Method Article
Bu makalede ayrıntılı olarak safra atrezi sendromu bir deneysel safra atrezi fare modeli ameliorating Nano Gümüş tanecikleri dayalı bir yöntem açıklanır. Reaktif hazırlık süreci ve neonatal fare enjeksiyon tekniği katı bir anlayış yenidoğan fare modeli çalışmalarda kullanılan yöntemi ile araştırmacılar tanıtmak yardımcı olacaktır.
Safra atrezi (BA) kolanjit hangi etiyolojisi hala tam anlaşılmaktadır çocuklarda yüksek mortalite ile şiddetli bir türüdür. Viral enfeksiyonlar bir olası neden olabilir. BA eğitim için kullanılan tipik hayvan modeli yenidoğan bir fare ile bir al yanaklı Rotavirüs aşı tarafından kuruldu. Gümüş nano tanecikleri antibakteriyel ve antiviral efektleri uygulamak gösterilmiştir; BA fare modeli kendi işlevleriyle Bu çalışmada değerlendirilir. Şu anda, BA hayvan deneylerinde, genellikle semptomatik tedaviler yiyecek yolu ile veya diğer ilaçlar verilen BA fareler belirtileri geliştirmek için kullanılan yöntemleri vardır. Bu çalışmada gümüş nano tanecikleri mayi enjeksiyonu ile BA sendromu farelerde ameliorating için yeni bir yöntem göstermek için ve gümüş nanopartikül jel formülasyonu hazırlama detaylı yöntemleri sağlamak amaçtır. Bu yöntem basit ve yaygın olarak uygulanabilir ve mekanizma ba, hem de klinik tedaviler araştırma için kullanılabilir. Fareler sarılık sergilemek ne zaman BA fare modeline bağlı olarak, hazırlanan gümüş nanopartikül jel intraperitoneally alt karaciğer yüzeye enjekte edilir. Hayatta kalma durumu görülmektedir ve biyokimyasal göstergelerin ve karaciğer histopatoloji incelenir. Bu yöntem her iki kurulması BA modeli ve Roman BA tedaviler daha sezgisel bir anlayış sağlar.
BA tarafından kalıcı sarılık ile karakterize Histiositoz şeklidir ve karaciğer nakli yokluğunda yüksek ölüm oranı vardır. Viral enfeksiyonlar BA patogenezi ile yakından ilişkilidir. Sitomegalovirüs, reovirus ve Rotavirüs tüm patojenler BA1,2,3olarak önerilmiştir. Yenidoğan döneminde ilave ve intrahepatic safra kanalları, safra epitel hücre apoptosis, inflamatuar hücre infiltrasyon Portal önde gelen karşı bağışıklık bozukluk olgunlaşmamış bağışıklık sistemi yanıt viral bir enfeksiyon olarak sonuçlanır alan, intrahepatic ve extrahepatic safra kanalı tıkanıklığı ve son olarak, karaciğer fibrozis4,5,6.
BA eğitimi için yaygın olarak kullanılan hayvan modeli bir yenidoğan fare al yanaklı Rotavirüs (RRV) ile aşı içerir. Fare genellikle 5-6 gün sonra düşük vücut ağırlığı ve acholic dışkı gösterilen sarılık gelişir. Hastalık süreci Bağışıklık yanıtında rolü özellikle doğal öldürücü (NK) hücreleri için önemlidir; Bu hücreler ile anti-NKG2D antikor tükenmesi BA indüklenen zarar7büyük ölçüde azaltır. Ayrıca, diğer dahil olmak üzere CD4 hücreleri+ T hücreleri CD8+ T hücreleri, dendritik hücreler ve düzenleyici T hücreleri, tüm gösterilmiştir içinde hastalık8,9,10,11rolleri oynamak için. Tüm verileri BA sırasında bağışıklık sisteminin vazgeçilmez doğa göstermektedir.
Gümüş nano tanecikleri (AgNPs) bakteriyel enfeksiyonlar12 ve viral enfeksiyonlar13,14,15de dahil olmak üzere bazı bulaşıcı hastalıklara karşı faydalı etkileri olduğu gösterilmiştir. Ancak, dermatolojik kullanım dışında kaç çalışmalar AgNPs bir klinik tedavi çoğunlukla nedeniyle onların potansiyel toksisitesi kullandık. Hayvan deneylerinde, araştırmacılar genellikle yönetilen AgNPs yolu ile sözlü16 veya intravenöz yöntemleri17etkinliğini inceledik. Ancak, diğer araştırmacılar AgNPs yönetilen yolu ile mayi (IP) iğne yenidoğan Mouse deneyler, hangi basit ve hızlı bir yöntem karaciğer ve safra kanalları ise daha doğrudan bir etkiye yol açmaktadır etkinliğini inceledik bağışıklık sistemi gibi diğer sistemlere toksisite azaltılması. AgNPs NK hücre etkinlik18etkiler gösterilmiştir; Bu nedenle, BA fare modelinde ı.p. enjeksiyon yolu ile yönetilen AgNPs tedavi edici etkileri test.
