izolasyon kiti ile izole et.
       Not: Aşağıdaki yalıtım 50 x 10⁶ hücreler için protokolüdür. Üreticinin önerilerini içinde olarak yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir.
    2. PBMC süspansiyon 200 x g 5 min için oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.
    3. Süpernatant atın ve Pelet arabellek boyama 400 µL ile resuspend.
    4. 50 µL Fc reseptör engelleme reaktif ve Pan monosit antikor kokteyl 50 µL ekleyin.
    5. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    6. Tampon ve manyetik boncuklar konjuge anti-biotin antikor 100 µL boyama 400 µL ekleyin. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    7. Boyama arabellek 2 mL ekleyin ve bir mıknatıs ile birleştiğinde bir MAC'ler LS sütun kullanın.
    8. LS sütun üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve tampon boyama 1 mL ekleyin. Akışı aracılığıyla atın.
    9. PBMC süspansiyon sütunda geçmek ve yeni 15 mL tüp içinde pan monosit içeren rağmen açık akış toplamak.
    10. 5 mL top için boyama tampon ekleyin.
    11. Bir aliquot alın ve monosit yalıtım akış sitometresi ile kalitesini kontrol edin.
    12. Pan monosit sayısı belirler.
        Not: Sadece monosit nüfus (Şekil 1B)görülebilir.
    13. Monosit adım 5.11.11 200 x g 5 min için de geri kalanı santrifüj kapasitesi.
    14. Süpernatant atmak.
    15. Hücre Pelet akış arabellek 5 mL resuspend (M199% 0.5 BSA içeren).
    16. 5.11.13-5.11.14 iki kez EDTA herhangi bir iz ortadan kaldırmak için yineleyin.
12. Monosit süspansiyon akışında olun 6 x 10⁶ hücre/mL tampon (M199% 0.5 BSA ile).
13. Monosit her işe alım tahlil için 200 µL aliquots olun.
14. Enjeksiyon önce 20 dk kadar kuluçka 37 ° C'de aliquot devam et.
15. Anti-CD16-PE antikor ve Höchst 33342 (son 2 µM) 5 µL her aliquot için ekleyin.
16. Mix ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
17. Santrifüj kapasitesi 400 x g 30, aliquot s.
18. Süpernatant atın ve Pelet akış arabellek 250 µL ile resuspend.
19. 30 µL monosit süspansiyon confocal mikroskobunun edinme parametreleri ayarlamak için kullanılmak üzere slaytı bir odası ekleyin.
20. Adım 5,18 37 ° C'de monosit süspansiyon aliquots engellemek
    Not: Bu süspansiyon akış sisteminde enjekte edilir hazırdır.

6. sıvı sistemi hazırlanması

1. 37 ° C'de ayarla görüntüleme için hücre kuluçka sağlamak
   Not: Akış sistemi bir diyagram Şekil 2' de gösterilmiştir.
2. Boru bölüm ı: araya bir radarı bağlayıcı erkek (8 cm uzun ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir parça bir ucunu takın ve diğer ucunu bir satır içi radarı enjeksiyon kümesine bağlayın. Silikon (40 cm ve 3 mm kalınlığında) boru bir parça için ikinci radarı konektörüne takın bir ucunda.
   Not: İsteğe bağlı olarak, bir 5 mL şırınga bağlı bir 3-yollu musluk hatlı radarı enjeksiyon kümesi ve nihai hava kabarcık Temizleme için boru silikon arasında eklenir.
3. Araya boru Bölüm II: 20 mL şırınga (1 m uzunluğunda ve 3 mm kalınlığında) silikon tüp bir uzunluğu bir ucunu bağlayın. Radarı bağlayıcı erkek tüp diğer sonuna yerleştirin.
4. Bağlanmak bölüm ı ve II boru radarı bağlayıcı erkek bir kadın radarı kilit bağlaştırıcı (Şekil 2A) için ekleyerek bölüm.
5. Havzanın 37 ° C'de ısındı akış arabellek (M199 + %0.5 BSA) içeren silikon tüp Ücretsiz sonu koymak
6. Boru akış arabellek ile doldurmak için pistonu 20 mL şırınga üzerinde çek.
7. Şırınga pompa yerleştirin ve güvenli.
8. Pompa ayarla içinde modu olarak demleyin (karşı) çekilme ve akış hızını belirtin.
9. Aşağıdaki formülü kullanarak kullanılan IBIDI slayt göre akış hızı belirleyin:
   
   Not: Slayt faktör deneme için kullanılan IBIDI slayt bağlıdır. Μ-slayt için ben^0,4 slayt faktör Bu örnekte kullanılan radarı kilit 131.6 olduğunu. Belirli slayt faktörler için bkz şirket web sitesi¹⁴. Akış arabellek viskozite 0.0072 dyn.s/cm²' dir. Yamultma stres sonrası kapiller venüller hakkında 0.5 dyn/cm²' dir.
10. Slayt (Şekil 2B) Bağlan:
    1. Silikon tüp kadın radarı kilit Coupler çevresinde kelepçe ve iki radarı bağlayıcı erkek bağlaştırıcı kesin.
    2. Onları teşvik HUVEC ve orta ile dolgu içeren slayt rezervuarlar bağlayın. Hava kabarcıkları bu adımı sırasında kaçının.
    3. Kelepçeler almak ve bağlantı değil sızdırıyor emin olun.
11. Hızlandırılmış görüntüleme için mikroskop altında slayt yerleştirin ve pompa başlar.

7. zaman hata görüntüleme akış tarafından Confocal mikroskobu altında monosit alımı

1. 40 x objektif kullanın (bkz. Tablo reçetesi) görüntüleme için.
2. 405 etkinleştirmek nm (mavi monosit çekirdeği), 488 nm (yeşil endotel hücreleri) ve 561 nm (kırmızı CD16 + alt) lazerler.
3. Satın alma parametrelerini ayarlamak için monosit içerir odası kullanın.
   Not: Sigara transmigrated hem transmigrated monosit algılamak için iğne deliği ve lazer 405 nm yoğunluğu yüksek ayarlanır. Böylece, transmigrated monosit biraz bazal planında görünür. Ancak tek transmigrated monosit yeni yer altında endotel hücreleri meşgul karşılık gelen çekirdek çevresinde günahı bir alan mevcut.
4. Mikroskop altında elde edilebilir için bir yer odası.
5. Views 1 cm çapındaki çok pozisyonlu confocal görüntüleme için 3 alanı seçin.
6. Bazal ve endotel hücrelerinin apikal kenarlarında tanımlamak
7. Bir z-yığın 10 – 12 µm aralığı (0.5 µm adım) ayarlayın. Hızlandırılmış bir kazanım her 1dk çalıştırın.
8. Görüntüleme 3 dk sonra 200 µL monosit süspansiyon (6 x 10⁶ hücre/mL), satır içi radarı enjeksiyon bağlantı noktası yoluyla enjekte et.
   Not: Hızla monosit apikal odak düzlemi içinde görünür, uygun ve hicret (üretim emrindeki apikal bazal planı) başlatın.
9. Görüntü için en az 30 dakika. Bir kez bitmiş, görüntüleme durdurmak ve akışını durdurmak. Slayttan bağlantısını kesmek için boru kelepçe.
10. Slayt 10 dk 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde ile düzeltmek.
11. Slayt PBS ile yıkayın ve slayt gerekirse daha fazla çözümleme için 4 ° C'de depolayın.

8. ImageJ verilerle analiz

1. Her alandaki toplam yapisan monosit saymak. Mm²başına hücre sayısı belirler.
2. Bazal planı endotel hücreleri altında bulunması ve bir kara delik (yeşil kanal) çekirdek çevresinde varlığı ile saptanan transmigrated monosit saymak.
3. Yapisan lökosit sayısı tarafından transmigrated lökosit sayısı bölün. Hicret oranı yapisan monosit yüzdesi olarak sunulur.
4. Gösterim amacıyla, apikal ve bazal iki tarafın aynı anda her endotel bu bölmeleri içinde gerçekleşen olayları göstermek için gösterilebilir.

TNFα tarafından indüklenen HUVEC etkinleştirme durumunu belirleme

Biyo-etkinlik inflamatuar sitokin TNFα, toplu iş ve donma-çözülme döngüsü repletion göre farklı. HUVEC harekete geçirmek durum TNFα tedavi ile kontrol etmek önemlidir. Bu paralel olarak selectins, ICAM-1 ve VCAM-1^15,16,17inflamatuar indüksiyon için konfluent HUVEC bazı örnekleri boyama tarafından gerçekleştirilebilir. TNFα tedaviden sonra HUVEC etkinleştirme durumunu kontrol etmek için daha kolay ve basit bir şekilde inflamatuar stres altında endotel hücreleri tarafından görüntülenen morfolojik değişimdir. Şekil 3' te gösterildiği gibi HUVEC sonra 6-h unstimulated hücreleri ile karşılaştırıldığında TNFα huzurunda uzamış. TNFα ve VEGFA bir karışımı HUVECs uyardığında benzer uzama gözlenir. HUVEC harekete geçirmek durum kayıt monosit hicret kesin sonuçları endotel hücre aktivasyonu kalitesine bağlıdır kadar önemlidir.

Monosit hicret karakteristik kesilmesi endotel hücrelerinde yapar.

Monosit hicret akış altında biz confocal mikroskobu ile endotel hücreleri yeşil CMFDA ve izole monosit hücre geçirgen Höchst 33342 boya (Şekil 4) mavi lekeli çekirdekleri ile lekeli çalışırdım. Hızlandırılmış confocal görüntüleme izin verilen monosit nerede onların fenotip olabilir apikal uçak, görselleştirme (Şekil 4A-C, kılavuz film 1) değerlendirildi. Hicret geçiren geçirme hücre apikal uçaktan kayboldu ve bazal düzlemde ortaya çıktı önce hücre-hücre kavşaklar için karşılık gelen hücreler arası uzay taşındı. Transmigrated hücreleri bir kara delik monosit şekillere karşılık gelen çekirdek etrafında sundu. Bu şekli sürekli endotel hücreleri (Şekil 4A-C, kılavuz Filmler 2-3) altında monosit geçiş sırasında değişti. Bu dinamik kara deliğin altında endotel hücreleri ve monosit konumlandırma, monosit vücut tarafından yapılan transmigrated hücre benzersiz tanımlaması için izin. Zamanla monosit alımı Nefelometri hicret (Şekil 4 d-E) tarafından takip monosit yapışma gösterdi. Lökosit ile hem transcellular hem de paracellular yolları extravasate rağmen biz sadece bu yöntem ile paracellular hicret akış altında gözlemlemek. Bu bizim önceki gözlem^3,11,18,19ile tutarlıdır.

İltihap tahrik anjiogenik faktör CD16 + monosit hicret teşvik etmektedir.

Bu yöntemi kullanarak, insan proangiogenic karşı anjiogenik monosit bir endotel monolayer inflamatuar sitokin TNFα yalnız veya anjiogenik faktör VEGFA ile birlikte tarafından uyarılan aracılığıyla hicret analiz ettik. İnsan proangiogenic monosit CD16 veya TIE2 ifade onların yüzeyi tarafından tespit edilebilir. Burada, anti-CD16-PE antikor pro - ve sigara-anjiogenik monosit arasında ayırımcılık için kullanıldı. Şekil 5A-B (tamamlayıcı Filmler 4-5), CD16 hicret oranı gösterildiği gibi⁺ endotel hücreleri ile TNFα sadece uyardığında monosit düşük. Ancak, endotel hücreleri aynı anda TNFα ve VEGFA (Şekil 5C-E, tamamlayıcı Filmler 6-7) ile teşvik zaman bu oranı arttı. Sigara anjiogenik monosit hicret oranı altında tahrik edici koşulların her ikisi de benzer şekilde yüksek oldu. Her iki hücre altgrupları için hicret sadece paracellular yönlendirme yolu oluştu. Bu yöntem bu nedenle aynı anda araştırılması için farklı Monositik nüfus hicret yetenek için izin verir.

Monosit saflığı hicret verimliliği etkiler

Periferik kan mononükleer hücreler T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monosit oluşmaktadır. Burada kullanılan monosit yalıtım yöntemini PBMC diğer lökosit gruplarından tükenmesi gerektirir. Monosit saflık eksikliği sonuçları etkilemesi anlamak için biz ve PBMCs kullanılan akış altında işe alım tahlil yapmadan önce pan-monosit bir anti-CD14-PE antikor ile lekeli. Şekil 6' da gösterildiği gibi HUVEC stimülasyon ile TNFα ya da TNFα + VEGFA sadece monosit nüfus hicret indüklenen. Diğer lökositler T hücreleri oluşur, B hücreleri ve NK hücreleri TNFα veya TNFα + VEGFA altında transmigrate değil. Nitekim, bu lökosit hicret için diğer sinyalleri gerekir belgelenmiştir. Böylece, diğer lökositler monosit sayılması gibi monosit verimsiz bir yalıtım monosit hicret, bir küçümseme için yol açacaktır. Bu monosit hicret, monosit nüfus ile diğer lökositler kirlilik nedeniyle hatalı bir sonuca yol açacak.

Şekil 1: izole monosit akış sitometresi tarafından profil oluşturma. (A)Analizi PBMC morfoloji lenfosit tükenmesi önce. Boyutu (ileri dağılım: FSC) ve parçalı yapı (yan dağılım: SSC) periferik kan mononükleer hücreler akış sitometresi tarafından belirlenmiştir. (B) taneciklik'izole monosit ve boyutu lenfosit tükenmesi sonra akış sitometresi tarafından belirlenmiştir. Monosit verimli bir yalıtım lenfosit nüfusun tam bir azalma gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: sıvı sistem diyagramı. (A)önce ve sonra slayt ve montaj şırınga pompa üzerinde bağlantı perfüzyon sistemi şematik bakış. (B) diyagram slayt kelepçeler kullanılarak boru ile bağlanma işleminin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: endotel hücreleri verimli aktivasyonu denetimi. HUVEC aktivasyon inflamatuvar uyaranlara tarafından faz kontrast mikroskobu kullanarak hücre şekli analiz ederek kontrol edildi. Tedavi 6 saat sonra HUVEC mevcut ile TNFα uyardığında uzun bir morfoloji (500 U/mL) ya da TNFα karışımı (500 U/mL) + VEGFA (1 µg/mL) unstimulated hücrelere kıyasla. İnflamatuar stimülasyon takip HUVEC morfolojik bu değişimin bir algılamak kolay akışı tahlil için sağlanmış olur Hücre aktivasyonu göstergesidir. Ölçek çubuğu 120 µm = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: confocal mikroskobu tarafından transmigrated monosit tanımlaması. (A)diyagramı monosit hicret apikal ve bazal uçaklar, beklenen manzaralı. Höchst 33342 ile lekeli monosit çekirdekleri mavi olarak tasvir edilir ve monosit teorik şekiller çekirdeklerin çevresinde kesik çizgiler ile tasvir edilir. Bazal görünümünde transmigrated düz monosit endotel hücre altında bir boşluk işgal etmek gösterilir. Bu alan bir kara delik confocal görüntülerde monosit çekirdeği çevreleyen olarak görünür. (B) yerelleştirme bir monosit önce ve sonra hicret. Ortogonal sayısı gösterilir ve bir kara delik (beyaz kesikli çizgi ile belirlenen) görünümünü endotel abluminal yuvası monosit geçişten sonra görülebilir. Kırmızı bir ok ucu monosit hicret önce konumunu gösterir ve beyaz ok ucu hicret sonra aynı hücreyi gösterir. Ortogonal sayısı transmigrated monosit endotel hücre altında olduğunu gösteriyor. Ölçek çubuğu 40 µm. (C) hızlandırılmış görüntü dizileri (0 20 dk) dan monosit işe alım fazla mesai =. Apikal ve bazal sayısı gösterilir. Tam dizileri Tamamlayıcı film 1, 2 ve 3'degörülebilir. Kırmızı kareler mavi çekirdeği ile bir transmigrated monosit vurgulayın. Monosit endotel hücre altında düz gövdesini karşılık gelen kara delik kesikli sarı çizgi tarafından belirlendi. Ölçek çubuğu 40 µm. (D) = miktar TNFα uyarılmış karşı için monosit yapıştırılması zaman içinde HUVEC unstimulated. Zaman içinde (E) miktar monosit hicret oranı. N = 3 biyolojik çoğaltır. Ortalama ± SD sunulan verilerin Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: monosit altgrupları akış altında hicret eş zamanlı soruşturma. (A)hızlandırılmış görüntü dizisi proangiogenic monosit alımı (20 dk 0) dan (CD16⁺) ve sigara anjiogenik monosit TNFα aktif HUVEC ile zaman içinde. Ölçek çubuğu 40 µm; = apikal ve bazal sayısı gösterilir. Tam dizileri için Tamamlayıcı film 4 görülebilir apikal ve bazal Gösterim için Tamamlayıcı film 5 . (B) Nefelometri insan proangiogenic monosit hicret, (HPMo: CD16 +) ve insan sigara anjiogenik monosit (HNMo) ile TNFα harekete geçirmek HUVEC monolayer. N = 4 biyolojik çoğaltır, ortalama ± SD sunulan verilerin * p < 0,05; Mann-Whitney testi. Fazla mesai ile TNFα + VEGFA aktif HUVEC proangiogenic ve sigara anjiogenik monosit alımı (C) hızlandırılmış görüntü dizisi (0 20 dk) dan. Ölçek çubuğu 40 µm; = apikal ve bazal sayısı gösterilir. Tam dizileri için Tamamlayıcı film 6 görülebilir apikal ve Tamamlayıcı film 7 bazal Gösterim için. İnsan proangiogenic monosit hicret (D) Nefelometri (HPMo: CD16 +) ve insan sigara anjiogenik monosit (HNMo: CD16-) TNFα + VEGFA-harekete geçirmek HUVEC monolayer aracılığıyla. N = 4 biyolojik çoğaltır, ortalama ± SD sunulan verilerin * p < 0,05; Mann-Whitney testi. (E) CD16 yerelleştirme⁺ monosit (10 dakika) önce ve sonra (15 dk) hicret ile TNFα + VEGFA teşvik HUVEC. Ortogonal sayısı gösterilir. Ölçek çubuğu 40 µm = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: Hicret CD14 + karşı CD14 - PBMC akış altında aynı anda incelenmesi. (A)CD14 yapışma⁺karşı CD14^- PBMC akış altında TNFα harekete geçirmek HUVEC için. (B) CD14 yapışma⁺karşı CD14^- PBMC HUVEC akış altında TNFα + VEGFA-harekete geçirmek için. (C) hicret oranı (%) CD14⁺karşı CD14^- PBMC TNFα harekete geçirmek HUVEC akış altında aracılığıyla. (D) hicret oranı (%) CD14⁺karşı CD14^- PBMC ile TNFα + VEGFA-harekete geçirmek HUVEC akış altında. Veri çoğu ortalama ± SD N = 4 biyolojik çoğaltır. * p < 0,05; Mann-Whitney testi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 1: akış altında pan-monosit alımı apikal uçak manzaraya. Genişletilmiş görünümü pan monosit apikal uçak, akış altında alımı. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. Ölçek çubuğu 50 µm = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Movie 2: akış altında pan-monosit alımı bazal uçak manzaraya. Genişletilmiş görünümü pan monosit bazal uçak, akış altında alımı. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. Ölçek çubuğu 50 µm = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 3: z-pan-monosit işe akış altında yığınları maksimal projeksiyon. Genişletilmiş görünümü pan monosit Tamamlayıcı film 1 ve 2gösterildiği gibi akış altında alımı. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. Ölçek çubuğu 50 µm = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 4: monosit altgrupları TNF için işe alım apikal uçak manzarayaα-HUVEC aktive. Monosit altgrupları akış altında eşzamanlı alımı apikal uçak manzaraya TNFα harekete geçirmek HUVEC akış altında genişletti. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. İnsan proangiogenic monosit altgrupları CD16 yüzey ifade tarafından tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 30 µm. = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 5: monosit altgrupları TNF için işe alım bazal uçak manzarayaα-HUVEC aktive. Bazal boyutunda monosit altgrupları TNFα harekete geçirmek HUVEC akış altında akışına altında eşzamanlı alımı, genişletilmiş görünüm. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. İnsan proangiogenic monosit (HPMo) subpopulation CD16 yüzey ifade tarafından tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 30 µm. = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 6: monosit altgrupları TNF için işe alım apikal uçak manzarayaα+ VEGFA-harekete geçirmek HUVEC. Apikal boyutunda monosit altgrupları TNFα + VEGFA-harekete geçirmek HUVEC akış altında akışına altında eşzamanlı alımı, genişletilmiş görünüm. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. İnsan proangiogenic monosit subpopulation CD16 yüzey ifade tarafından tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 30 µm = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 7: monosit altgrupları TNF için işe alım bazal uçak manzarayaα+ VEGFA-harekete geçirmek HUVEC. Bazal boyutunda monosit altgrupları TNFα + VEGFA-harekete geçirmek HUVEC akış altında akışına altında eşzamanlı alımı, genişletilmiş görünüm. HUVEC CMFDA ile lekeli ve monosit çekirdekleri yaşamak-lekeli Höchst ile 33342. İnsan proangiogenic monosit (HPMo) subpopulation CD16 yüzey ifade tarafından tespit edilmiştir. Ölçek çubuğu 30 µm = bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Burada, bir yöntemi nasıl monosit altgrupları iltihaplı endotel monolayer transmigrate bir çalışma ayrıntılı raporu. Confocal mikroskobu Ayrıca monosit işe akışı^3,11,19altında incelemek için kullanılır faz kontrast mikroskobu yerine kullanılan çok tartışılan yöntem. Confocal Mikroskopi için hızlandırılmış Imaging'i kullanma bir büyük avantajı belirsizliğe yer bırakmadan hicret ve güçlü yapışma monosit arasında ayırımcılık için yeteneğidir. Faz kontrast mikroskobu tabanlı yöntemi de sağlam olmasına rağmen transmigrated hücreleri ve güçlü yapışık hücreleri karıştırma önlemek için uzmanlık gerektirir. Bu durumda, bir analiz için sıkı kriterleri monosit işe alım cascade bu iki devlet arasında açık bir fark yaratmak için kurmak gerekiyor. Buna ek olarak, tarafından confocal mikroskobu faz kontrast mikroskobu tarafından gözlenen küresel eğilimler onaylamak için bir bitiş noktası analizi yapmak önemlidir. Böylece, monosit işe akış altında araştırmak için confocal mikroskobu direkt kullanımı yakalanan monosit gerçek hicret durumunu net sonuçlar sağlar.

Bir lökosit işe yürütme içinde büyük performans sorunlarını altında akış deneyleri ve faz kontrast mikroskop kullanarak çözümlemeyi gerçekleştirmek ve tek tek hücreler için hicret hücre-hücre Kavşağı ile çekim modundan izlemek için harcanan zaman artmaktadır. Böyle analiz Otomasyon mümkün ama tarama ve transmigrated monosit arasındaki faz kontrast benzerlikler nedeniyle gerçekleştirmek zor değil. İşte confocal mikroskobu kullanılarak göstermektedir monosit hicret endotel hücre HUVEC altında transmigrated monosit şeklinde karşılık gelen bazal düzlemde boyama kesilmesi eşlik etti. Bu konumlandırma orthogonal projeksiyon tarafından doğrulandı. Monosit yerelleştirme geçiş sadece hücre-hücre kavşaklar arasında bir paracellular hicret gösterge oluştu. Bu akış altında in vitro HUVEC^3,18paracellular rota üzerinden sadece monosit transmigrate gösterdi ki bizim önceki veriler ile tutarlıdır. Önerilen yöntem tamamlayacak burada, o VE-cadherin, reçel veya PECAM1 gibi bileske proteinler karşı antikor engellenmeyen resim monosit hicret (transcellular vs. paracellular) potansiyel siteler için kullanmak mümkündür. Biz monosit çekirdeği çevreleyen siyah şekiller güçlü özelliği transmigrated hücreleri ve yazılımı tarafından tespit olabilir basit bir olay olduğunu doğruladı. Sayma sistemi el ile hücre aşağıda gösterildiği halde, lökosit çekirdeği etrafında siyah şekli oluşumu lökosit hicret otomatik analizi, böylece çok fazla zaman tasarrufu tanımlamak için kullanılan olabilir bir kriterdir. Bu tip çözümlemeler için otomatik uygulama geliştirme üzerinde çalışmakta olduğunuz.

Daha önce floresans ve confocal mikroskobu lökosit işe alım çalışmada kullanılmıştır. Ancak, onlar aynı anda farklı altgrupları alımı araştırmak için kullanılan değildi. Burada aynı anda aynı microenvironment içinde lökosit alt türlerinden alımı çalışmaya confocal mikroskobu kullanımının bir modalite öneriyorum. Biz o confocal mikroskobu aynı anda farklı monosit altgrupları göç davranışlarını incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Örneğin, farklı inflamatuar bağlamlarda iki altgrupları hicret kapasitesi çalışma için proangiogenic ve sigara anjiogenik monosit arasında ayırımcılık için CD16 ifade kullandık. Confocal mikroskopi yöntemi kullanarak bizim son yayın ile tutarlı biz CD16 hicret oranı göstermiştir⁺ endotel hücre monolayer tarafından sadece³TNFα uyardığında monosit daha düşük. Ancak, TNFα ve VEGFA ile birlikte proangiogenic monosit hicret bir artışa yol açtı. Hicret oranı sigara anjiogenik CD16 için benzer şekilde yüksek^- monosit inflamatuar koşulların her ikisi de altında. Biz daha önce monosit ile anti-CD16 antikor boyama hicret üzerinde önemli bir etkisi mevcut değil bu confocal mikroskobu³kullanarak sonra hicret tahlil, etiketlenmemiş monosit analiz tarafından teyit göstermiştir. Ancak, yeni lökosit alt türlerinden veya onları işaretlemek için kullanılan antikorlar için etiketleme etkisi değerlendirilmek gerekir. Bu yöntemi kullanarak, lökosit üç farklı topluluklarda kadar aynı anda okudu. Bu işlevsel olarak ayrı veya benzer bağışıklık hücre türleri altgrupları olabilir. Odak burada monosit hicret üzerinde olsa da, diğer adımları kendi alımı da hücre davranış hicret, yakalama ve migrational yön gibi daha önce de dahil olmak üzere bu yöntemi tarafından analiz edilebilir. Abluminal saklama ve geriye doğru hicret gibi sonrası hicret olaylar da bu yöntem bir uzantısı olarak farklı lökosit nüfus için soruşturma. Hızlandırılmış görüntüleme yanı sıra bazı overspill z-yığın çözünürlüğünü düşürün floresans sinyallerin far-red kanaldaki boyama zavallı algılama bir kısıtlamadır. Bu esas olarak confocal görüntüleme için kullanılan araç ile ilgili. Görüntü deconvolution kullanımı sonunda görüntü kalitesini artırmak ve daha fazla lökosit alımı farklı adımları analizine izin vermek için yardımcı olabilir.

Lökosit işe en uygun koşullarda çalışmaya, endotel hücre monolayer etkinleştirme durumunu denetlemek önemlidir. Nitekim, endotel hücreleri eksik bir aktivasyon monosit yapışma ve hicret genel bir azalma yol açar. Endotel hücre aktivasyonu endotel hücre yüzeyi ICAM1 ve VCAM1 gibi adezyon molekülleri ifade düzeyini analiz ederek kontrol edilebilir. Bu adezyon molekülleri artırılması gerekiyor unstimulated endotel hücrelere kıyasla düzeyi. Herhangi bir değişiklik bu endotel adezyon molekülleri tespit ise, kültürlü HUVEC kabul edilebilir olarak değil harekete geçirmek. Adezyon molekülleri ifade düzeyini değerlendirmek HUVEC aynı toplu işlem kullanarak farklı deneyler arasında iyi bir nicel denetim oluşturan. Ancak, bu adezyon molekülleri ifade düzeyini de endotel hücreleri ICAM1 veya VCAM1 küresel bir eşiği değerlendirilmesi sınırlayıcı farklı birincil kültür arasında değişebilir. HUVEC gibi tekrarlamışlar endotel hücrelerinin şekli değişikliği de onların harekete geçirmek iyi bir göstergesidir. Fenotip bu ikinci değişiklik HUVEC etkinleştirme hızlı ve nitel bir değerlendirmesini sağlar. Ancak, analysis adezyon molekülleri üzerine harekete geçirmek inflamatuar sitokinlerin ile büyük şekil değişikliği gösterme mikrovasküler hücreler için daha iyi bir seçim olabilir.

Mekanik çalışmaları için monosit hicret ilgili negatif kontrolleri endotel adezyon molekülleri lökosit yüzeyi gibi lökosit işlev ilişkili antijen (LFA) -1 veya ICAM1, VCAM1 gibi karşı antikor kullanılarak gerçekleştirilir. İlgili bir negatif kontrol kullanımı gibi onların hücre yüzeylerinde Fc-reseptörleri hızlı monosit böyle mekanik çalışma için gerekli olduğunu. Monosit yalıtım sonra saflığı da diğer lökosit nüfus ve monosit hicret oranının bir küçümseme kirlenmesini önlemek için önemlidir. Başka bir kritik parametre tüm deneysel gözlemler alakalı olduğundan emin olmak için tüm deneyleri için 37 ° C'de ayarlanması ve buna göre için insan vivo hücre kaçakçılığı çevirmek gerekir sıcaklığıdır.

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Dr Paul Bradfield okuma el yazması ve geri bildirimler için teşekkür ederiz. A. S., efendim Jules Thorn hayırsever yurtdışı güven trafiğe çıkış mali destek aldı.