Studio simultaneo del reclutamento di sottopopolazioni monocito sotto flusso In Vitro

Qui, presentiamo un protocollo integrato che misura sottopopolazione del monocito traffico sotto flusso in vitro mediante uso di specifici marcatori di superficie e microscopia a fluorescenza confocale. Questo protocollo consente di esplorare reclutamento sequenziale passaggi anche per quanto riguarda il profilo di altri sottotipi del leucocita utilizzando altri specifici marcatori di superficie.

Il reclutamento dei monociti dal sangue ai tessuti periferici mirati è fondamentale per il processo infiammatorio durante la lesione del tessuto, lo sviluppo del tumore e le malattie autoimmuni. Ciò è facilitato attraverso un processo di acquisizione da flusso libero sulla superficie luminale delle cellule endoteliali attivate, seguita da loro adesione e transendoteliale migrazione (Trasmigrazione) nel tessuto interessato sottostante. Tuttavia, i meccanismi che supportano l'assunzione preferenziale e dipendente dal contesto delle sottopopolazioni monocito ancora completamente non sono capiti. Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo che permette il reclutamento di sottopopolazioni monocito differenti per essere visualizzati e misurata sotto flusso contemporaneamente. Questo metodo, basato sull'imaging confocale time-lapse, consente la distinzione inequivocabile tra aderente e transmigrated monociti. Qui, descriviamo come questo metodo può essere utilizzato per studiare simultaneamente la cascata di reclutamento dei monociti pro-angiogenici e non-angiogenici in vitro. Inoltre, questo metodo può essere esteso per studiare le diverse fasi del reclutamento di fino a tre popolazioni di monociti.

Monociti costituiscono una componente fagocitica dell'immunità innata che è essenziale per combattere gli agenti patogeni, pulizia di tessuti danneggiati, l'angiogenesi e la fisiopatologia di molte malattie compreso i cancri^1,2,3 . I monociti sono cellule derivate da midollo osseo composte di sottopopolazioni eterogenee che circolano nel sangue, ma possono essere reclutate nel sito di infiammazione nel tessuto periferico attraverso specifici meccanismi molecolari. Le cascate di reclutamento dei monociti, per quanto riguarda i leucociti in generale, implica diversi passaggi tra cui cattura, rotolamento, strisciando, arresto, migrazione transendoteliale (Trasmigrazione) e migrazione attraverso la parete del vaso (membrana dello scantinato e murale di cellule)⁴. Questi passaggi comportano principalmente indotta da infiammazione molecole sulla superficie luminal endoteliale come selectine, glicoproteina ligandi, chemochine, molecole di adesione intercellulare e giunzionale e dei loro recettori sui leucociti quali selectina ligandi e le integrine. Vie di traffico attraverso giunzioni delle cellule endoteliali (paracellular) o attraverso il corpo delle cellule endoteliale (transcellular) possono essere utilizzate dai leucociti di attraversare la barriera endoteliale⁵. Mentre i monociti sono stati documentati storicamente trasmigrano attraverso la via transcellulare, potenziali divergenze nel loro percorso migratorio sono stati proposti come monociti non siano più considerati una popolazione omogenea delle cellule. Ora sta diventando chiaro che la diversità del monocito può essere definito da ciascuna delle loro differenze e somiglianze, per quanto riguarda il loro distintivo stravaso cascate^3,6. Pertanto, al fine di discriminare in modo inequivocabile le sottopopolazioni monocito, è fondamentale per visualizzare ed elaborare di fenotipo il comportamento di ciascuna di queste sottopopolazioni differenti durante il reclutamento.

Monociti da umano, maiale, ratti e topi sono stati suddivisi in sottopopolazioni fenotipiche con determinate funzioni ascritte e specifici comportamenti migratori^7,8,9. Ad esempio, in esseri umani, monociti possono suddividere in tre sottogruppi basati sulla loro superficie espressione di CD14, corecettore per lipopolisaccaride batterico e CD16, il ricevitore di Fc-gamma III. Sottopopolazioni monocito umano includono CD14 classica⁺CD16^-, intermedio CD14⁺CD16⁺ e tronchetti CD14^dimCD16 cellule^{+ 6,9}. Il CD14 classica⁺CD16^– monociti sono stati indicati per essere principalmente infiammatorie mentre la piscina di CD16⁺ monociti collettivamente sono stati trovati per presentare TIE2 espressione e proangiogenic funzione¹⁰. Coerentemente, la stimolazione di cellule endoteliali con citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale umano fattore α (TNF) o interleuchina (il-1) beta (convenzionale infiammazione) è sufficiente a far scattare la completa assunzione di CD14 classica⁺CD16 ^– monociti. Tuttavia, sono necessari per provocare la trasmigrazione del CD16 azioni simultanee di A di fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e TNFα (infiammazione guidata da fattori angiogenici)⁺ proangiogenic piscina di monociti³. Storicamente, il sistema tradizionale di Transwell in condizioni statiche, la camera di flusso di piatti paralleli e gli alloggiamenti di flusso µ-diapositiva sono stati usati per analizzare quantitativamente il reclutamento della popolazione uno leucocitaria a un tempo in vitro^{11 ,12,13}. Mentre questi protocolli sono stati convalidati, un metodo più robusto che ha permesso l'analisi simultanea di più sottopopolazioni monocito sarebbe considerato più penetrante. Tali metodologie devono rappresentano interazioni multiple e le diverse frequenze di ogni rispettiva popolazione e anche fornire una comprensione meccanicistica delle affinità e specificità per le cascate di reclutamento che definiscono ogni monocito sottoinsieme.

Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging time-lapse del reclutamento di monociti sotto flusso che permette le cascate migratori delle sottopopolazioni monocito diverso da studiare simultaneamente mediante microscopia confocale. Questo metodo integra alcune caratteristiche critiche che imitano l'infiammazione delle cellule endoteliali, come pure l'emodinamica di fare circolare i monociti in venule post-capillari, la sede principale del reclutamento dei leucociti in vivo. Il metodo proposto utilizza cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC), che vengono generate attraverso un protocollo ben consolidato di isolamento dal cordone ombelicale umani. Questa risorsa clinica ha il vantaggio di essere facilmente disponibile come sottoprodotto biologico, fornendo inoltre un rendimento ragionevole delle cellule endoteliali che può essere isolato dalla vena ombelicale. Abbiamo anche usato tinture fluorescenti e immunofluorescenza per distinguere tra i diversi componenti cellulari e microscopia confocale per definire inequivocabilmente monocito posizionamento (luminal vs abluminale) nel corso del tempo. Il protocollo qui presentato è stato sviluppato simultaneamente misurare i livelli di trasmigrazione delle sottopopolazioni monocito. Inoltre, si deve osservare che questa metodologia può essere esteso per studiare altre sottopopolazioni di leucociti e processi di reclutamento mediante uso di diversi biomarcatori ed etichettatura.

Materiali umani sono stati utilizzati con il consenso informato dei donatori volontari e in conformità con i comitati di etica svizzero sulla ricerca clinica.

1. isolamento e congelamento del cordone ombelicale umano cellule endoteliali (HUVEC) della vena

1. Aggiungere 5 mL di soluzione di rivestimento un matraccio T75 (0,1 mg/mL collagene G e gelatina di 0,2% in tampone fosfato salino PBS a pH 7.4) per 30 min a 37 ° C prima dell'inizio di isolamento HUVEC.
2. Pulire il cavo con PBS, pulirlo con compresse sterili e posizionarlo in una sterile 20cm di Petri. Tagliare le estremità del cavo con forbici sterili.
3. Identificare la singola vena grande e due piccole arterie. Inserire delicatamente una cannula con un rubinetto a tre vie collegato ad esso in vena estremità alle estremità del cavo.
4. Stringere il cavo e la connessione di cannula saldamente con una lunghezza di filo.
5. Irrorare il cavo due volte con 20 mL di terreno RPMI contenente 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina e 250 ng/mL anfotericina B per lavare le vene del cavo. Questo processo rende l'aspetto del midollo più bianca e più chiara. Svuotare la vena prima dell'aggiunta della collagenosi raccogliendo il RPMI con una siringa ad una estremità.
6. Irrorare la vena con 12 mL di 1 mg/mL collagenasi tipo ho (0,22 µm-filtrati).
7. Chiudi il rubinetto il cavo termina e incubare il cavo a 37 ° C per 12 min.
8. Massaggiare delicatamente il cavo per staccare le cellule endoteliali dal lume della vena.
9. Prendere 30 mL di RPMI contenente 10% di siero fetale di vitello con una siringa da 50 mL e collegarlo a un'estremità del cavo ombelicale.
10. Collegare una siringa vuota 50ml per l'altra estremità del cavo ombelicale
11. Aprire il rubinetto e irrorare la vena da un'estremità, mentre la raccolta reciprocamente da altra estremità.
    Nota: La sospensione raccolta contiene cellule endoteliali.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per 5 min.
13. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 10 mL di terreno completo M199 (M199 integratori contenenti 20% FCS, la crescita delle cellule endoteliali di 15 µ g/mL, 100 µ g/mL eparina sodica, idrocortisone di 0,5 µM, 10 µ g/mL dell'acido L-ascorbico, 100 U/mL di penicillina, 100 U/mL streptomicina e 250 ng/mL anfotericina B).
14. Rimuovere la soluzione di rivestimento dal pallone T75 e sciacquare una volta con PBS.
15. Seme le cellule raccolte dal punto 1.13 nel pallone T75 e posizionarlo nell'incubatore a 37 ° C con 5% CO₂.
16. Il giorno successivo, risciacquare il matraccio 3 volte con la sostanza M199 completa per rimuovere residui globuli rossi e quindi modificare il mezzo ogni 2 giorni fino alla confluenza.
17. Confluenza di 80 – 90%, sciacquare il monostrato HUVEC una volta con 5 mL di PBS e staccare le cellule con 5 mL di tripsina 0.05% in 1 mM EDTA a 37 ° C per 5 min. aggiungere 4 mL di M199 e 1 mL di FCS per fermare l'azione della tripsina. Lavare la beuta per staccare tutte le HUVEC.
18. Raccogliere un'aliquota di 50 µ l di essere utilizzato per la colorazione di VE-caderina, PECAM-1 e gp38 e analizzare tramite flusso cytometry per verificare la purezza HUVEC.
19. Raccogliere il resto di HUVEC dal passaggio 1.18 in una provetta da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
20. Scartare il surnatante dal passaggio 1.19, risospendere il pellet cellulare in soluzione (FCS contenente 10% DMSO) di congelamento ad una densità di 5 x 10⁵ cellule/mL in provette per criogenia e congelare a-80 ° C o in azoto liquido fino all'utilizzo.
21. Per verificare la purezza HUVEC:
    1. Aggiungere 1 µ l di anticorpo anti-umano VE-caderina-FITC, 1 µ l di anticorpo anti-umano PECAM1-PE e 1 µ l di anticorpo anti-umano Podoplanin-APC l'aliquota di 50 µ l di HUVEC raccolti al passaggio 1.18.
    2. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    3. Aggiungere 100 µ l di PBS e centrifuga a 400 x g per 30 s.
    4. Scartare il surnatante e risospendere in 100 µ l di PBS. Dati possono ora essere acquisiti da tecniche di citometria a flusso.
       Nota: HUVEC sono positivi per VE-caderina e PECAM-1 e la negazione per Podoplanin.

2. HUVEC sbrinamento

Nota: Utilizzare HUVEC a basso passaggio per esperimenti (massimi 5 passaggi).

1. Rivestire un pallone T75 con 1 mL di soluzione di rivestimento a 37 ° C per 30 min.
2. Scongelare HUVEC a 37 ° C per 2 min e risospendere le cellule in 10 mL di M199 completa rapidamente.
3. Centrifugare le cellule a 200 x g a temperatura ambiente per 5 minuti e scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di M199 completa.
5. Trasferire la sospensione di eritrociti nel matraccio prepatinato. Posto il pallone in incubatore a 37 ° C con 5% CO₂. Cambiare il mezzo di coltura cellulare ogni 2 giorni.

3. HUVEC cultura nella camera di 0,4 µ-Slide

1. Cinque giorni prima di iniziare l'esperimento di flusso, pre-cappotto alloggiamenti di un 0,4 µ-scivolo con 30 µ l di PBS contenente collagene di 0,1 mg/mL G, gelatina di 0.2% a 37 ° C per 30 min.
2. Lavare gli alloggiamenti con 100 µ l di PBS.
3. Staccare le cellule da un HUVEC confluenti di 80 – 90% di un pallone da T75.
4. Sciacquare HUVEC con 5 mL di PBS e staccarli con 5 mL di tripsina 0.05% a 37 ° C per 5 min.
5. Sciacquare e raccogliere la sospensione cellulare in completa M199 e contare le celle con il metodo più conveniente. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente.
6. Risospendere il pellet cellulare a 10⁶ cellule/mL e distribuire 30 µ l (30.000 cellule) in ogni camera.
7. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C con 5% CO₂ per 1 h.
8. Aggiungere 150 µ l di M199 completa per ogni camera e cultura le cellule per 5 giorni nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO₂. Modificare il mezzo ogni 2 giorni.

4. HUVEC macchiatura per dosaggio di reclutamento di monociti sotto flusso

1. Preparare il supporto di etichettatura costituito M199 e 1 µM di CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetato) e riscaldarla a 37 ° C per 5 min prima cella etichettatura.
2. HUVEC lavare due volte con medium M199 riscaldato a 37 ° C.
3. Sostituire il mezzo con 30 µ l di riscaldato mezzo d'etichettatura contenente 1 µM di CMFDA e inserire in incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ per 10 min.
4. Lavare una volta con M199 completa e incubare le cellule con M199 completa nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO₂ per 30 min.
   Nota: È importante rimuovere tutte le tracce di siero prima dell'aggiunta della soluzione di etichettatura, in caso contrario può alterare HUVEC macchiatura.
5. Sostituire il supporto con M199 completa che contiene entrambi TNFα umano (500 U/mL) o un mix di TNFα umano (500 U/mL) con VEGFA umana (1 µ g/mL) per 6 h in un incubatore a 37 ° C e 5% CO₂.

5. isolamento dei monociti umani Pan e colorazione delle sottopopolazioni

1. Utilizzare un cappotto buffy di sangue umano concentrato, oppure 20 mL di sangue umano fresco isolato, raccolti il giorno dell'esperimento in provette vacutainer con EDTA.
2. Diluire il sangue in PBS-1 mM EDTA (1:1) e delicatamente pipetta 20 mL di sangue diluito in cima i 20 mL di media di gradienti di densità. Centrifugare a 400 x g per 30 min a temperatura ambiente con accelerazione lenta e senza freno.
3. Raccogliere le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)-strato della piastrina (tra media gradienti di densità e livelli del plasma) in una nuova provetta da 50 mL contenente 40 mL di PBS - 1 mM EDTA. Superiore a 50 mL con PBS - 1 mM EDTA.
4. Centrifuga a 200 x g a temperatura ambiente per 5 min, scartare il surnatante.
5. Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di buffer di colorazione (PBS - 1 mM EDTA contenente albumina di siero bovino 0,5% BSA).
6. Centrifuga a 200 x g a temperatura ambiente per 5 min, scartare il surnatante.
7. Ripetere i passaggi da 5.5 e 5.6.
8. Risospendere il pellet cellulare con 10 mL di tampone di colorazione. Prendere un'aliquota di 10 µ l per un conteggio delle cellule.
9. Controllare le popolazioni di PBMC e contare le celle rapidamente con un citometro a flusso.
   Nota: Le popolazioni di linfociti e monociti caratteristiche possono essere osservate (Figura 1A). Da 50 mL di sangue umano fresco si aspettano circa 50-100 x 10⁶ PBMC.
10. Per l'assunzione di CD14 + contro CD14-PBMC sotto flusso:
    1. Lavare la pallina tre volte con tampone di flusso (M199 contenente 0.5% BSA) e risospendere le cellule mononucleari nel buffer di flusso a 6 x 10⁶ cellule per mL.
    2. Rendere le aliquote di 200 µ l per ogni dosaggio. Incubare a 37 ° C fino a 20 min prima del dosaggio.
    3. Aggiungere 5 µ l di anti-CD14-PE e Hoechst 33342 ad una concentrazione finale di 2 µM ad ogni aliquota. Mescolare e incubare a 37 ° C per 10 min.
    4. Centrifugare l'aliquota a 400 x g per 30 s.
    5. Eliminare il supernatante e risospendere il sedimento con 200 µ l di tampone di flusso.
11. Per il reclutamento delle sottopopolazioni monocito sotto flusso:
    1. Isolare i monociti con un kit di isolamento del monocito padella secondo le istruzioni del produttore.
       Nota: Il seguente protocollo di isolamento è per 50 x 10⁶ cellule. Può essere scalata verso l'alto o verso il basso fino a quando è all'interno, le raccomandazioni del produttore.
    2. Centrifugare la sospensione PBMC a 200 x g a temperatura ambiente per 5 min.
    3. Eliminare il supernatante e risospendere il sedimento con 400 µ l di tampone di colorazione.
    4. Aggiungere 50 µ l di reagente bloccante del recettore Fc e 50 µ l di anticorpo Pan monocito cocktail.
    5. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    6. Aggiungere 400 µ l di macchiatura buffer e 100 µ l di anticorpo anti-biotina coniugati di biglie magnetiche. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
    7. Aggiungere 2 mL di buffer di colorazione e utilizzare una colonna di MACS LS accoppiata con un magnete.
    8. Posizionare la colonna LS sul magnete e aggiungere 1 mL di tampone di colorazione. Scartare il flusso continuo.
    9. Passare la sospensione PBMC nella colonna e raccogliere il flusso chiaro anche se contenenti i monociti di pan in una nuova provetta da 15 mL.
    10. Aggiungere il buffer di colorazione per di più fino a 5 mL.
    11. Prendere un'aliquota e controllare la qualità dell'isolamento del monocito con un citometro a flusso.
    12. Determinare il numero di monociti di pan.
        Nota: Solo della popolazione monocito può essere osservata (Figura 1B).
    13. Centrifugare il resto dei monociti dal passaggio 5.11.11 a 200 x g per 5 min.
    14. Scartare il surnatante.
    15. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di buffer di flusso (M199 contenente 0.5% BSA).
    16. Ripetere 5.11.13 a 5.11.14 due volte per eliminare ogni traccia di EDTA.
12. Rendere il monocito sospensione nel flusso del buffer (M199 con 0,5% BSA) 6 x 10⁶ cellule/ml.
13. Rendere le aliquote di 200 µ l di monociti per ciascun test di reclutamento.
14. Mantenere l'aliquota a 37 ° C nell'incubatore fino 20 min prima dell'iniezione.
15. Aggiungere 5 µ l di anticorpo anti-CD16-PE e Hoechst 33342 (2 µM finali) ad ogni aliquota.
16. Mescolare e incubare a 37 ° C per 10 min.
17. Centrifugare l'aliquota a 400 x g per 30 s.
18. Eliminare il supernatante e risospendere il sedimento con 250 µ l di tampone di flusso.
19. Aggiungere 30 µ l della sospensione del monocito in un alloggiamento della diapositiva a servire per l'impostazione dei parametri di acquisizione il microscopio confocale.
20. Mantenere le aliquote delle sospensioni del monocito dal passaggio 5,18 a 37 ° C.
    Nota: Questa sospensione è pronta per essere iniettato nel sistema di flusso.

6. preparazione del sistema fluidico

1. Garantire che l'incubatrice di cella per l'imaging a 37 ° C.
   Nota: Nella Figura 2è riportato un diagramma del sistema di flusso.
2. Assemblare la parte di tubazione i: inserire un connettore Luer maschio ad una estremità di un pezzo di tubo in silicone (8 cm lunghezza e 3 mm di spessore) e collegare l'altra estremità a un set di iniezione Luer in linea. Collegare il connettore Luer quest'ultimo a un pezzo di cordone di silicone (40 cm e 3 mm di spessore) ad una estremità.
   Nota: Facoltativamente, un rubinetto 3 vie collegato ad una siringa da 5 mL può essere inserito tra il set di iniezione Luer in linea e il tubo per la rimozione di eventuale aria bolla in silicone.
3. Montare la tubazione parte II: collegare una siringa da 20 mL a un'estremità di una lunghezza del cordone di silicone (1 m di lunghezza e 3 mm di spessore). Inserire un connettore Luer maschio a altra estremità del tubo.
4. Collegare la parte I e parte della tubazione II inserendo i maschi di connettore Luer per un accoppiatore di blocco Luer femmina (Figura 2A).
5. Mettere l'estremità libera del tubo di silicone nel serbatoio contenente il buffer di flusso (M199 + 0,5% BSA) riscaldato a 37 ° C.
6. Tirare lo stantuffo della siringa da 20 mL per riempire il tubo con buffer di flusso.
7. Posizionare la siringa sulla pompa e fissarlo.
8. Impostare la pompa nel prelevare modalità (in contrapposizione a infondere) e specificare la portata.
9. Determinare la portata secondo la diapositiva IBIDI utilizzata, utilizzando la seguente formula:
   
   Nota: Il fattore di scorrimento dipende dalla diapositiva IBIDI utilizzata per l'esperimento. Per µ-slide ho^0,4 Luer lock utilizzato in questo esempio, il fattore di diapositiva è 131,6. Per fattori di diapositiva specifica, vedere il sito Web di società¹⁴. La viscosità di buffer del flusso è 0,0072 dyn.s/cm². Sollecitazione di taglio presso le venule post-capillari è circa 0,5 dyn/cm².
10. Collegare il vetrino (Figura 2B):
    1. Assicurare il tubo flessibile del silicone intorno il raccordo di blocco Luer femmina e staccare i due maschi di connettore Luer l'accoppiatore.
    2. Collegarli ai serbatoi della diapositiva contenente stimolato HUVEC e riempire con il mezzo. Evitare le bolle d'aria durante questo passaggio.
    3. Togliere i morsetti e assicurarsi che la connessione non è perdita.
11. Porre il vetrino al microscopio per l'imaging di time-lapse e avviare la pompa.

7. Time-lapse Imaging del monocito reclutamento sotto flusso mediante microscopia confocale

1. Utilizzare un obiettivo 40x (Vedi Tabella materiali) per l'imaging.
2. Attivare il 405 nm (blu monocito nuclei), 488 nm (cellule endoteliali verde) e 561 nm (sottoinsieme di rosso CD16 +) laser.
3. Utilizzare la camera contenente i monociti per impostare i parametri di acquisizione.
   Nota: Per rilevare non trasmigrato e transmigrated monociti, il foro stenopeico e l'intensità del laser 405 nm sono impostati alti. Così, non trasmigrato i monociti sono leggermente visibili nel piano basale. Tuttavia soltanto transmigrated monociti presentano un'area non colorata intorno al nucleo corrispondente al nuovo spazio occupato sotto le cellule endoteliali.
4. Posizionare la camera per essere acquisita sotto il microscopio.
5. Scegliere 3 campi di vista nel raggio di 1 cm per l'imaging confocale multiposizione.
6. Definire il basale e i lati apicali delle cellule endoteliali
7. Impostare un z-stack per la gamma di 10 – 12 µm (passo 0,5 µm). Eseguire un'acquisizione di time-lapse ogni 1 min.
8. Dopo 3 min di imaging, è possibile iniettare 200 µ l di sospensione del monocito (6 x 10⁶ cellule/mL) attraverso il foro di iniezione Luer in linea.
   Nota: Rapidamente i monociti appaiono nel piano focale apicale, aderire e iniziare la trasmigrazione (transito da apicale al piano basale).
9. Immagine per almeno 30 min. Una volta finito, interrompere la formazione immagine e fermare il flusso. Assicurare il tubo flessibile per scollegarli dalla diapositiva.
10. Difficoltà la diapositiva con paraformaldeide al 4% a 4 ° C per 10 min.
11. Lavare il vetrino con PBS e conservare il vetrino a 4 ° C per un'ulteriore analisi se necessario.

8. analizzare i dati con ImageJ

1. Contare il numero dei monociti aderenti totali in ogni campo. Determinare il conteggio delle cellule per mm².
2. Contare transmigrated monociti che sono presenti nel piano basale sotto le cellule endoteliali e identificati dalla presenza di un buco nero (nel canale verde) intorno al nucleo.
3. Dividere il conteggio dei leucociti transmigrated dal numero totale di leucociti aderenti. Il tasso di trasmigrazione è presentato come una percentuale dei monociti aderenti.
4. Per l'illustrazione, l'apicale e i lati basali possono essere visualizzati contemporaneamente per illustrare gli eventi che si verificano in ciascuno di questi comparti endoteliali.

Determinazione dello stato di attivazione di HUVEC indotta dal TNFα

La bio-attività della citochina infiammatoria TNFα può variare secondo il batch e la replezione del ciclo di congelamento-scongelamento. È importante verificare lo stato di attivazione di HUVEC con trattamento TNFα. Questa potrebbe essere eseguita dalla macchiatura in parallelo alcuni campioni di HUVEC confluenti per l'induzione infiammatoria selectins, ICAM-1 e VCAM-1^15,16,17. Un modo più facile e più semplice per controllare lo stato di attivazione di HUVEC dopo trattamento di TNFα è il cambiamento morfologico visualizzato dalle cellule endoteliali in condizioni di stress infiammatorio. Come mostrato nella Figura 3, HUVEC allungare dopo 6 h in presenza di TNFα rispetto alle cellule non stimolate. Allungamento simile è osservato quando HUVECs sono stimolati da un mix di TNFα e VEGFA. Registrare lo stato di attivazione di HUVEC è importante quanto i risultati finali della trasmigrazione dei monociti dipenderà molto la qualità dell'attivazione delle cellule endoteliali.

Trasmigrazione del monocito rende una caratteristica sospensione in cellule endoteliali

Per studiare la trasmigrazione del monocito sotto flusso, abbiamo usato la microscopia confocale con cellule endoteliali tinto in verde con CMFDA e i nuclei di monociti isolati tinto in blu con il colorante Hoechst 33342 cellula-permeabile (Figura 4). Il time-lapse imaging confocale ha permesso la visualizzazione dei monociti all'aereo apicale, dove il loro fenotipo potrebbe essere valutati (fig. 4A-C, supplementare Movie 1). Migrazione delle cellule che subiscono la trasmigrazione spostato nello spazio intercellulare corrispondenti alle giunzioni della cellula-cellula prima sono scomparsi dal piano apicale e apparso nel piano basale. Le cellule transmigrated presentato un buco nero intorno al nucleo corrispondente alle forme del monocito. Questa forma ha cambiata costantemente durante la migrazione di monociti sotto le cellule endoteliali (fig. 4A-C, film supplementare 2-3). Questo buco nero dinamico fatto dal corpo del monocito sotto le cellule endoteliali e il posizionamento del monocito, ammessi per l'identificazione univoca delle cellule transmigrated. Quantificazione del reclutamento di monociti nel corso del tempo ha mostrato l'adesione del monocito seguita da trasmigrazione (Figura 4-E). Anche se leucociti possono MPEG attraverso percorsi sia il transcellulare e paracellulare, abbiamo potuto osservare solo la trasmigrazione paracellulare sotto flusso con questo metodo. Ciò è coerente con la nostra precedente osservazioni^3,11,18,19.

Fattore angiogenico guidato infiammazione promuove la trasmigrazione di CD16 + monociti

Utilizzando questo metodo, abbiamo analizzato la trasmigrazione di proangiogenic umana contro non-angiogenici monociti attraverso un monostrato endoteliale stimolato dalla citochina infiammatoria TNFα da solo o in combinazione con il fattore angiogenico VEGFA. I monociti umani proangiogenic possono essere identificati dall'espressione di CD16 o TIE2 sulla loro superficie. Qui, l'anticorpo anti-CD16-PE è stato utilizzato per discriminare tra pro e non angiogenici monociti. Come mostrato in Figura 5A-B (film supplementare 4-5), il tasso di trasmigrazione di CD16⁺ monociti era basso quando le cellule endoteliali sono state stimolate con TNFα solo. Tuttavia, questo tasso è aumentato quando le cellule endoteliali sono state stimolate simultaneamente con TNFα e VEGFA (Figura 5Film supplementare-E, 6-7). Il tasso di trasmigrazione dei non-angiogenici monociti era altrettanto elevato in entrambe le circostanze infiammatorie. Per entrambe le sottopopolazioni delle cellule, la trasmigrazione si è verificato esclusivamente attraverso la via paracellulare. Questo metodo consente pertanto le attitudini di trasmigrazione di diverse popolazioni monocytic essere studiato contemporaneamente.

La purezza dei monociti incide sull'efficienza di trasmigrazione

Le cellule mononucleari del sangue periferico sono composte di cellule T, cellule B, cellule NK e dei monociti. Il metodo di isolamento del monocito usato qui richiede lo svuotamento delle altre popolazioni leucocitarie da PBMC. Per comprendere come la mancanza di purezza del monocito influisce sui risultati, abbiamo usato PBMCs e macchiato per pan-monociti con un anticorpo anti-CD14-PE prima di eseguire il test di reclutamento sotto flusso. Come illustrato nella Figura 6, stimolazione HUVEC con TNFα o TNFα + VEGFA ha indotto la trasmigrazione di solo la popolazione del monocito. Altri leucociti è composto da cellule T, cellule B e le cellule NK non ha fatto trasmigrano sotto TNFα o TNFα + VEGFA. Infatti, è stato documentato che questi leucociti bisogno di altri segnali per trasmigrazione. Quindi, un isolamento inefficiente dei monociti condurrà ad una sottovalutazione della trasmigrazione del monocito, come altri leucociti sarà considerate come monociti. Ciò porterebbe a un risultato erroneo sulla trasmigrazione del monocito, a causa della contaminazione della popolazione monocito con altri leucociti.

Figura 1: profilazione dei monociti isolati tramite flusso cytometry. (A) analisi della morfologia di PBMC prima deplezione linfocitaria. La dimensione (forward scatter: FSC) e granularità (dispersione laterale: SSC) del sangue periferico cellule mononucleari sono state determinate mediante citometria a flusso. (B) la dimensione e la granularità dei monociti isolati sono stati determinati tramite flusso cytometry dopo deplezione linfocitaria. Un efficiente isolamento dei monociti Mostra uno svuotamento completo della popolazione dei linfociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: schema del sistema fluidico. (A) descrizione schematica del sistema di aspersione prima e dopo la connessione della slitta e montaggio su pompa a siringa. (B) diagramma del processo di collegamento il vetrino con il tubo con delle fascette. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: verifica l'attivazione efficiente delle cellule endoteliali. L'attivazione di HUVEC da stimoli infiammatori stato controllato analizzando la forma delle cellule mediante microscopia di contrasto di fase. Dopo 6 ore di trattamento, HUVEC presentano una morfologia allungata quando stimolati con il TNFα (500 U/mL) o un mix di TNFα (500 U/mL) + VEGFA (1 µ g/mL) rispetto alle cellule non stimolate. Questo cambiamento morfologico di HUVEC seguendo lo stimolo infiammatorio è un facile da rilevare indicatore dell'attivazione delle cellule, che dovrebbe essere garantito per il dosaggio di flusso. Barra della scala = 120 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: identificazione dei monociti transmigrated mediante microscopia confocale a. (A) diagramma di trasmigrazione del monocito con le viste previste al planes apicali e basali. I nuclei dei monociti colorati con Hoechst 33342 sono raffigurati in blu, e le forme teoriche dei monociti sono rappresentate con linee tratteggiate intorno i nuclei. Secondo il basale, i monociti piatti transmigrated sono mostrati per occupare uno spazio di sotto delle cellule endoteliali. Questo spazio appare come un buco nero che circonda il nucleo del monocito su immagini confocal. (B) localizzazione di un monocito prima e dopo la trasmigrazione. Le viste ortogonali sono mostrate, e l'aspetto di un buco nero (delineato con la linea tratteggiata bianca) può essere osservato dopo la migrazione di monociti al compartimento endoteliale abluminale. Una freccia rossa indica la posizione di un monocito prima trasmigrazione e la punta della freccia bianca indica la stessa cella dopo trasmigrazione. Le viste ortogonali mostrano che il monocito transmigrated è sotto la cellula endoteliale. Barra della scala = 40 µm. (C) time-lapse sequenze di immagini (da 0 a 20 min) di lavoro straordinario di reclutamento di monociti. Le vedute apicali e basali sono mostrate. Le sequenze complete possono essere visto nel film supplementare 1, 2 e 3. Quadrati rossi evidenziano un monocito transmigrated con un nucleo blu. Il buco nero corrispondente al corpo piatto del monocito sotto la cellula endoteliale è delineato da una linea gialla tratteggiata. Barra della scala = 40 µm. (D) quantificazione dell'adesione del monocito alle TNFα-stimolata contro stimolate HUVEC nel corso del tempo. (E) la quantificazione del tasso di trasmigrazione del monocito nel corso del tempo. N = 3 replicati biologici. I dati sono presentati come media ± S.D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: inchiesta simultanea della trasmigrazione delle sottopopolazioni monocito sotto flusso. Sequenze di immagini time-lapse di (A) (da 0 a 20 min) del reclutamento dei monociti proangiogenic (CD16⁺) e non-angiogenici monociti nel tempo attraverso HUVEC TNFα-attivato. Barra della scala = 40 µm; le vedute apicali e basali sono mostrate. Le sequenze complete possono essere visto in 4 film supplementare per apicale e 5 film supplementare per viste basale. (B) quantificazione della trasmigrazione dei monociti umani proangiogenic (HPMo: CD16 +) e umano non-angiogenici monociti (HNMo) attraverso un monostrato HUVEC TNFα-attivato. N = 4 ripetizioni biologici, i dati sono presentati come media ± S.D. * p < 0,05; Test di Mann-Whitney. (C), time-lapse immagine sequenze (da 0 a 20 min) del reclutamento dei monociti proangiogenic e non-angiogenici straordinario attraverso HUVEC TNFα + VEGFA-attivato. Barra della scala = 40 µm; le vedute apicali e basali sono mostrate. Le sequenze complete possono essere visto in supplementare 6 film per apicale e supplementare Movie 7 per Vista basale. (D) quantificazione della trasmigrazione dei monociti umani proangiogenic (HPMo: CD16 +) ed i monociti umani non-angiogenici (HNMo: CD16-) attraverso monostrato HUVEC TNFα + VEGFA-attivato. N = 4 ripetizioni biologici, i dati sono presentati come media ± S.D. * p < 0,05; Test di Mann-Whitney. (E) localizzazione di CD16⁺ monociti prima (10 min) e dopo (15 min) trasmigrazione attraverso HUVEC TNFα + VEGFA-stimolata. Le viste ortogonali sono mostrate. Barra della scala = 40 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: La trasmigrazione di CD14 + contro CD14 - PBMC sotto flusso indagine simultanea. (A) adesione di CD14⁺contro CD14^– PBMC di TNFα-attivato HUVEC sotto flusso. (B) adesione di CD14⁺contro CD14^– PBMC di TNFα + VEGFA-attivato HUVEC sotto flusso. Trasmigrazione (C) il tasso (%) di CD14⁺contro CD14^– PBMC attraverso attivati dal TNFα HUVEC sotto flusso. Trasmigrazione (D) il tasso (%) di CD14⁺contro CD14^– PBMC attraverso HUVEC TNFα + VEGFA-attivato sotto flusso. Dati sono media ± S.D. N = 4 ripetizioni biologici. * p < 0,05; Test di Mann-Whitney. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Supplementare Movie 1: vista sul piano apicale di reclutamento di pan-monocito sotto flusso. Visualizzazione espansa del reclutamento di pan monocito sotto flusso all'aereo apicale. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. Barra della scala = 50 µm Clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 2: vista al piano basale del reclutamento di pan-monocito sotto flusso. Visualizzazione espansa del reclutamento dei monociti padella sotto flusso al piano basale. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. Barra della scala = 50 µm Clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 3: proiezione massima di z-pile di reclutamento di pan-monocito sotto flusso. Visualizzazione espansa del reclutamento dei monociti padella sotto flusso come mostrato nella Supplemental film 1 e 2. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. Barra della scala = 50 µm Clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 4: vista sul piano apicale del reclutamento di sottopopolazioni monocito a TNFα-attivato HUVEC. Espanso vista sul piano apicale dell'assunzione simultanea di sottopopolazioni monocito sotto flusso di TNFα-attivato HUVEC sotto flusso. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. Sottopopolazioni monocito proangiogenic umano sono state identificate l'espressione di superficie di CD16. Barra della scala = 30 µm. per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 5: vista al piano basale del reclutamento di sottopopolazioni monocito a TNFα-attivato HUVEC. Visualizzazione estesa, al piano basale, l'assunzione simultanea di sottopopolazioni monocito sotto flusso di TNFα-attivato HUVEC sotto flusso. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. La sottopopolazione di proangiogenic umano monocito (HPMo) è stata identificata l'espressione di superficie di CD16. Barra della scala = 30 µm. per favore clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 6: vista sul piano apicale del reclutamento di sottopopolazioni monocito a TNFα+ VEGFA-attivato HUVEC. Visualizzazione estesa, sul piano apicale, dell'assunzione simultanea di sottopopolazioni monocito sotto flusso di TNFα + VEGFA-attivato HUVEC sotto flusso. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. La sottopopolazione di monociti umani proangiogenic è stata identificata l'espressione di superficie di CD16. Barra della scala = 30 µm Clicca qui per scaricare questo file.

Supplementare Movie 7: vista al piano basale del reclutamento di sottopopolazioni monocito a TNFα+ VEGFA-attivato HUVEC. Visualizzazione estesa, al piano basale, l'assunzione simultanea di sottopopolazioni monocito sotto flusso di TNFα + VEGFA-attivato HUVEC sotto flusso. HUVEC erano macchiati con CMFDA e i nuclei dei monociti erano live-colorati con Hoechst 33342. La sottopopolazione di proangiogenic umano monocito (HPMo) è stata identificata l'espressione di superficie di CD16. Barra della scala = 30 µm Clicca qui per scaricare questo file.

Qui, segnaliamo un metodo dettagliare uno studio di come le sottopopolazioni monocito trasmigrano attraverso il monostrato endoteliale infiammato. Il metodo discusso 4x0 microscopia confocale microscopia di contrasto di fase, che è anche usata per studiare il reclutamento di monociti sotto flusso^3,11,19. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di microscopia confocale per l'imaging di time-lapse è la capacità di discriminare in modo inequivocabile trasmigrazione e forte adesione dei monociti. Anche se il metodo di base di microscopia di contrasto di fase è anche robusto, richiede competenze al fine di evitare di mescolare transmigrated cellule e le cellule fortemente aderenti. In questo caso, bisogna stabilire criteri rigorosi per l'analisi al fine di rendere una chiara differenza tra questi due Stati della cascata di reclutamento del monocito. Inoltre, è anche importante eseguire un'analisi di endpoint mediante microscopia confocale per confermare le tendenze globali osservate mediante la microscopia di contrasto di fase. Così, l'uso diretto di microscopia confocale per indagare il reclutamento di monociti sotto flusso fornisce risultati chiari sullo stato effettivo trasmigrazione dei monociti catturati.

Uno dei principali impedimenti nell'esecuzione di reclutamento leucocitario dosaggi sotto flusso e usando un microscopio a contrasto di fase è il tempo impiegato per eseguire l'analisi e tenere traccia di singole celle dalla cattura alla trasmigrazione attraverso la giunzione di cellula-cellula. Automazione di tali analisi è possibile ma difficile da effettuare dovuto le somiglianze di contrasto di fase tra striscianti e transmigrated monociti. Qui vi mostriamo mediante microscopia confocale che trasmigrazione del monocito è stata accompagnata da una sospensione di cellule endoteliali colorazione nel piano basale corrispondente alla forma dei monociti transmigrated sotto HUVEC. Questo posizionamento è stato confermato tramite la proiezione ortogonale. Si è verificato il passaggio della localizzazione del monocito esclusivamente tra giunzioni della cellula-cellula indicative di una trasmigrazione paracellulare. Ciò è coerente con i nostri dati precedenti, che hanno mostrato che sotto flusso in vitro, monociti trasmigrano esclusivamente attraverso la via paracellulare con HUVEC^3,18. Per completare il metodo proposto qui, è possibile utilizzare non bloccante anticorpi contro proteine giunzionali quali VE-caderina, marmellate o PECAM1 per foto i potenziali siti di trasmigrazione del monocito (paracellular vs transcellulare). Abbiamo confermato che le forme nere che circondano i nuclei del monocito sono una caratteristica robusta delle cellule transmigrated e un semplice evento che può essere rilevabile dal software. Anche se una cella manuale sistema di conteggio è dimostrata qui, la formazione di nero forma intorno al nucleo del leucocita è un criterio che potrebbe essere utilizzato per definire la trasmigrazione dei leucociti in analisi automatizzata, risparmiando così un sacco di tempo. Stiamo attualmente lavorando sullo sviluppo di un programma automatico per tale analisi.

Fluorescenza e microscopia confocale in precedenza sono stati utilizzati nello studio di reclutamento leucocitario. Tuttavia, non servivano per indagare il reclutamento delle sottopopolazioni differenti contemporaneamente. Qui vi proponiamo una modalità di utilizzo di microscopia confocale per studiare il reclutamento dei sottotipi del leucocita simultaneamente nel microambiente stesso. Vi mostriamo che quello microscopia confocal può essere utilizzato per indagare contemporaneamente i comportamenti migratori delle sottopopolazioni differenti del monocito. Ad esempio, abbiamo utilizzato CD16 espressione di discriminare tra monociti proangiogenic e non-angiogenici al fine di studiare la capacità di trasmigrazione delle due sottopopolazioni in diversi contesti infiammatori. Coerente con la nostra recente pubblicazione, utilizzando la modalità di microscopia confocale, abbiamo dimostrato che il tasso di trasmigrazione di CD16⁺ monociti era più basso quando il monostrato endoteliale delle cellule è stato stimolato solo dal TNFα³. Tuttavia, la combinazione di TNFα e VEGFA portato ad un aumento nella trasmigrazione dei monociti proangiogenic. Il tasso di trasmigrazione era altrettanto elevato per non-angiogenici CD16^– monociti in entrambe le circostanze infiammatorie. Abbiamo precedentemente dimostrato che monociti che macchia con l'anticorpo anti-CD16 non presenta alcun effetto significativo sulla trasmigrazione, questa conferma dall'analisi dei monociti senza etichetta dopo il dosaggio di trasmigrazione, usando la microscopia confocal³. Tuttavia, per nuovi sottotipi di leucociti o gli anticorpi usati per contrassegnarli, l'effetto d'etichettatura deve essere valutata. Utilizzando questo metodo, fino a tre differenti popolazioni di leucociti possono essere studiati simultaneamente. Potrebbe trattarsi di sottopopolazioni che sono tipi di cellule immunitarie funzionalmente distinte o simili. Sebbene il fuoco qui è sulla trasmigrazione del monocito, altri passaggi della loro assunzione possono essere analizzate anche da questo metodo, compreso il comportamento delle cellule prima di trasmigrazione, come la cattura e anomalie della migrazione direzionalità. Post-trasmigrazione eventi quali ritenzione abluminale e trasmigrazione inversa possono anche essere studiati per popolazioni leucocitarie diverso, come un'estensione di questo metodo. Una limitazione è la scarsa rilevazione della colorazione nel canale da' in time-lapse imaging, come pure alcuni tracimazione dei segnali di fluorescenza che ridurre la risoluzione di z-stack. Questo era principalmente legato allo strumento usato per formazione immagine confocal. L'uso di deconvoluzione di immagine alla fine potrebbe contribuire a migliorare la qualità dell'immagine e consentire ulteriori analisi delle diverse fasi del reclutamento del leucocita.

Per studiare il reclutamento leucocitario in condizioni ottimali, è importante verificare lo stato di attivazione di strato monomolecolare della cellula endoteliale. Infatti, una carente attivazione delle cellule endoteliali conduce ad una riduzione globale in adesione del monocito e trasmigrazione. L'attivazione delle cellule endoteliali può essere controllata analizzando il livello di espressione di molecole di adesione sulla superficie delle cellule endoteliali come ICAM1 e VCAM1. Il livello di questi adesione molecole devono essere aumentati rispetto alle cellule endoteliali non stimolate. Se nessun cambiamento è rilevabile in queste molecole di adesione endoteliale, le HUVEC coltivati può essere considerato come non attivato. Valutazione del livello di espressione di molecole di adesione può costituire un buon controllo quantitativo tra diversi esperimenti utilizzando lo stesso batch di HUVEC. Tuttavia, il livello di espressione di queste molecole di adesione può anche variare tra diverse colture primarie di cellule endoteliali limitando la considerazione di un limite globale di ICAM1 o VCAM1. Il cambiamento di forma delle cellule endoteliali vascolari quali HUVEC è anche un buon indicatore della loro attivazione. Questo cambiamento nel fenotipo posteriore permette una valutazione rapida e qualitativa dell'attivazione di HUVEC. Tuttavia, l'analisi di molecole di adesione potrebbe essere una scelta migliore per cellule microvascolare che non mostrano la forma-cambiamento importante sull'attivazione con citochine infiammatorie.

Per gli studi meccanicistici, pertinenti controlli negativi della trasmigrazione del monocito possono essere eseguiti utilizzando anticorpi contro molecole di adesione endoteliali come ICAM1, VCAM1 o sulla superficie del leucocita come funzione del leucocita-associated Antigen (LFA) -1. L'utilizzo di un controllo negativo rilevante è essenziale per tale studio meccanicistico in monociti come essi esprimono recettori Fc sulle loro superfici delle cellule. La purezza dei monociti dopo l'isolamento è anche importante, al fine di evitare la contaminazione da altre popolazioni leucocitarie e una sottovalutazione del tasso di trasmigrazione del monocito. Un altro parametro critico è la temperatura, che deve essere impostato a 37 ° C per tutti i dosaggi al fine di garantire che tutte le osservazioni sperimentali siano pertinenti e tradurre conseguenza a umano in vivo delle cellule traffico.

Gli autori non hanno nessun concorrenti interessi finanziari.

Si ringrazia il Dr. Paul Bradfield per manoscritto leggendo e feedback. A. S. ha ricevuto il sostegno finanziario il Signore Jules Thorn caritatevole Overseas Trust reg.,