Tüm hayvan deneysel protokoller kurumsal hayvan bakım ve Sun Yat-Sen üniversite laboratuvar hayvan Merkezi (#IACUC-DB-16-0602) kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.
1. safra atrezi fare modeli oluşturma
2. gümüş nanoparçacık sentezi
3. gümüş nanopartikül kollajen karışımı hazırlanması
Not: AgNP kollajen karışım hazırlanır ve daha önce açıklanan21 ve 4 ° C'de depolanan gibi karakterize Tüm yordamları buza gerçekleştirilmelidir.
4. fare enjeksiyon yöntemi
5. kan toplama örnek
Not: Kalbine iğne ekleyerek yaklaşık 120 µL kan örnekleri toplanır. Santrifüjü sonra serum (karaciğer fonksiyon testleri için toplanan yaklaşık 70 µL) olduğunu. Kan toplama yöntemi aşağıdaki gibidir.
6. biyokimyasal parametrelerin algılanması
7. extrahepatic Cholangiography Extrahepatic safra kanalını A_ılabilinirse gözlemlemek için
Not: bir diseksiyon mikroskop altında tüm süreci gerçekleştirmek.
8. Hematoksilen ve eozin boyama için taze karaciğer örnekleri topluluğu
9. immunohistokimyasal Hematoksilen ve eozin lekeli doku bölümleri boyama
10. akış sitometrik çözümlemesi
Kurulan BA fare modelini temel alan, virüslü yenidoğan fareler idare ı.p. enjeksiyonu hazırlanan AgNP kollajen karışım 2 x sonra sarılık sergilenmesi. Fare hayatta kalmak için günlük kontrol edildi ve karaciğer fonksiyon testleri, karaciğer patolojisi ve akış sitometresi yapıldı. Tedavi edilmeyen denetim BA fareler için karşılaştırıldığında, AgNP tedavi fareler azaltılmış sarılık gösterdi ve kendi normal vücut ağırlığı (Şekil 3) saklanır. Bilirubin metabolizması ve karaciğer transaminaz düzeyleri AgNPs büyük ölçüde karaciğer fonksiyon (Tablo 1) geliştirilmiş düşündüren normal denetim değerleri için düştü. Metilen mavisi boyama ile extrahepatic cholangiography (Şekil 4) AgNP tedavi sonrası safra kanalını a_ılabilinirse doğruladı. H & E (Şekil 5) boyama önemli ölçüde azalmıştır iltihabi hücre infiltrasyonu ile AgNPs kontrol fareler için karşılaştırıldığında, tedavi farelerin karaciğer portal alanı gösterdi. Akış Sitometresi sonuçları önemli ölçüde daha az NK hücreleri AgNP tedaviler sonra (hem gün 9 ve 12) RRV farelerde (Şekil 6) içinde karaciğerleri gösterdi. İmmunohistokimyasal boyama portal Triad'ın AgNP tedavi farelerin NK hücre işaretçisi NKG2D (Şekil 7) önemli ölçüde azaltılmış bir ifade ortaya RRV fareler için karşılaştırıldı.
