Method Article
在这里, 我们提出了一个综合协议, 测量单核细胞亚群贩运在流在体外使用特定的表面标记和共聚焦荧光显微镜。该协议可用于探索顺序招募步骤, 以及使用其他特定的表面标记来描述其他白细胞亚型。
在组织损伤、肿瘤发育和自身免疫性疾病的过程中, 从血液中招募单核细胞到靶向外周组织对炎症过程至关重要。这是通过捕获过程从自由流动到腔表面的激活内皮细胞, 其次是他们的粘附和内皮迁移 (转移) 到底层受影响的组织。然而, 支持优先和与上下文相关的单核细胞亚群招募的机制仍未得到充分理解。因此, 我们开发了一种方法, 允许在流量下同时对不同单核细胞亚群的招募进行可视化和测量。这种基于延时共聚焦成像的方法允许在粘附体和迁移单核细胞之间进行明确的区分。在这里, 我们描述了如何使用这种方法可以同时研究招募的亲血管生成和非血管生成单核细胞在体外。此外, 这种方法还可以推广到研究最多三个单核细胞种群的不同招募步骤。
单核细胞是先天免疫的吞噬成分, 对于对抗病原体、清理受损组织、血管生成以及包括癌症在内的许多疾病的病理生理学至关重要..单核细胞是由异质亚群组成的骨髓细胞, 在血液中循环, 但可以通过特定的分子机制被招募到外周组织的炎症部位。与一般白细胞一样, 单核细胞的招募级联涉及不同的步骤, 包括捕获、滚动、爬行、逮捕、内皮迁移 (转移) 和通过血管壁 (基底膜和壁画) 的迁移单元格)4。这些步骤主要涉及炎症引起的内皮腔表面的分子, 如选择、糖蛋白配体、趋化因子、细胞间和结合粘附分子, 以及它们对白细胞的受体, 如选择性配体和整合。通过内皮细胞连接 (脱细胞后) 或通过内皮细胞体 (跨细胞) 的贩运途径可被白细胞用于跨越内皮屏障5。虽然历史上有记录表明单核细胞通过跨细胞途径迁移, 但由于单核细胞不再被视为同质细胞群, 它们迁移途径中的潜在差异已被提出。现在越来越清楚的是, 单核细胞多样性可以通过它们的每一个差异和共性来定义, 就它们独特的外渗级联 3,6。因此, 为了明确区分单核细胞亚群, 在招募过程中, 将这些不同亚群的行为形象化和表型是至关重要的。
将人、猪、大鼠和小鼠的单核细胞细分为表型亚群, 具有一定的归因功能和特定的迁移行为7,8,9。例如, 在人类中, 单核细胞可以根据其表面表达的 cd14 (细菌脂多糖的核心受体) 和 cd16 (fc-γ受体 iii) 分为三个子集。人类单核细胞亚群包括经典 cd14+cd16-、中间 cd14+cd16+和非经典 cd14 暗淡 cd16+细胞6,9。经典 cd14+cd16-单核细胞主要具有炎症性, 而 cd16 + 单核细胞池被共同发现为 tie2表达和血管生成功能10。持续, 内皮细胞刺激与炎症细胞因子, 如人类肿瘤坏死因子 (tnf) α或白细胞介素 (il-1)beta (常规炎症) 足以引发经典 cd14+cd16 的完全招募-单核细胞然而, 血管内皮生长因子 (vegf) a 和 tnfα (血管生成因子引起的炎症) 同时作用, 是引发 cd16 + 单核细胞血管生成池 3的迁移.从历史上看, 传统的跨井系统在静态条件下, 平行板流动室和μ-滑动流室已被用来定量分析在体外一次招募一个白细胞群 11 ,12,13。虽然这些方案已经得到验证, 一个更强大的方法, 允许同时分析多个单核细胞亚群将被认为更有见地。这种方法必须考虑到多个相互作用和每个群体的不同频率, 并提供机械地理解定义每个单核细胞的招募级联的相似性和特殊性子集。
本文提出了一种基于流动过程中单核细胞招募延时成像的方法, 该方法可以利用共聚焦显微镜同时研究不同单核细胞亚群的迁移级联。该方法结合了某些关键特征, 模仿内皮细胞炎症, 以及在毛细血管后静脉循环单核细胞的血流动力学, 白细胞在体内招募的主要位置。该方法使用人脐静脉内皮细胞 (huvec), 这是通过与人脐带分离的既定协议产生的。这种临床资源的优点是很容易作为生物副产品获得, 同时也提供了一个合理的内皮细胞产量, 可以从脐静脉分离。我们还使用荧光染料和免疫荧光来区分不同的细胞成分, 并使用共聚焦显微镜明确定义单核细胞定位 (腔内与烧黑细胞) 随着时间的推移。本文所介绍的协议是为了同时测量单核细胞亚群的迁移水平而制定的。此外, 应当指出, 这种方法可以通过使用不同的生物标志物和标签, 扩大到研究其他白细胞亚群和招募过程。
人类材料是在自愿捐助者知情同意的情况下, 根据瑞士临床研究道德委员会使用的。
1. 人脐静脉内皮细胞的分离和冷冻 (huvec)
2. huvec 除霜
请注意:在低通道下使用 huvec 进行实验 (最多5个通道)。
3. 0.4 μ-sut 室中的 huvec 培养
4. huvec 染色用于流动下单核细胞的招募检测
5. 人的泛单核细胞的分离和亚群的染色
6. 流体系统的制备
7. 共聚焦显微镜下单核细胞在流动中的延时成像
8. 使用映像分析数据 j
tnfα诱导 huvec 活化状态的测定
炎症细胞因子 tnfα的生物活性可根据冻融循环的批次和重复而变化。tnfα治疗对 huvec 的活化状态进行检查是非常重要的。这可以通过平行染色的一些融合 huvec 样品进行炎症诱导选择, icam-1 和 vcam-115,16,17。一种更简便的方法来检查 tnfα治疗后 huvec 的激活状态是内皮细胞在炎症应激下表现出的形态变化。如图 3所示, 与未受刺激的细胞相比, 在 tnfα存在的情况下, huvec 在6小时后伸长。当 huvec 受到 tnfα和 vegfa 的混合刺激时, 也会观察到类似的伸长率。记录 huvec 的活化状态是很重要的, 因为单核细胞的迁移的最终结果将取决于内皮细胞活化的质量。
单核细胞转染使内皮细胞有特征性停运
为了研究单核细胞在流动下的迁移, 我们使用了用 cmfda 染色的内皮细胞和用细胞渗透道33342染料染色的孤立单核细胞的细胞核 (图 4)。延时共聚焦成像允许在顶端平面上的单核细胞的可视化, 在那里可以评估它们的表型 (图 4a-c, 补充电影 1)。正在进行迁移的迁移细胞在从顶端平面消失并出现在基部平面之前, 移动到与细胞连接相对应的细胞间空间。被迁移的细胞在细胞核周围呈现一个与单核细胞形状相对应的黑洞。这种形状在内皮细胞下的单核细胞迁移过程中不断改变 (图 4a-c, 补充电影 2-3)。这种由内皮细胞下的单核细胞体形成的动态黑洞, 以及单核细胞的定位, 使得迁移细胞的明确识别成为可能。随着时间的推移, 单核细胞招募量显示单核细胞粘附, 然后是迁移 (图 4d-e)。虽然白细胞可以通过细胞外和细胞外的途径外渗, 我们只能观察到在流动下的细胞外迁移与这种方法。这与我们先前的意见3、11、18、19是一致的。
血管生成因子引起的炎症促进 cd16 + 单核细胞的迁移
利用该方法, 我们分析了人类血管生成与非血管生成单核细胞的迁移通过内皮单层刺激的炎症细胞因子 tnfα单独或结合血管生成因子 vegfa。人类血管生成单核细胞可以通过其表面 cd16 或 tie2 的表达来识别。在这里, 抗 cd16-pe 抗体被用来区分原生和非血管生成单核细胞。如图 5a-b(补充电影 4-5)所示, 仅用 tnfα刺激内皮细胞时, cd16+单核细胞的迁移率较低。然而, 当内皮细胞与 tnfα和 vegfa 同时刺激时, 这一比率增加 (图 5c-e, 补充电影 6-7)。在这两种炎症条件下, 非血管生成单核细胞的迁移率同样很高。对于这两个细胞亚群, 输血完全是通过细胞后的途径进行的。因此, 这种方法可以同时研究不同单核细胞种群的迁移能力。
单核细胞的纯度对转染效率的影响
外周血单个核细胞由 t 细胞、b 细胞、nk 细胞和单核细胞组成。这里使用的单核细胞分离方法要求 pbmc 耗尽其他白细胞群。为了了解单核细胞纯度的缺乏对结果的影响, 我们在进行流动下的招募试验之前, 使用了 pbmc 和具有抗 cd14-pe 抗体的泛单核细胞染色。如图 6所示, tnfα或 tnfα+ vegfa 刺激导致仅单核细胞种群的迁移。由 t 细胞、b 细胞和 nk 细胞组成的其他白细胞在 tnfα或 tnfα+ vegfa 下没有迁移。事实上, 有文献记载, 这些白细胞需要其他信号来进行输血。因此, 对单核细胞的低效分离将导致对单核细胞迁移的低估, 因为其他白细胞将被视为单核细胞。这将导致单核细胞迁移的错误结果, 由于单核细胞群与其他白细胞的污染。
图 1: 流式细胞仪分析分离单核细胞。(a) 淋巴细胞耗尽前 pbmc 的形态分析。采用流式细胞仪测定外周血单个核细胞的大小 (正向散射: fsc) 和粒度 (侧向散射: ssc)。(b) 淋巴细胞耗尽后, 流式细胞仪测定分离单核细胞的大小和粒度。单核细胞的有效分离显示淋巴细胞群的完全枯竭。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 流体系统示意图.(a) 在连接滑块和安装在注射器泵上之前和之后的灌注系统示意图。(b) 使用夹具将滑块与油管连接的过程示意图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 检查内皮细胞的有效激活.采用相对比显微镜分析细胞形态, 检查炎症刺激对 huvec 的活化作用。经过6小时的处理, 与未受刺激的细胞相比, 在 tnfα (500 uml) 或 tnfα (500 uml) + vegfa (1μgl) 的混合刺激下, huvec 呈现拉长的形态。炎症刺激后 huvec 的这一形态变化是细胞活化的一个易于检测的指标, 应确保流动检测。刻度栏 = 120μm 请点击此处查看此图的较大版本.
图 4: 用共聚焦显微镜鉴定迁移的单核细胞.(a) 单核细胞迁移图, 其预期视图在顶端和基面上。用 hoechst 33342 染色的单核细胞的细胞核被描绘为蓝色, 单核细胞的理论形状被描绘为在细胞核周围的虚线。在基底视图中, 被迁移的扁平单核细胞被显示为在内皮细胞下占据一个空间。这个空间在共聚焦图像上表现为一个黑洞, 围绕着单核核。(b) 单核细胞在迁移前后的定位。显示了正交视图, 并观察到一个黑洞的外观 (用白色虚线划定) 后, 单核细胞迁移到内皮性室。红色箭头表示单核细胞在移植前的位置, 白色箭头表示移植后相同的细胞。正交试验结果表明, 迁移的单核细胞位于内皮细胞下方。刻度杆 = 40μm (c) 单核细胞招募加班延时延时延时延时图像序列 (从0分钟到 20分钟)。显示了顶端和基本视图。完整的序列可以在补充电影 1, 2 和 3中看到。红色方块突出了一个带蓝色细胞核的迁移单核细胞。与内皮细胞下单核细胞扁平体相对应的黑洞是用一条黄线划定的。结垢杆 = 40μm. (d) 随着时间的推移, 单核细胞对 tnfα受激的粘附与未受刺激的 huvec 的数量. (e) 单核细胞随次迁移率的定量。n = 3个生物复制。数据显示为平均值± s. d. 请点击此处查看此图的较大版本.
图 5: 同时研究流动下单核细胞亚群的迁移.(a) 随着时间的推移, 通过 tnfα激活的 huvec 招募血管生成单核细胞 (cd16+) 和非血管生成单核细胞的延时图像序列 (从0分钟到 20分钟)。刻度杆 = 40μm;显示了顶端和基本的视图。完整的序列可以看到在补充电影4的顶端和补充电影 5的基础视图。(b) 通过 tnfα激活的 huvec 单层对人类血管生成单核细胞 (hpmco:cd16+) 和人类非血管生成单核细胞 (hnmo) 的迁移进行定量。n = 4个生物复制, 数据显示为平均值±s. d. * p & lt; 0.05;曼恩-惠特尼测试。(c) 通过 tnfα + vegfa 激活的 huvec 加班的血管生成和非血管生成单核细胞的招募时滞图像序列 (从0分钟到 20分钟)。刻度杆 = 40μm;显示了顶端和基本的视图。完整的序列可以看到在补充电影6的顶端和补充电影 7的基础视图。(d) 通过 tnfα + vegfa 激活的 huvec 单层对人类血管生成单核细胞 (hpmo:cd16 +) 和人类非血管生成单核细胞 (hnmo:cd16--) 的迁移进行定量。n = 4个生物复制, 数据显示为平均值±s. d. * p & lt; 0.05;曼恩-惠特尼测试。(e) cd16 + 单核细胞在 (10分钟) 和 (15分钟) 迁移之前和之后通过 tnfα + vegfa 刺激的 huvec 进行定位。将显示正交视图。刻度栏 = 40μm 请点击此处查看此图的较大版本.
图 6:d. 同时调查 cd14+ 与流中的 cd14-pbmc 的迁移。cd14+与 cd14-pbmcc在流动下粘附 tnfα激活的 huvec.(b) cd14+ 与cd14-pbmc 在流动下对 tnfα+ vegfa 激活的 huvec 的粘附。(c) cd14 + 与 cd14-pbmcm的迁移率 (%) 在流量下通过 tnfα激活的 huvec。(d) cd14+与 cd14-pbmcmc 通过 tnfα + vegfa 激活的 huvec的迁移率 (%)。数据为平均值±s. d. n = 4个生物复制。* p & lt; 0.05;曼恩-惠特尼测试。请点击这里查看此图的较大版本.
补充电影 1: 在泛单核细胞招募的顶端平面上查看流动.在顶端平面流动下招募泛单核细胞的扩展视图。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。刻度栏 = 50μm请点击这里下载此文件.
补充电影 2: 在泛单核细胞招募的基面上查看流动.在基部平面动的平底锅单核细胞的招募的扩展视图。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。刻度栏 = 50μm请点击这里下载此文件.
补充电影 3: 最大投影的 z 堆栈的泛单核细胞招募流动.如补充电影1和2所示, 扩展了在流动下招募平底锅单核细胞的观点。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。刻度栏 = 50μm请点击这里下载此文件.
补充电影 4: 在顶端平面上查看 tnfα激活的huvec 单核细胞亚群的吸收.在顶端平面的顶面同时招募单核细胞亚群在流动下 tnfα激活的 huvec 流动。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。通过 cd16 的表面表达, 确定了人的血管生成单核细胞亚群。刻度栏 = 30μm. 请点击此处下载此文件.
补充电影 5: 在选择单核细胞亚细胞亚群的基础平面上查看tnfα激活 huvec.在基面上, 扩大视图, 即同时招募流中的单核细胞亚群, 使其成为流动下的 tnfα激活的 huvec。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。通过 cd16 的表面表达, 鉴定了人的血管生成单核细胞 (hpo) 亚群。刻度栏 = 30μm. 请点击此处下载此文件.
补充电影 6: 在顶端平面上查看 tnfα+vegfa 激活的 huvec 单核细胞亚群的顶端平面.在顶端平面上, 扩展视图, 即在流量下同时招募单核细胞亚群, 以 tnfα + vegfa 激活的 huvec 在流动下。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。通过 cd16 的表面表达, 确定了人的血管生成单核细胞亚群。刻度栏 = 30μm请点击这里下载此文件.
补充电影 7: 在基础平面上查看 tnfα+vegfa 激活的 huvec 单核细胞亚群的招募.在基面上, 扩展视图, 同时招募流中的单核细胞亚群, 使其在流动下被 tnfα + vegfa 激活的 huvec。huvec 被 cmfda 染色, 单核细胞的细胞核被 hoechst 33342 染色。通过 cd16 的表面表达, 鉴定了人的血管生成单核细胞 (hpo) 亚群。刻度栏 = 30μm请点击这里下载此文件.
在这里, 我们报告了一个方法详细介绍了单核细胞亚群如何通过发炎的内皮单层迁移的研究。讨论的方法采用共聚焦显微镜代替相对比显微镜, 也用于研究流3、11、19 下单核细胞的招募。使用共聚焦显微镜进行延时成像的一个主要优点是能够明确区分单核细胞的迁移和强粘附。虽然基于相对比显微镜的方法也很稳健, 但它需要专业知识, 以避免混合迁移的细胞和强烈粘附的细胞。在这种情况下, 需要建立严格的分析标准, 以便在单核细胞招募级联的这两种状态之间做出明确的区别。此外, 还必须通过共聚焦显微镜进行端点分析, 以确认通过相位对比显微镜观察到的全球趋势。因此, 直接使用共聚焦显微镜来研究单核细胞在流动下的招募, 为捕获单核细胞的实际迁移状态提供了明确的结果。
在流动下进行白细胞招募检测和使用相对比显微镜的主要瓶颈之一是用于进行分析和跟踪单个细胞从捕获到通过细胞细胞连接的迁移所花费的时间。这种分析的自动化是可能的, 但由于爬行和迁移单核细胞之间的相位对比相似性, 很难执行。本文用共聚焦显微镜观察表明, 单核细胞迁移伴随着与 huvec 下迁移单核细胞形状相对应的基底平面内皮细胞染色的终止。正交投影证实了这一定位。单核细胞定位的转变完全发生在细胞间的连接之间, 表明细胞外迁移。这与我们之前的数据是一致的, 该数据显示, 在体外流动下, 单核细胞完全通过带 huvec3,18的细胞外途径迁移。为了补充这里提出的方法, 可以对连接蛋白 (如 ve-cadherin、jam 或 pecam1) 使用非阻断抗体, 以反映单核细胞转移 (细胞外与跨细胞) 的潜在位点。我们已经证实, 围绕单核细胞核的黑色形状是一个强大的特征, 迁移细胞和一个简单的事件, 可以检测到的软件。尽管这里演示了一个手动细胞计数系统, 白细胞核周围的黑色形状形成是一个标准, 可用于定义白细胞在自动分析中的迁移, 从而节省大量的时间。我们目前正在开发用于此类分析的自动化应用程序。
荧光和共聚焦显微镜以前用于白细胞的招募研究。然而, 它们没有被用来同时调查不同亚人口的招募情况。在这里, 我们提出了一种方法, 使用共聚焦显微镜, 以研究在同一微环境中同时招募白细胞亚型。我们表明, 共聚焦显微镜可用于同时研究不同单核细胞亚群的迁移行为。例如, 我们使用 cd16 表达来区分血管生成和非血管生成单核细胞, 以研究两个亚群在不同炎症环境下的迁移能力。与我们最近的出版物一致, 通过使用共聚焦显微镜模式, 我们已经表明, 当只有 tnfα3刺激内皮细胞单层时, cd16+单核细胞的迁移率较低.然而, tnfα和 vegfa 的结合导致血管生成单核细胞的迁移增加。在这两种炎症条件下, 非血管生成 cd16-单核细胞的转染率同样很高。我们以前已经证明, 单核细胞染色与抗 cd16 抗体没有表现出任何显著的影响, 这证实了通过分析未标记单核细胞后的转移试验, 使用共聚焦显微镜3。然而, 对于新的白细胞亚型或用于标记它们的抗体, 标记效果需要评估。使用这种方法, 最多可以同时研究三个不同的白细胞群。这可能是功能不同或相似的免疫细胞类型的亚群。虽然这里的重点是单核细胞的迁移, 他们的招募的其他步骤也可以通过这种方法进行分析, 包括细胞在迁移前的行为, 如捕获, 和迁移方向。作为这种方法的延伸, 也可以研究不同白细胞群的输血后事件, 如腔切除和反向迁移。其中一个限制是, 在延时成像中, 远红通道中的染色检测不足, 以及一些荧光信号溢出, 从而降低了 z 堆栈分辨率。这主要与用于共聚焦成像的仪器有关。使用图像反卷积最终可以帮助提高图像质量, 并允许进一步分析白细胞招募的不同步骤。
为了研究在最佳条件下的白细胞吸收, 检查内皮细胞单层的活化状态是非常重要的。事实上, 内皮细胞激活不足会导致全球单核细胞粘附和移植减少。通过分析 icam1 和 vcam1 等内皮细胞表面粘附分子的表达水平, 可以检测内皮细胞的活化。与未受刺激的内皮细胞相比, 这些粘附分子的水平必须提高。如果在这些内皮粘附分子中没有检测到任何变化, 培养的 huvec 可以被认为是不激活的。评估粘附分子的表达水平可以构成一个良好的定量控制之间的不同实验使用同一批 huvec。然而, 这些粘附分子的表达水平也可能因内皮细胞的不同原代培养而异, 从而限制了 icam1 或 vcam1 的全球阈值的考虑。huvec 等大血管内皮细胞形态的变化也是其激活的一个很好的指标。后一种表型的变化允许对 huvec 激活进行快速定性评估。然而, 对粘附分子的分析可能是微血管细胞的更好选择, 这些细胞在使用炎症细胞因子激活时不会显示出重大的形状变化。
对于机械研究, 单核细胞转染的相关阴性对照可以通过使用针对内皮粘附分子 (如 icam1、vcam1) 或白细胞表面 (如白细胞功能相关抗原 (lfa)-1 的抗体进行。使用相关的负控制对于单核细胞中的机械研究至关重要, 因为它们在细胞表面表达 fc 受体。分离后单核细胞的纯度也很重要, 以避免其他白细胞群的污染和对单核细胞迁移率的低估。另一个关键参数是温度, 所有检测都需要设置在 37°c, 以确保所有实验观测都是相关的, 并相应地转化为人体体内细胞贩运.
作者没有相互竞争的经济利益。
我们感谢保罗·布拉德菲尔德博士的手稿阅读和反馈。a. s. 得到了朱尔斯·索恩爵士慈善海外信托委员会的财政支持。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Culture Flasks 75 cm2 | TPP | 90076 | Routine culture of isolated HUVEC |
µ-Slide VI 0.4 | IBIDI | 80606 | |
Centrifuge Tubes 15 mL | TPP | 191015 | |
Centrifuge Tubes 50 mL | TPP | 191050 | |
Collagen G | Biochrom | L 7213 | For coating of cell culture flasks |
Gelatin | Sigma-Aldrich | 1393 | For coating of cell culture flasks |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
3-Way Stopcocks | BIO-RAD | 7328103 | |
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL | AMIMED | 4-02F00-H | |
Collagenase type 1 | Worthington | LS004216 | |
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes | GIBCO | 22340020 | |
Bovine Albumin Fraction V | ThermoFisher | 15260037 | |
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg | Millipore | 02-102 | |
Heparin Sodium | Sigma-Aldrich | H3149RT | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H6909 | |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A 4544 | |
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O | APPLICHEM | A2937.0500 | |
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC | Miltenyi Biotech | 130-100-713 | AB_2655150 |
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-807 | AB_2657280 |
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC | Miltenyi Biotech | 130-107-016 | AB_2653263 |
BD Accuri C6 Plus | BD Bioscience | ||
µ-Slide I Luer | IBIDI | 80176 | |
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate) | ThermoFisher | C2925 | |
Recombinant human TNFα | Peprotech | 300-01A | |
Recombinant human VEGFA | Peprotech | 100-20 | |
NE-1000 Programmable Syringe Pump | KF Technology | NE-1000 | |
Ficoll Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE | Miltenyi Biotech | 130-110-519 | AB_2655051 |
Pan Monocyte Isolation Kit, human | Miltenyi Biotech | 130-096-537 | |
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE | Miltenyi Biotech | 130-106-762 | AB_2655403 |
LS columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | ThermoFisher | H1399 | |
Silicone tubing | IBIDI | 10841 | |
Elbow Luer Connector | IBIDI | 10802 | |
Female Luer Lock Coupler | IBIDI | 10823 | |
Luer Lock Connector Female | IBIDI | 10825 | |
In-line Luer Injection Port | IBIDI | 10820 | |
Ar1 confocal microscope | Nikon | ||
40x objective | Nikon | 40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm | |
ImageJ Software | NIH |
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