Şekil 1: ilk şırınga penetrasyon pozisyon. Kırmızı noktalı çizgi P6 yenidoğan fare karın için paralel çizgi gösterir; sarı ok iğne noktasını gösterir; kırmızı ok iğne açı belirtir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: karaciğer alt kenarına yüzeye iğne. Sarı noktalı çizgi fare karaciğer alt kenarına gösterir; kırmızı ok enjeksiyon sırasında iğne konumu gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir deneme BA fare modeli sendromunda BA AgNPs etkisi. (A) Bu panel yenidoğan fareler görünümünü üzerinde gösterir 9 ve 12 gün sonra iğne ile RRV yalnız ve 3 gün ve 6 gün sonra bir enjeksiyon AgNPs (RRV + AgNPs) ile. (B) Bu panel farklı zaman noktalarda her grupta fareler ağırlığını gösterir; x-eksen gösterir fare doğduktan sonra gün sayısı ve y-ekseni vücut ağırlığı kat değişikliği gösterir. P < 0,01 ile öğrenci t-test karşılaştırma RRV + AgNp grup RRV kontrol grubuna; n = n kontrol grubunda 16 RRV grup ve n 18 = 17 RRV + AgNP = grubu. (C) Bu panel, her grupta fareler survival oranı gösterir. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Extrahepatic cholangiography. Bir kontrast ajan olarak extrahepatic safra kanallarının a_ılabilinirse algılamak ve esir alma imge için kullanıldı. Mavi noktalı çizgi extrahepatic safra kanalını yönünü gösterir; kırmızı ok bir ortak safra kanalını daralma gösterir; siyah ok BA gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: H & E boyama. Her grup gün 9 ve 12 farelerin karaciğer doku toplanmış, sabit, kesitli ve H & E. kısaltmalar ile lekeli: PV portal ven, BD = safra kanalını =. Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: yüzde NK hücreleri karaciğer dokusunda. (A)fare karaciğer hücre süspansiyonlar 9 ve 12 gün işlendi ve NK hücreleri oranı akış sitometresi tarafından tespit edildi. (B) Bu panel NK hücreleri yüzdesini gösterir (NKp46+CD4+) AgNP enjeksiyon sonra farklı zaman noktalarda her grupta. Y-eksen kontrol grubunda yüzde göre 9. gün ve gün 12.* *P 0,01 < hesaplanmıştır NK hücreleri, yüzdesi olarak kat değişiklik gösterir ve *P < 0,05, öğrencinin tile-karşılaştırma testi RRV + AgNp grup RRV kontrol Grup, n = 10 her grup. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: immunohistokimyasal her tedavi grubu farelerde portal alanı içinde NK hücre işaretçisi NKG2D için boyama. Her tedavi grubu farelerde portal alanı NK hücre işaretçisi NKG2D ifade immunohistokimyasal boyama tarafından tespit edildi. Uzun oklar, safra kanalları gösterir; kısa oklar NK hücreleri gösterir. Kısaltmalar: PV: portal ven, BD: safra kanalını. Sscale bar = 50 µm. Bu şekil Zhang ve ark. değiştirildi 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: klinik laboratuvar muayene karaciğer fonksiyonu ile ilgili molekül düzeylerinin. Periferik kan her grupta farelerde karaciğer fonksiyon ölçmek için kullanıldı. ALT: alanin aminotransferaz, AST: aspartat aminotransferaz, ALP: alkalen fosfataz, TP: Toplam protein, ALB: albümin, GLO: globulin, TBIL: Toplam bilirubin, DBIL: direkt bilirubin, IBIL: dolaylı bilirubin ve TBA toplam safra asitlerinin =. P < 0,05 ve **P < 0,01, bir öğrenci t-test için RRV yalnız grup n karşılaştırıldığında her kohort için = 10 her grup. Tüm biyokimyasal göstergesi verileri ortalama ± SD görüntülenir Bütün fareler üç grupta 12 günlüktün. Bu tablo Zhang ve ark. değiştirildi 18. bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
AgNPs güçlü geniş spektrumlu antibakteriyel özellikleri ve güçlü geçirgenliği22sergi; Ayrıca, bunlar antibakteriyel Medikal Ürünler23bir dizi üretmek için kullanılır. Ancak, AgNPs bir kez onlar organlarda birikir ve bu sebat toksik etkileri24,25için neden olabilir temizlemek için uzun bir zaman alabilir. Bir önceki çalışmada akut toksisite ve AgNPs genotoxicity tek damardan enjeksiyon bir fare deneyinde sonra muayene ve AgNPs akut karaciğer ve böbrek hasarına neden olabilecek sonuçlar gösterdi. AgNPs timus ve dalak17de dahil olmak üzere ana bağışıklık sistemi organlarında birikmiş. Bu fare BA modelde, bizim veri kısmen NK hücre inhibisyon tarafından aracılık ettiği öneririz BA sendromu AgNPs tedaviyle iyileştirmiştir. Ancak, AgNPs uzun vadeli etkileri bağışıklık düzenlenmesi ve fare geliştirme için potansiyel toksisitesi değerlendirmek için daha fazla bir araştırma gerektirir.
Yöntemi açısından başarılı bir ameliyat için bazı ek notlar şunlardır: oda sıcaklığında AgNP kollajen karışımı hızlı bir şekilde yarı katı jel haline gelecektir çünkü (ı) AgNP kollajen karışım hazırlama süreci buza yapılmalıdır ki enjeksiyon için kullanılamaz. Hazırlık sonra AgNP kollajen karışımı 4 ° C'de muhafaza edilmelidir (ii) sadece 1 mL insülin şırınga enjekte ilaç kaçağı azaltan küçük çaplı nedeniyle kullanılmalıdır. (III) önceki çalışmalar genel olarak incelendiğinde AgNPs etkisini sözlü16 ya da yolu ile İntravenöz enjeksiyon17yönetilen. Bizim hayvan deneylerinde deneysel konularda yenidoğan fareler vardır; Böylece, intravenöz enjeksiyon neredeyse mümkün değildir ve biz bir ı.p. enjeksiyon kullanılır. AgNPs enjeksiyon BA belirtileri farelerde geliştirilmiş. (iv) enjeksiyon başında alt ekstremite fare fareyi hareket etmesini önlemek için el ile sabitlenir. Bu yöntem doğru miktarda ilaç olmadan herhangi bir karın boşluğu içine enjekte edilir ve daha fazla deneme etkinliğini garanti sağlar. (v) farelerde neonatal, mide ve dalak sol karın ve mide sütle dolu. Karaciğer alt kenarına yüzeyine AgNP karışımı enjekte iğne fareyi sağ uyluk yukarıda eklenir. İğne sol taraftan eklediyseniz, kolayca ya da mide, karın boşluğu veya kanama neden dalak akışı için süt neden delik. (vi) yenidoğan farelerde karın duvarı ince olduğu için uyuşturucu sızıntısı çapraz iğne karaciğer alt kenarına ulaşmak için karın duvarına yakın 15 ° açıyla ilerleyen önlenebilir.
Bu RRV kaynaklı Mouse BA modeli AgNPs cesaret verici etkisini gözlemledim. AgNPs değişen virüs enfeksiyonları ve hastalıklar tedavilerde kullanılan önceki çalışmaları ile birlikte, bu AgNP verileri bir anti-virüs enfeksiyonları in vivo uygulamada olasılığını göstermektedir. Bu deneyler AgNPs farmakokinetik olarak ölçüm yöntemleri AgNP dozlarda kontrolünü zorlaştırır AgNPs için eksikliği nedeniyle tamamen açık değildir kısıtlamasıdır. Daha fazla çalışma mekanizmasını anlamak ve gelecekteki hastalığı tedavi içinde yan etkileri azaltmak için bize yardımcı olacaktır AgNPs hücre içi hedefi için de gereklidir.
Yazarlar ifşa gerek yok.
Burada kullanılan AgNPs C. M. Che Hong Kong Üniversitesi Kimya bölümü üzerinden bir hediyeydi. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (No. 81600399) ve bilim ve teknoloji proje Guangzhou (No.201707010014) tarafından finanse edildi.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BALB/c mouse | Guangdong Medical Experimental Animal Center | SYXK2017-0174 | Animal experiment |
Rhesus rotavirus (RRV) | ATCC | ATCC VR-1739 | Establish biliary atresia mouse model |
MA104 cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | For laboratory use only |
DMEM | Thermo Fisher | 10569010 | Mammalian Cell Culture |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10099141 | Mammalian Cell Culture |
collagen Type I | CORNING | 354236 | For research use only |
PBS buffer | OXOID | BR0014G | For washing |
NaOH | Sigma | 1310-73-2 | Adjust the PH value |
AgNP | Antibacterial Note: The AgNps was a gift from Prof CM Che. in the Department of Chemistry, the University of Hong Kong. | ||
Insulin syringe with integrated needle | BD | 9161635S | For medical use |
15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430791 | For laboratory use only |
1.5 mL Microcentrifuge Tube | GEB | CT0200-B-N | For laboratory use only |
Microscope | Nikon | ECLIPSE-Ci | For laboratory use |
Dissecting/Intravital microscope | Nikon | SMZ 1000 | For laboratory use |
anti-Mouse NKp46 FITC | eBioscience | 11-3351 | For research use only |
anti-Mouse CD4 PE-Cyanine5 | eBioscience | 15-0041 | For research use only |
Monoclonal Mouse Anti-Human CD4 | DAKO | 20001673 | For research use only |
anti-NKG2D | RD | MAB1547 | For research use only |
BD FACSCanto Flow Cytometer | BD Biosciences | FACS Canto Plus | For laboratory use only |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır