Bu iletişim kuralı özel çeşitliliği ile sentetik antikor fajının görüntülenen Kütüphane inşaatı için detaylı bir yordam açıklanır. Sentetik antikorlar temel araştırma geniş uygulamalardan hastalığı teşhis ve tedavi için var.

Monoklonal antikor (mAbs) temel araştırma ve ilaç için talep her yıl artmaktadır. Hibridoma teknoloji mAb development 1975 yılında ilk raporunu beri için baskın yöntemi olmuştur. Humira, ilk fajının elde edilen antikor ve en çok satan mAbs biri 2002 romatoid artrit klinik tedavi için kabul edildi beri alternatif bir teknoloji olarak, fajının görüntüleme yöntemleri mAb gelişimi için giderek daha caziptir. MAb geliştirme teknolojisi olmayan bir hayvan dayalı olarak FAJ ekran antijen immünojenisite, insanlaştırma ve geleneksel Hibridoma teknolojisi tabanlı antikor geliştirme gerekli olan hayvan bakım atlar. Bu protokol için farklılıkların 10⁹-10¹⁰ tek bir adım ile elde edilebilecek olan kütüphanelerin sentetik fajının görüntülenen Fab inşaat için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu iletişim kuralı oluşur: 1) yüksek verimli elektro-yetkili cep hazırlık; 2) çıkarma urasil içeren tek iplikçikli DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel'ın yöntemi Oligonükleotid yönetmen mutagenesis dayalı; 4) elektroporasyon ve Kütüphane boyutu hesaplanması; 5) katlama için protein A/L-esaslı enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) ve işlevsel çeşitlilik değerlendirme; ve 6) DNA dizi analizi çeşitlilik.

mAbs geniş uygulamaların temel araştırma hastalığı teşhis ve tedavi için arasında değişen vardır. 2016 yılı itibariyle, 60'tan fazla mAbs Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve ilaç Yönetimi (USFDA) tarafından otoimmün hastalıklar, kanser ve enfeksiyon hastalıkları^1,2klinik tedavisi için onaylanmıştır.

1975 yılında, Kohler ve Milstein bildirilen bir teknik 'hybridomas' ve bu teknik anılacaktır hücresel bir kaynaktan gelen tek bir klonal özgüllüğü sıra sürekli nesil için daha sonra tıp ve sanayi^{3 temel taşı haline geldi ,4}. Bu yöntem tarafından mAbs nesil antijen üretim, fare bağışıklama, B lenfositler çıkarımı, fusion B hücreleri ile ölümsüz Hibridoma hücreleri, klon seçimi, kurmaya miyelom hücreleri ve tedavi uygulamaları için de dahil olmak üzere çeşitli adımlar gerektirir, insanlaştırma insan anti-fare antikor (HAMA)^4,5önlemek için gereklidir. Ancak, bu teknoloji için toksinler, patojenler ve son derece korunmuş proteinler gibi antijenleri vivo içinde bağışıklık yanıtının mAb üretim⁵için tetikleyen görece etkisiz.

1978 yılında, Hutchison ve ark. bir kalıntı tek iplikçikli bakteriyofaj virüs⁶doğrudan mutagenesis bir Oligonükleotid kullanımı rapor. 1985 yılında, Smith yabancı gen parçaları çerçevede fajının kat protein III kodlama gen ile erimiş ve böylece fajının yüzeyinde onun infektivite⁷ödün vermeden görüntülenebilir bildirdi. Bunlar işleri öncü bağışıklık, saf kitaplıklarda antikor fajının görüntülenen sonraki inşası için bir temeli atıldı ve sentetik için tek-zinciri değişken parçası (scFv) ve antijen bağlayıcı parçası (Fab) biçimleriyle formları tedavi mAb development^8,9. Görüş teknik açıdan fajının antikor ekran tabanlı geliştirme bazı antijenleri-ebilmek poz vermek sınırlamaları aşmak için yardımcı olabilir mAb Hibridoma tabanlı geliştirme için tamamlayıcı bir yaklaşım sunuyor ve insanlaştırma işlemek Hibridoma kaynaklı antikorlar genellikle⁵gerektirir. 2016, tarihi itibariyle 6 fajının görüntü elde edilen mAbs piyasada Humira, romatoid artrit, tedavisinde kullanılan en başarılı mAbs biri de dahil olmak üzere onaylanmış olan ve çok fajının görüntü elde edilen antikor aday çeşitli aşamalarında klinik şu anda soruşturma¹⁰.

Bağışıklık ve saf fajının antikor kitaplıkları tamamlayıcılık belirleme çeşitliliği için hafif ve ağır zincir (CDRs) bölgelerde doğal bağışıklık repertuar (Yani, B hücreleri) türetilir. Buna ek olarak, sentetik fajının antikor kütüphanelerde CDRs çeşitliliği tamamen yapay. Kütüphane inşaat sentetik yaklaşımlar sıra çeşitlilik tasarım üzerinde tam denetim sağlamak ve antikor yapısı mekanik çalışmaları için fırsatlar sunuyoruz ve^11,12işlev. Ayrıca, sentetik kitaplıkları için bir çerçeve, büyük ölçekli endüstriyel gelişme^11,12kolaylaştırmak için kütüphane inşaat önce optimize edilebilir.

1985 yılında Kunkel site yönettiği mutasyonlar M13 bakteriyofaj içine verimli bir şekilde tanıtmak için bir tek iplikçikli DNA (ssDNA) mutagenesis şablon tabanlı yaklaşım bildirdi¹³. Bu yaklaşım daha sonra yaygın olarak FAJ görüntülenen kitaplıkları yapımı için kullanıldı. Kimyasal sentez DNA oligonucleotides çeşitlilik Fab CDRs tanıtmak için tasarlanmış bir phagemid bir antikor omurga şablonuyla içine dahil edilmiştir. Bu süreçte phagemid bir urasil içeren ssDNA (dU-ssDNA) ifade edilir ve oligonucleotides CDRs komplementer ve çift iplikçikli DNA (dsDNA) T7 DNA polimeraz ve T4 DNA ligaz sentezlemek için genişletilmiş. Son olarak, oluşturulan ds-DNA tarafından elektroporasyon Escherichia coli tanıttı olabilir.

Yüksek çeşitlilik, Kütüphane fajının görüntülenen inşaat, yüksek voltajlı elektroporasyon elektro-yetkili hücre ve kovalent bir iki bileşenli karışımı için kapalı dairesel dsDNA (CCC-dsDNA) dikkatli bir şekilde hazırlanmalıdır. Sidhu vd. elektro-yetkili hücreleri ve DNA hazırlanması geleneksel yöntemleri ve büyük ölçüde gelişmiş kitaplık çeşitlilik¹⁴değiştiren.

Bu protokol için farklılıkların 10⁹-10¹⁰ tek bir adım ile elde edilebilecek olan kütüphanelerin sentetik fajının görüntülenen Fab inşaat için bir yöntem açıklanmaktadır. Şekil 1 gösterir inşaat Kütüphanesi dahil olmak üzere genel bir bakış: 1) yüksek verimli elektro-yetkili cep hazırlık; 2) dU-ssDNA çıkarılması; 3) Kunkel'ın yöntemi Oligonükleotid yönetmen mutagenesis dayalı; 4) elektroporasyon ve Kütüphane boyutu hesaplanması; 5) katlanır için protein A/L tabanlı ELISA ve işlevsel çeşitlilik değerlendirme; ve 6) DNA dizi analizi çeşitlilik. Tüm reaktifler, soy ve donanımları malzemenin tablolistelenir. Tablo 1 reaktif kurulumu gösterir.

Not: Filtre steril ipuçları boyunca Feyc ile uğraşırken pipet silah ve çevresi kirlenmesini önlemek için kullanılmalıdır. Bakteri ve Feyc ile işleme deneyler aseptik alan veya başlık kullanılmalıdır. Feyc deneme alanı fajının kirlenmesini önlemek için % 70 etanol tarafından takip % 2 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) kullanarak temizlenmesi gerekir. Bu protokol için seri dilutions yapmak için yeni ipuçları her seyreltme için kullanılmalıdır.

1. E. Coli SS320 elektro-yetkili cep hazırlık

1. Önceden sıcak LB/tet agar plaka (hazır ve saklı, 4 ° C 1 - hafta eski daha az) 37 ° C kuluçka 1 h. için steril aşılama döngü veya çizgi bir gliserol hisse senedi Önceden ısıtılmış LB/tet agar plaka üzerine E. coli SS320 hücrelerinin dışarı için steril ucu bir zikzak direc kullanın Tion plaka yüzeyi boyunca yavaşça. 37 ° C kuluçka gecede yaklaşık 12-15 h için plaka kuluçkaya.
2. Ertesi gün, iyi ayrı bir koloni zikzak çizgi boyunca alıp içine 2YT/tet orta bir 50 mL yuvarlak alt tüp 10 mL döngünün orta daldırma ve kısa bir süre karıştırarak aşılamak için bir steril aşılama döngü veya steril ipucu kullanın.
3. 37 ° C'de yaklaşık 3-4 h için 200 devirde OD₆₀₀ 0.4-0.8 (günlük faz büyüme) adlı ulaşılana kadar sallayarak ile kuluçkaya. Monitör OD₆₀₀ 2 h. Bu dönemde 5 LB/tet agar tabak (hazır ve saklı, 4 ° C 1 - hafta eski daha az) 37 ° C kuluçka için en az 1 saat önceden sıcak.
4. Titresi 1 x 10 ile laboratuvar stoktan 20 μL M13KO7 yardımcı phage ekleme birimi (cfu) /mL steril 1 180 μL şekillendirme¹³ koloni X 10 hazırlamak için PBS autoclaved 1.5mL tüpler panolarında seri dilutions.
5. Aliquot 4 mL autoclaved ve sıvı 2YT üst agar 5 X 14 mL içine alt tüpler yuvarlak, sırasıyla her tüp ile dokuzuncu için beşinci panolarında seyreltme, seyreltme bir etiket ve 2YT en iyi agar sıvı devlet korumak için 65 ° C kuluçka kuluçkaya.
6. Log fazı E. coli SS320 Mix 500 μL hücreleri M13KO7 seyreltme tüp içine (beşinci panolarında seyreltme dokuzuncu için seçin panolarında seyreltme) ve 5-10dk için 37 ° C kuluçka kuluçkaya.
7. Adım 1.6 kuluçka sırasında oda sıcaklığında (RT) ile yaklaşık 42 ° c civarında 5 min için soğumasını adımından 1.5 2YT üst agar transfer İç bilek 2YT üst agar sıcaklığını sınamak için kullanın; kalması gereken sıvı olarak. Her seyreltme karışımı 1.5 adımından ilgili her 2YT en iyi agar tüp aktarın. Her tüpün kapağı sıkın ve baş aşağı birkaç kez hafifçe çevirerek ve kabarcık önlemek için kısa bir süre karıştırın.
8. Dikkatli bir şekilde önceden sıcak LB/tet agar tabağı (Adım 1.3) kenarı boyunca her karışımı dökün ve biraz tam ve eşit olarak plaka karışımı ile baloncuklar tanıtım kaçınırken doldurmak için plaka eğim. Tabakları her plaka içinde en iyi agar kuvvetlendirmek ve 2YT üst Ağar kaplamalar gecede için yaklaşık 15-18 h 37 ° C'de kuluçkaya RT için yaklaşık 5-10 dk. tutun.
9. Sonra adım 1.8 ile gece büyüme seyreltme plaka seçin plak aşı için 100-200 ortalama büyüklükte, tek, iyi ayrılmış plaklar. Bir yandan agar plaka karşı bir ışık kaynağı ve dikey olarak üst agar bıçaklamaya kadar steril pipet ucu ile yüklenen bir pipet silah tutmak için diğer el tutmak için bir tek ve iyi ayrı plaket toplamak ve.
   1. Pipet ucu biraz üst agar plak ile ayırmak için eğik. Yukarı ve aşağı 2YT/kan/tet orta 1 mL ile önceden yüklenmiş bir 14-mL yuvarlak alt kültür tüp içine plaket agar çıkarmak için birkaç kez pipet (bkz. Tablo 1).
   2. Toplamda 3-5 plaket almak için bu yordamı yineleyin. Bir plak zayıf ve nispeten küçük bir bakteri koloni ile karşılaştırıldığında olabilir gibi birkaç plaklar toplama amacı başarılı aşılama, sağlamaktır. Plaklar ile 200 devir / dakikada sallayarak 8 h 37 ° C'de için büyümek.
10. Kültür 2YT/kan/tet ortamda 250 mL şaşkın şişesi 50 mL içine büyüyen bir tüp aktarın. 37 ° C'de yaklaşık 12 h için gecede 200 devirde sallayarak ile büyümek.
11. Superbroth/tet/kan orta her 900 mL 5 mL gecede kültür ile içeren üç 2-L şaşkın şişeler aşılamak. 37 ° C'de için 6-7 h OD₆₀₀ 0,6-0,8 çevresinde 200 devirde sallayarak ile kuluçkaya.
12. Bir buz banyosu nazik sürekli el ile dönen ile 5 min için bakteri kültürü üç şişe soğuk. Aşağıdaki adımları prechilled çözümleri ve ekipman buzdaki soğuk bir odada yapılmalıdır.
13. Her şişe dış bardak kuru için Absorbans doku havlu kullanın; bir yandan tezgah ve öte yandan her kabı hafifçe ortamından her santrifüj şişe içine dökün 1-L autoclaved santrifüj şişesinde eğim için kullanın.
14. 5000 × g ve 4 ° C bakteri. cips için 10 dakika için spin
15. Santrifüjü yavaşça süpernatant bir 5-L autoclaved atık kabı dikkatle boşaltmak.
16. Her şişe 100 mL steril filtre 1.0 mM HEPES, pH 7.4, ile doldurulması ve Pelet resuspension 200 devirde yardımcı olmak her şişe bir autoclaved manyetik heyecan çubuğu ekleyin. Girdap ve şişe duvarından tüm Pelet her birkaç dakikada bir manyetik karıştırma sırasında çıkarmak. Pelet çözünmüş sonra her şişe 1.0 mM HEPES, pH 7.4 steril filtre bir ek 400 mL ile doldurun.
17. Santrifüj 5000 × g ve 4 ° C'de 10 dk. Decant süpernatant, şişe heyecan barda istinat.
18. Adımları 1.16 1.17 için bir kez yinelenir.
19. Her Pelet % 10 ultrasaf gliserol steril filtre, 500 ml heyecan çubukları yardımı ile resuspend. Girdap ve şişe duvarından tüm Pelet her birkaç dakikada bir manyetik karıştırma sırasında çıkarmak.
20. Santrifüj kapasitesi ve adım 1.17 olduğu gibi dikkatle boşaltmak. Bir kez adım 1.19 yineleyin. Uzun-kolu autoclaved forseps heyecan bar kaldırmak için kullanın.
21. 5000 × g ve 4 ° C'de 15 dakika Decant süpernatant süreyle santrifüj kapasitesi ve her santrifüj şişe bir pipet ile süpernatant kalan herhangi bir iz kaldırın.
22. 3,0 mL % 10 ultrasaf gliserol için bir şişe ekleyin ve hafifçe Pelet pipetting tarafından resuspend. Süspansiyon için sonraki şişe aktarmak ve bütün granül resuspended ve bir şişenin içine kombine kadar yineleyin. Yüksek konsantrasyonlu hücre yaklaşık 6 mL¹¹ cfu/mL 3 x 10 civarında titresi ile elde edilir.
23. 1.5 mL autoclaved microcentrifuge boru ve bir 96-şey tüp depolama kutusu için en az 1 saat önce bu adımı-80 ° C'de bölücüler olmadan önceden chill. Önceden soğutulmuş microcentrifuge tüpler için soğuk oda aliquots hücre Pelet süspansiyon pipetting önce buzda aktarın. Bir pipet aliquot 350 μL hücre süspansiyon için her 1.5 mL microcentrifuge tüpüne kullanın.
24. Aliquots buz gibi flash için sıvı azot ile dolu bir köpük kutu konteyner içine (3-5 dk) aktarın.
    1. -80 ° C dondurucu için sıvı azot ile köpük kutu taşıma (bkz. Adım 1.23).
    2. 1.5 mL microcentrifuge tüp depolama kutusu-80 ° C dondurucudan çıkarın (bkz. Adım 1.23) ve buza koy.
    3. Hızlı bir şekilde bir metal kafes aliquots sıvı azot dan elek ve tüp Muhafazası kutusuna koyun için kullanın. Mağaza-80 ° C'de
       Dikkat: Sıvı azot yanıklara neden ve güvenliği korumak için özen göstermelidir. Fab omurga phagemid (Fab omurga phagemid hisse senedi 400 ng/µL ultrasaf (MilliQ) su olmalıdır) hazırlanan elektro-yetkili hücreleri verimliliğini denetlemek için kullanın. 1 μg Fab omurga phagemid 10 µL ultrasaf su ve buz üzerinde elektro-yetkili SS320, 350 μL aliquot çözülme ve 0,2 cm boşluk elektroporasyon küvet buz üzerinde prechill.
25. 350 μL elektro-yetkili SS320 hücreleri 10 µL DNA çözdürme sonra ve karışımları buz tutarken birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar tanıtan kaçının.
26. SOC orta için en az 30 dk önce elektroporasyon 37 ° C su banyosunda 50mL tüp içinde önceden sıcak 15 mL. Küvet için 360 μL karışımı aktarmak ve üreticinin yönergeleri izleyerek elektroporasyon gerçekleştirmek.
27. Hemen hücreleri elektroporasyon sonra kurtarma Önceden ısıtılmış SOC orta 1 mL (adımından 1,27) ekleme ve pipetting. Orta Önceden ısıtılmış SOC. 5 mL ile önceden yüklenmiş bir 125 mL şişe küvet transfer
28. Küvet iki kez yıkayın, her zaman 1 mL ile Önceden ısıtılmış SOC orta ve orta 125 mL şişe nakletmek (bkz. Adım 1,27). Önceden ısıtılmış SOC orta son hacmi 125 mL şişeye 10 mL ekleyin.
29. 200 devir / dakikada sallayarak ile 30 dk 37 ° C'de 10 mL hücre kültürü kuluçkaya.
30. Transfection verimlilik ve M13KO7 öncesi enfeksiyon oranını belirlemek için seri dilutions olun.
    1. Bir çok kanallı pipet 2YT medya 180 μL her kuyuya bir 96-microwell plaka tek bir sütun eklemek için kullanın.
    2. 8 on kat seri olun dilutions: pipetting tarafından adım 1.29 plaka, mix ilk de kültür 20 μL transfer ve karışımı 20 μL de diğerine aktarmak. Seri seyreltme sonu için bu adımı yineleyin.
    3. Her seri seyreltme yinelenen LB/karbonhidrat, LB/kan ve LB/tet Tabaklarda 10 μL plaka.
    4. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    5. Verimliliği hesaplama formülü: M seyreltilmiş kapaðý 10^N sayılır ortalama koloni sayısı olduğunu varsayalım (N ise 1-8). Fab omurga phagemid LB/carb plaka E. coli SS320 elektro-yetkili cep transfection verimliliğini M X 10^{N + 3} cfu/µg için eşittir. M13KO7 öncesi enfeksiyon oranını LB/kan ve LB/tet kolonilerde oranını tahmin edilmektedir. E. coli SS320 yetkili hücreleri ile Fab omurga phagemid transfected yüzdesi koloniler halinde LB/carb ve LB/kan oranı üzerinden tahmin edilmektedir.

2. Phagemid şablondan urasil içeren ssDNA (dU-ssDNA) hazırlanması

Not: A Fab omurga phagemid dU-ssDNA hazırlık¹⁵için şablon olarak kullanıldı daha önce bildirdi. Fab omurga phagemid mimarisini Şekil 2' de gösterilmiştir. Plazmid spin kit (QIAprep Spin M13) dU-ssDNA hafif değişiklikler ile çıkarım için kullanılır.

1. 1 h. çizgi E. coli CJ236 hücreleri (veya başka bir dut−/ung− soy) gliserol hisse senedinin dışarı için 37 ° C kuluçka LB/cmp plaka (hazır ve saklı, 4 ° C 1 - hafta eski daha az) önceden kısır döngüler veya Önceden ısıtılmış LB/cmp plaka üzerine ipuçları ile sıcak. Bir gecede yaklaşık 12-15 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
2. Bir koloni ile steril bahşiş almak ve 2 mL 2YT/cmp orta bir 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp içine aşılamak.
3. OD₆₀₀ 0.4-0.8 (günlük faz büyüme) adlı ulaşılana kadar 3-4 h için 200 devirde sallayarak ile orta 37 ° C'de kuluçkaya.
4. 5-10 μL fajının Fab omurga şablonunun kültürün içine ekleyin ve 37 ° C'de fajının enfeksiyon izin vermek 30 dk için 200 devirde sallayarak ile kuluçkaya.
5. Kuluçka sonra çizgi kültür Önceden ısıtılmış LB/carb plaka üzerine 10 μL dışarı için steril bir ipucu 37 ° C'de kullanın. Bir gecede yaklaşık 12-15 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
6. 3 mL 2YT/karbonhidrat/cmp 14-mL polipropilen yuvarlak alt tüp içinde starter kültürü aşılamak ve 37 ° C'de yaklaşık 12 h için gecede 200 devirde sallayarak ile büyümek için bir koloni E. coli CJ236 içeren Fab omurga phagemid alın.
7. 30 mL 2YT/karbonhidrat/cmp 250 mL şaşkın şişe içine 0.3 mL starter kültürü aşılamak.
8. OD₆₀₀ 0.4-0.8 (günlük faz büyüme) adlı ulaşılana kadar 3-4 h için 200 devirde sallayarak ile hücre kültürü 37 ° C'de kuluçkaya.
9. M13KO7 ekleyin (laboratuvar hisse senedi, titresi olarak yaklaşık 1 x 10¹³ cfu/mL) kültürü için enfeksiyon (MOI) yaklaşık 10 çokluğu ile 2.8 ve M13KO7 son titresi yaklaşık 1 x 10¹⁰ cfu/mL.
10. 200 devir/dakika ve 37 ° C için 1 h kuluçkaya.
11. Santrifüjü 5000 × g ve 20 dk için 25 ° C, 50 mL yuvarlak alt tüp tarafından kültür cips.
12. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet 30 mL taze 2YT/karbonhidrat/kan/üridin ile resuspend. Resuspension bir yeni 250 mL şaşkın şişe içine aktarın.
13. 200 d/d ve 22-24 h için 25 ° C, kuluçkaya.
14. Kültür 2,13 adımından 50 mL yuvarlak alt tüp içine aktarmak ve süpernatant fajının bakteri hücre Pelet ayırmak için 12.000 × g 20 dk için de kültür santrifüj kapasitesi. FAJ süpernatant yeni 50 mL yuvarlak alt tüp içine aktarmak ve 1/5 ekleyin fajının çökelti PEG/NaCl çözüm son hacim. Mix iyi ve buz fajının parçacıklar çökelti 30 dk için kuluçkaya.
15. 30 dakika Decant süpernatant süreyle santrifüj 12.000 × g ve 4 ° C ve 2 dakika süreyle 4.000 × g ve 4 ° C, santrifüj kalan süpernatant Aspire edin.
16. Feyc Pelet 2 ml steril filtre 1 X PBS ve 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer resuspend. 5 dakika içinde kalan herhangi bir bakteriyel enkaz kaldırma ve süpernatant fajının yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer ve 4 ° C'de depolamak için bir benchtop microcentrifuge için 12.000 × g, santrifüj kapasitesi
17. E. coli SS320 ile yan yana karşılaştırma yoluyla E. coli CJ236 urasil birleşme verimlilik kontrol edin.
    1. 2YT medya 180 μL 96-şey plaka tek bir satırı her şey için ekleyin.
    2. On 10 kat seri olun dilutions: FAJ süpernatant 20 μL plaka ilk kuyusu transfer mix pipetting tarafından ve karışımı 20 μL de diğerine aktarmak. Seri seyreltme sonu için bu adımı yineleyin.
    3. Feyc 10 μL log fazı 90 μL E. coli CJ236 ve E. coli SS320 bulaştırmak için son sekiz seri dilutions ekleyin (OD₆₀₀ 0.4-0.8 =). Nazik sallayarak ile 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Seri seyreltme her enfeksiyon E. coli CJ236 ve E. coli SS320 yinelenen 2YT/Carb Tabaklarda gelen 10 μL plaka.
    5. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
    6. Titresi hesaplama formülü: M seyreltilmiş kapaðý 10^N sayılır ortalama koloni sayısı olduğunu varsayalım (N olan 1-10 arası). E. coli CJ236 veya E. coli SS320 titresi M X 10^{N + 2} cfu/mL eşittir. E. coli CJ236 ve E. coli SS320 titresi oranı üzerinden urasil birleşme verimliliğini tahmin ediyoruz.
18. 1/100 hacmi 1.5 mL microcentrifuge tüplerde süpernatant fajının fajının yağış arabelleğe MP ekleyin ve baş aşağı yavaşça çevirmek için birkaç kez karıştırın. En az 2 dk. parçacıklar kültür ortamından çöktürülmüş fajının RT kuluçkaya ve böylece, bulutlu bir çözüm bu noktada görünür olmalıdır.
19. Örnek--dan adım 2.18 bir plazmid spin sütun için (örneğin, QIAprep) bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde geçerli. Tek çevirişte sütun Bağlama kapasitesi ssDNA için en az 10 µg. santrifüj 6000 × g ve 25 ° C 30 ulaşabilirsiniz benchtop microcentrifuge s. Akış-1.5 mL microcentrifuge tüpte olan aracılığıyla atın. Feyc parçacıklar bu aşamada sütun matrise bağlı kalır.
20. 0.7 mL ( konuyabakın) UT-MLB fajının lizis ve bağlama arabellek sütuna ekleyin ve RT en az 1 dk. için kuluçkaya.  6.000 x g ve 25 ° C 30 s ve akışı üzerinden atmak için santrifüj kapasitesi.
21. UT-MLB arabellek başka bir 0.7 mL ekleyin ve RT en az 1 dk. için kuluçkaya.
22. 6000 × g 30 s. atma için akış yoluyla santrifüj kapasitesi. Bu aşamada fajının kat protein sütun matrise bağlı kalır dU-ssDNA ayrılır.
23. 0.7 mL yıkama arabellek PE içeren etanol üreticinin yönergeleri izleyerek ekleyin. 6000 × g 30 s ve akışı üzerinden atmak için de santrifüj kapasitesi.
24. Adım 2,23 yineleyin ve sonra santrifüj kapasitesi bir kez daha vasıl 6000 × g 30 s kalan arabellek PE kaldırmak için.
25. Sütun için yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp nakletmek ve 100 μL elüsyon arabelleği EB (10 mM Tris· eklemek CL, pH 8,5) sütun membran ortasına.
26. 10 dk ve santrifüj 6000 × g için 1dk dU-ssDNA elute, RT kuluçkaya. Yaklaşık olarak, 1,5-2,5 μg dU-ssDNA/mL kültür elde edilebilir.
27. TAE jel %1 özel üzerinde electrophoresing 1 μL tarafından eluted DNA analiz. DNA yok bulaşması ile ağırlıklı olarak tek bir bant olarak görünmesi gerekir.
28. Nanodrop Spektrofotometre 260 üzerinde Absorbans ölçerek DNA konsantrasyonu belirlemek nm (₂₆₀ = 1.0 33 ng/μL ssDNA için). Tipik dU-ssDNA konsantrasyonu 200-500 ng/μL içinde vardır.

3. Kunkel'ın yöntemi Oligonükleotid yönetmen Mutagenesis dayalı

Notlar: Küçük ölçekli reaksiyonlar mutajenik Oligonükleotid ve reaksiyon bileşenleri kalitesini garanti etmek için tam ölçekli reaksiyonlar önce yapmak için tavsiye edilir. Bir çizgi film dayalı Kunkel'ın yönteminin Oligonükleotid yönetmen-mutagenesis şekil 3' te gösterilen. Çeşitli amino asit farklılıkların adlandırma¹⁶ (Tablo 2) numaralandırma IMGT ile CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3 bölgeleri olarak tanıtılmaktadır. Her CDR çeşitliliği teorik amino asit, toplam teorik amino asit çeşitlilik ve Oligonükleotid dizileri Tablo 2' de listelenmiştir.

1. Oligonükleotid fosforilasyon T4 polinükleotit kinaz ile
   1. Tek bir CDR, 2 μL 10 X TM arabellek, 2 μL 10 mM ATP ve 1 μL 100 mM DTT ile değişmek için tasarlanmış mutajenik oligonucleotides 0.6 μg birleştirin. Ultrasaf H₂O toplam hacmi 1.5 mL tüp içinde 18 μL ekleyin. Kütüphane yapımı için 4 ayrı ve paralel fosforilasyon tepkileri CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3, anılan sıraya göre karşılık gelen kadar ayarlanır.
   2. 20 U eklemek (2 uL) T4 polinükleotit kinaz her tüp ve 37 ° C'de (reaksiyon 1 Tablo 3' de) 1 h için kuluçkaya. Hemen TAV için kullanın.
2. Oligonucleotides şablon, tavlama
   1. İçin 20 μg dU-ssDNA şablonunun 0.5 mL tüp içinde 250 μL son hacmi 25 μL 10 X TM arabelleği, her fosforile Oligonükleotid çözüm ve ultrasaf H₂O 20 μL ekleyin. İyice karıştırın ve tepki 2 Tablo 3' olarak 0,20 mL PCR tüpleri (50 her μL) aktarın. Oligonükleotid ve şablon uzunluğu oranı 1: 100 olduğunu varsayarak bu DNA miktarları molar oranı 3:1 Oligonükleotid ve şablon, arasında sağlar.
   2. Bir PCR makinesi 90 ° C'de 3 dk, 3 dk, 50 ° C için tepki kuluçkaya ve 5 min için 20 ° C.
3. CCC-dsDNA enzimatik sentezi
   1. 250 μL komplementer Oligonükleotid/şablon karışıma tepki 3 Tablo 3' olarak 10 μL 10 mm ATP, 25 mM dNTP Mix 10 μL, 100 mm DTT 15 μL, 30 Weiss adet T4 DNA ligaz ve 30 U T7 DNA polimeraz ekleyin.
   2. Bir gecede 20 ° C'de 1.5 mL tüp tepki kuluçkaya.
   3. Yıkama ve sentezlenmiş CCC-dsDNA 30 kDa gözenek boyutu membran RT., 0,5 mL santrifüj filtre aygıtla konsantre
      1. Gecede tepki karışımı filtre cihaza aktarmak ve ultrasaf H₂O 400 µL son hacim için ekleyin. 14.000 × g 10 dk de spin; 50'den az μL birimdir.
      2. Aracılığıyla akış atmak, 400 µL ultrasaf H₂O filtre içine ekleyin ve 14.000 × g 10 dk de spin.
      3. 3.3.3.2 bir kez daha yineleyin.
      4. Filtre ters CCC-dsDNA kurtarmak için bir temiz microcentrifuge tüpü yerleştirin. 1000 × g 2 min için de spin; Kurtarılan birim genellikle civarındadır 20-40 μL. Kurtarılan CCC-dsDNA hemen E. coli elektroporasyon için kullanılan veya daha sonra kullanmak için-20 ° C arasında dondurulup. Normalde 20-40 μg CCC-DNA elde edilebilir.
   4. Eluted reaksiyon ürünü reaksiyon sonucu görselleştirmek için dU-ssDNA şablon yanında 1.0 µL electrophorese.

4. adım ve Kütüphane boyutu hesaplama

1. Arıtılmış CCC-dsDNA chill (50 μL maksimum hacmi içinde 20 μg) 1.5 mL microcentrifuge tüp ve 0,2 cm boşluk elektroporasyon küvet buz üzerinde.
2. SOC kitle için en az 30 dk. 37 ° C su banyosunda 50mL polipropilen koni santrifüj tüpü içinde önceden sıcak 20 mL.
3. 350 μL aliquot elektro-yetkili E. coli çözülme SS320 buz üzerinde. Hücreleri DNA için iyice birkaç kez pipetting tarafından ekleyip karıştırın. Kabarcıklar tanıtan kaçının.
4. Karışım için küvet aktarmak ve üreticinin talimatları adım gerçekleştirin. Örneğin, BTX ECM-630 elektroporasyon sistemi kullandığında, ilgili ayarları 2,5 kV alan şiddeti, 125 Ω direnç ve 50 µF kapasite vardır.
5. Hemen Önceden ısıtılmış SOC orta 1 mL ekleyerek ve 125 mL şişe ortamda SOC 17 mL içine aktarma electroporated hücreleri kurtarmak. İki kez SOC orta ve transfer 1 mL ile küvet aynı balon durulama (son hacim ise 20 mL).
6. 200 devir / dakikada sallayarak ile 30 dk 37 ° C'de için kuluçkaya.
7. Elektroporasyon etkinliğini belirlemek.
   1. 2YT medya 180 μL her kuyuya bir 96-microwell plaka tek bir sütun ekleyin.
   2. 8 on seri olun dilutions: 20 mL kültürünün 20 μL plaka ilk kuyusu transfer karışımı ile pipetting ve karışımı 20 μL de diğerine aktarmak. Seri seyreltme sonu için bu adımı yineleyin.
   3. Her birinin içinde yinelenen bir LB/carb plaka üzerinde seri dilutions 10 μL plaka. Her koloni sayımı çapraz kontrol için ayrı LB/carb levhalar üzerine seri dilutions kalan 100 µL plaka. Bu tabakları da ELISA ve sıralaması analiz (bakınız Bölüm 5) tek klonlar sağlayacaktır.
   4. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya
   5. Koloniler 10 μL çoğaltmaları LB/carb plaka üzerinde gelen say. M ortalama koloni sayılan tarih 10^N sayısına kat LB/carb plaka (1-8 N's) olduğunu varsayalım. Toplam Kütüphane boyutu 2 M X 10^{N + 3} kolonileri eşittir.
8. Aliquot 2YT/karbonhidrat/kan orta fajının Kütüphane üretimi için eşit içine iki 2-L şaşkın şişeler, her içeren 500 mL 4,6 adım kültüründen.
9. 37 ° C'de yaklaşık 16 h için gecede 200 devirde sallayarak ile kuluçkaya.
10. İki 1-L autoclaved santrifüj şişe ve 12.000 × g 4 ° C'de de 30 dk santrifüj kültür aktarmak
11. 1/5 ekleyin ve süpernatant iki yeni 1-L autoclaved santrifüj şişe için transfer fajının çökelti PEG/NaCl çözüm son hacim. 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
12. Santrifüj için 12.000 × g de 30 dk ve 4 ° c Dikkatle süpernatant dikkatle boşaltmak ve FAJ Pelet rahatsız edici kaçının. 4000 x g, 1 dk. için spin ve kalan süpernatant bir pipet ile kaldırın.
13. Feyc Pelet 20 mL steril filtre 1 X PBS arabellek ve yeni bir 50 mL tüp transfer ile resuspend.
14. Çözünmeyen madde 12.000 × g de 5 min ve 4 ° c centrifuging tarafından cips Süpernatant yeni bir 50 mL tüp aktarın.
15. Feyc konsantrasyon Spektrofotometre tarafından ölçmek (OD₂₆₈ = 1.0 için bir çözüm olarak 5 X 10¹² fajının/mL).
16. Feyc konsantrasyonu 5 X 10¹² fajının/ml 1 X PBS ile % 10 ultrasaf gliserol içinde ayarlayın.
17. Feyc çözüm 1.5 mL microcentrifuge tüp başına aliquot 1 mL. Hemen kaydırma için kitaplıkları kullanma veya-80 ° C'de depolayın

5. kalite değerlendirmesi Protein A tarafından / L doğrudan bağlama ELISA tahlil ve sıralama

1. Rastgele 2YT/carb her iyi 800 μL içeren bir 96-derin iyi kültür plaka içine adım 4.7.3 LB/carb plaka üzerinde 96 tek kolonileri seç. 3-4 OD₆₀₀ 1000 devirde sallayarak ile h 37 ° C'de için kuluçkaya 0.4-0.8 =.
2. M13KO7 100 μL ekleyin (1 X 10¹¹ cfu/mL) 96 derin bir her şey için de bir çok kanallı pipet ile plaka kültür. 37 ° C'de 1 h için 1000 devirde sallayarak ile kuluçkaya.
3. Bir çok kanallı pipet ile her şey için sefaloridin (500 μg/mL) 10 X konsantrasyon içeren 100 μL, 2YT ekleyin. Gecede 37 ° C'de 1000 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
4. Protein L 1 µg/mL 1 X PBS çözülür. Kat 3/4 kuyuları 30 µL/iyi protein L çözüm ile 384-şey yüksek protein bağlayıcı polistiren tabakta. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
5. Gecede protein L kaplama eriyik--dan adım 5,4 atmak. M-PBST 50 µL ekleyin (engelleme çözüm) tüm 384-şey yüksek protein bağlayıcı polistiren tabakta bir çok kanallı pipet ile Wells. Mikroplaka shaker RT. 1 h için Tabaklarda kuluçkaya
6. Spin aşağı adım 5.3 bir derin 96-şey kültür plaka 3000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de gecede kültür Feyc süpernatant içinde olduğunu.
7. Adım 5.5 engelleme çözümden atmak. M-PBST 15 μL ve her fajının süpernatant (Adım 5.6) 15 μL 3 nüsha ve bir çok kanallı pipet ile 1 sigara kaplı de negatif olarak kontrolü olarak protein kaplı L Wells ekleyin. RT 1 h için 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
8. Feyc çözüm atın. 6 kere ile PBST bir otomatik tabak yıkama 80 μL plaka yıkayın.
9. Her şey bir çok kanallı pipet ile M-PBST 15 μL ve 15 μL Protein A-HRP (1 X PBS içinde seyreltilmiş 1:1, 500), eklemek ve RT 1 h için yaklaşık 200 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
10. Protein A-HRP/M-PBST çözüm atın. Plaka PBST 80 μL 6 kere yıkayın.
11. TMB substrat (30 μL/de) bir çok kanallı pipet ile ekleyin ve 2-3 dakika için renk oluşturuncaya dek kuluçkaya. 1,0 M H₃PO₄ (30 μL/de) ile reaksiyonu durdurmak.
12. 450 de spectrophotometrically plakaları okumak nm. Pozitif klonlar OD₄₅₀ Absorbans protein L Wells M-PBST de 3.0 büyük için ortalama bir oranını gösteren bu olarak tanımlanır.
13. Bir 96-derin, SS320 50 μL 2YT/tet içinde günlük faz için 30 dk RT. az ELISA (Adım 5.6) için kullanılan aynı FAJ 5 μL ile enfekte
14. 2YT/carb 950 μL 96-derin içine de adımından 5.13 ekleyin ve gecede 37 ° C'de 1000 devir / dakikada sallayarak ile kuluçkaya.
15. Mini hazırlık DNA ekstraksiyon kiti tarafından DNA phagemid ayıklayın. VL ters yönde astar kullanın (5'-TCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTA-3') ve VH (5'-GACTACTAATAACATAAAGTCTACGCCG-3') kitaplığı dizisi çeşitlilik tahmin etmek dizi analizi için.

Akış şeması Fab Kütüphane inşaat takip (bakınız şekil 1), önceden bulaşmış fajının E. coli SS320 elektro-yetkili hücreleri M13KO7 yardımcı hazırladık. Fab phagemid omurga Kütüphane yapımı için kullanıldığında bu elektro-yetkili hücrelerin verimliliğini 2 X 10⁹ cfu/µg tahmin edilmektedir (şekil 4).

Urasil birleşme verimliliği kıyasla titresi E. coli CJ236 ve E. coli SS320 hücrelerde, kontrol edildi. E. coli CJ236 ve E. coli SS320 hücreleri dU-ssDNA yataklık fajının tarafından bulaşmış. E. coli SS320 E. coli CJ236 Bu enzimler yoksun ve urasil içeren DNA aşağılamak değil DNA, urasil içeren düşürebilecek enzimler (glycosylase dUTPase ve urasil) vardır. Bir kabul edilebilir urasil birleşme verimlilik elde etmek için titreleri E. coli CJ236 üzerinden en az 10⁴ kez E. coli SS320 insanlardan daha yüksek olması gerekir. Aksi durumda vahşi-türü nüfus verimsiz urasil birleşme nedeniyle inşa antikor kütüphanede uzatmış olursunuz. Şekil 5 fajının ssDNA içine bir verimli urasil birleşme gösteren titresi E. coli CJ236 üzerinden yaklaşık 3 X 10⁵ kez E. coli SS320, bundan daha yüksek olduğunu gösterdi.

Daha sonra hazırlanan ve dU-ssDNA ayıklanır. DU-ssDNA saflık özel Jel Elektroforez (şekil 6) tarafından denetlenir. Sonra Oligonükleotid yönetmen mutagenesis yapılmıştır ve CCC-DNA dU-ssDNA dönüşüm verimliliği değerlendirildi (şekil 6). Üç ürün dU-ssDNA daha düşük hareketliliği ile en hızlı koşu bandı (CCC-dsDNA), orta zayıf bant (çentik grup) ve yavaş çalışan grubun (DNA strand yerlerinden) gibi jel görüntülenmeyecektir.

E. coli SS320 içine adım sonra gece kuluçka plaka Kütüphane boyutu tahmin ediliyor (bkz. Adım 4.7.5). Ortalama Kütüphane boyutu 5 X 10⁹ LB/carb plakaları (Şekil 7) yinelenen seri dilutions üzerinden yapıldı. Ancak, bu aşamada tahmini boyutu Fabs bir frameshift varlığı nedeniyle görüntülemek veya kodon durdurmak, veya misfolded Fabs görüntülemek fajının içerebilir. Sıralama ve ELISA inşa Kütüphane işlevsel çeşitlilik tahmin etmek için kullanılmıştır. 96 rastgele çekilen tek klonlar sıralama analiz için gönderildik. Tablo 4 gösterir 90 96 rastgele çekilen tek klonlar dışında başarıyla, hangi bir erken kodonu (en az bir CDR mutant ile 53 klonları) ve vahşi-tipi kol ile 17 klonlar olmadan 70 klonlar ve ile 20 klonlar içeren sıralı ki bir erken kodonu farklı bölgeler itibariyle. Mutant oranı ile en az bir CDR %76 70 klonlar içinde CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3 mutant oranları % 50, % 57, %53 ve % 56, sırasıyla, iken. Erken kodonu (% 90) ile 20 klonlar içinde erken kodonu esas olarak Oligonükleotid mutagenesis astar % 45 (CDRH1), % 10 (CDRH2), (CDRH3) % 15 ve % 20 (CDRL3) de dahil olmak üzere, frameshift türetilmiştir.

Düzgün katlanmış Fabs, bir protein A görüntüsünü algılamak için / L dayalı ELISA bilinen protein A ve protein L uygun VH framework ve VL framework, sırasıyla^17,18katlama tanıyabilir istihdam edildi. Sıralama analizi ile anlaşma, ELISA tahlil nüsha (şekil 8) pozitif oranı yaşındayken vahşi-tipi kol ile 17 klonlar hepsi olumlu iken 20 klonlar erken kodonu ile tüm negatif olduğunu gösterdi ampirik olarak 3.0 ayarlama. 10 klonlar negatif en az bir CDR mutant ile 53 klonlar 43 klonlar ELISA içinde olumlu katkılarda bulunmuştur; Bu 10 klonlar üzerinden CDRs Fab katlama üzerinde zararlı etkileri olabilir iken klonlar çoğunu de katlanmış gösterir. Toplam 90 klonlar (% 48) dışında 43 klonlar de katlanmış ve en az bir CDR mutant yer. Böylece, oluşturulan Kütüphane fonksiyonel amino asit çeşitliliği bağlı protein A / L ELISA ve sıra analizi tahmini 2.4 X 10 için⁹ (Yani, 5 X 10^%948).

Şekil 1: Fab Kütüphane fajının görüntülenen inşaat bakış. Fab Kütüphane fajının görüntülenen inşaat temel bir dizi adımı izler. İşin içinde yüksek verimli elektro-yetkili bakteri hücreleri hazırlanması, ayıklama dU-ssDNA, Kunkel'ın yöntemi göre Oligonükleotid yönetmen mutagenesis, elektroporasyon ve FAJ Fab Kütüphane boyutu, işlevsel değerlendirme tarafından hesaplanması protein A / L ELISA ve DNA dizi analizi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2: Phagemid Mimarlık Fab Kütüphane yapımı için. Phagemid omurga temel özellikleri tek iplikçikli (f1 ori) ve çift iplikçikli (dsDNA ori) DNA kökeni oluşur çoğaltma ve Ampisilin/carbenicillin direnç gen (AmpR). Fab ekran, alkalen fosfataz organizatörü (PhoA), kontrol altına phagemid bicistronic kaset sürücü ifade ve salgılanmasını içerir: ışık CL (sabit bir salgı sinyal, VL (hafif zincirinin değişken bölge), oluşan zinciri (LC) bölgesi hafif zinciri) ve C-terminal bayrak etiketi; ve ağır zincir (HC) oluşan bir salgı sinyal, VH (değişken bölge) ağır zinciri ve CH1 (Sabit Bölge 1 ağır zincir) p3 fajının küçük kat protein ile erimiş. Hafif zincir ve ağır zincir E. coli periplasm içinde derleme içine Fab Fab ekran fajının yüzeyinde yönlendirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: Kunkel'ın yönteminin şematik dayalı Oligonükleotid Yönetmen: mutagenesis. Bu protokol için biz Kunkel'ın dU-ssDNA şablon hazırlamak için kullanılan yöntem. Oligonucleotides CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3 için tasarlanmış çeşitlilik ile fosforile, şablona komplementer ve ss-DNA CCC-dsDNA için dönüştürmek için kullanılır. E. coli SS320 elektro-yetkili hücrelere elektroporasyon heteroduplex DNA ya vahşi türü ya da mutant formu onarılana; Vahşi türü strand urasil varlığı, nedeniyle onarma işleminin mutant formu ayrıcalıklı kılar ve böylece, mutant form kitaplığı hakimdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 4: M13KO7 tahmini önceden bulaşmış E. coli SS320 elektro-yetkili hücresi verimliliği. Phagemid omurga vektör yetkili hücre çoğalmasıyla verimliliğini kontrol etmek için kullanıldı. Verimliliği hesaplama formülü aşağıdaki gibidir: M en seyreltilmiş kapaðý 10^N sayılır ortalama koloni sayısı olduğunu varsayalım (N ise 1-8) içinde yinelenen. E. coli SS320 verimliliği LB/carb plaka M X 10^{N + 3} cfu/µg için eşittir. 2 X 10⁹ cfu elektro-yetkili hücrelerin verimliliğini olduğunu / µg. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Değerlendirme ssDNA tarafından fajının enfeksiyon E. coli CJ236 ve E. coli SS320 hücre içine urasil şirketleşme. Kunkel'ın yöntemine bağlı olarak, urasil birleşme verimliliği fajının enfeksiyon titresi E. coli CJ236 ve E. coli SS320 hücrelerdeki karşılaştırılması tarafından kontrol edilir. Titresi hesaplama formülü aşağıdaki gibidir: M en seyreltilmiş kapaðý 10^N sayılır ortalama koloni sayısı olduğunu varsayalım (N ise 1-10 arası) ve E. coli CJ236 veya E. coli SS320 titresi M X 10^{N + 2} cfu/mL eşittir. Urasil birleşme verimliliğini E. coli CJ236 ve E. coli SS320 titresi oranı tahmin edilebilir. E. coli SS320 titresi 3 X 10⁷ cfu/mL iken E. coli CJ236 titresi 9 X 10¹² cfu/mL oldu. E. coli CJ236 ve E. coli SS320 titresi oranı 3 X 10⁵oldu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: CCC-DNA Oligonükleotid yönetmen mutagenesis tarafından dU-ssDNA dönüşüm. Oligonükleotid yönetmen mutagenesis CCC-DNA dU-ssDNA dönüşüm verimliliği değerlendirilmiştir. dU-ssDNA tamamen dsDNA için dönüştürüldü. Parçalanmış dsDNA ve DNA strand yerlerinden küçük bir bölümünü ise baskın CCC-dsDNA grubudur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: FAJ titrasyon Kütüphane boyutu hesaplanması için. E. coli SS320 içine adım sonra seri dilutions LB/carb Tabaklarda gelen kütüphane boyutu tahmin edilmiştir. Boyutu hesaplama formülü aşağıdaki gibidir: varsayalım M en seyreltilmiş kat 10^N (N ise 1-8) 2YT/Carb plaka üzerinden sayılır ortalama koloni sayısı, boyutu 2 M 10^{N + 3}X eşittir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: Protein A / L doğrudan bağlama fajının ELISA. Protein L çerçeve de katlanmış kappa hafif zincirinin VL ve protein bir de katlanmış ağır zincir VH çerçevesinde tanımak tanıyabilir. Fab bağlayıcı protein L ve A ile uygun ağır zincir ve hafif zincir katlama gösterir. Kısacası, protein L nüsha ve negatif kontrol M-PBST plaka boyalı, Fab fajının supernatants farklı klonlar üzerinden inkübe protein L ve M-PBST, sonra yıkayın sonra ile protein A-HRP ilişkili Fab fajının yakalamak için kullanıldı. Feyc ELISA okuma başarılı sıralama okuma ile 90 rastgele çekilen klonlar gösterdi. Klon olumlu olarak temsil eden bir eşik çizgiyi yapıldı ampirik olarak tanımlanan oranı OD₄₅₀ Absorbans değeri protein L (ortalama hata çubuğu ile nüsha) negatif kontrol karşı fazla 3.0 neredeydi. Mavi (17 klonları) ve yeşil (20 klonları) kodonu ile mutant bir mutant kodonu kırmızı (53 klonları), vahşi türü (WT) olmadan karşılık gelen üç grup sıralama analize dayalı gösterildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: Reaktif Kur.

Tablo 2: CDR farklılıkların ve mutagenesis astar. Mutasyona uğramış için CDR bölgelerde DNA dizileri kırmızıyla gösterilir; dizileri IUPAC nükleotit kodu kullanılarak biçimlendirilir. "X" tri-nükleotit üzerinden farklı amino asit kümelerini içeren için tasarlanmış bir karışımı olduğunu gösterir; "n" X. beş astar X farklı bir dizi ile farklı sayıda kullanılan CDRL3 veya CDRH3, sırasıyla çeşitlendirmek için değişken uzunluğu CDRL3 ve CDRH3 oluşturmak için gösterir. Kalıntı numaraları IMGT adlandırma tarafından tanımlanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.

Tablo 3: Prosedürleri ve bileşenleri Kunkel'ın yönteminin tepki dayalı.

Tablo 4: Dizi analizi, CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3 sentetik Fab kitaplığından.

Yüksek çeşitlilik, Fab kitaplıkları fajının görüntülenen, kalite kontrol oluşturmak için onay noktaları yeterliliğinin elektro-yetkili hücreleri, dU-ssDNA şablon, verimliliğini kalitesini de dahil olmak üzere inşaat süreci çeşitli aşamalarında izlemek için gereklidir CCC-dsDNA sentezi, titresi çoğalmasıyla, Fab katlama ve CDRs amino asit çeşitliliği Fab-fajının klon dizi analizi tarafından sonra.

Yüksek verim ve dU-ssDNA saflığı yüksek mutagenesis oranı için gerekli. Deneyim, gecede fajının indüksiyon 25 ° c fajının indüksiyon 37 ° C'de gecede bundan daha fazla dU-ssDNA yol açabilir. Bir önceki rapor¹⁹ile anlaşma bu. SsDNA çıkarma ile ilgili ilk plazmid Spin Kiti (QIAprep) MLB fajının lizis ve bağlama için yer. Daha sonra MLB ile bilinmeyen bir nedenle üretilmiyor ve PB tarafından değiştirilir. DU-ssDNA verim MLB tedavi ile karşılaştırıldığında Bu PB tedaviden çok daha düşük olduğunu fark ettik. Bu protokol için MLB değiştirmek ve dU-ssDNA ilk Spin Seti'nden benzer verimidir bulundu için UT-MLB²⁰ adında bir reaktif kullanılır.

CDRH3 ve CDRL3 çok çeşitli Antijen tanıma²¹, belirli bir amino asit kombinasyonları ve oranları ile özel bir çeşitlilik tanıtmak ve artıklık önyargı ve stop kodon tarafından dejenere kodon gibi tanıttı kaldırmak için vardır NNK (N, a/c/G/T; ekimolar K, G/T ekimolar), trimer kodon phosphoramidite tabanlı oligonucleotides²² belirli amino asit CDRH3 ve CDRL3 için tasarlanmıştır birine karşılık gelen bir trimer kodonu ile. Ayrıca, değişken uzunluk-in CDRH3 ve CDRL3 oligonucleotides farklılıkların daha da artırmak için kullanılmıştır.

Sonra CCC-dsDNA enzimatik sentezi, genel olarak üç grup özel Jel Elektroforez tarafından gözlenir ve bantları smear açık olmalıdır. Bunlar arasında yüksek mutasyon oranı (% 80) elektroporasyon²³sonra yol açabilir CCC-dsDNA en hızlı çalışan grubudur. T7 DNA polimeraz doğasında strand-deplasman aktivitesinden doğar ve düşük mutasyon oranı (% 20)²³olan strand yerinden DNA en yavaş çalışan grubudur. Orta zayıf bant uzantısı nedeniyle yetersiz T4 DNA ligaz aktivite veya yetersiz Oligonükleotid fosforilasyon sonra DNA arakladım.

Bir küçük sıralama örnek havuzu Kütüphane çeşitlilik rağmen doğru değil²⁴tahmin etmek için kullanıldı. Gerçek çeşitlilik doğru bir şekilde tahmin etmek için yeni nesil (NGS) sıralama inşa Kütüphane²⁵çeşitlilik derinliği madencilik içinde iyi bir seçenek olabilir. Uygulamada, NGS mevcut sorunları nedeniyle teknolojisi de dahil olmak üzere uzunluğu, doğruluk, maliyet ve yüksek işlem hacmi, bu iletişim kuralı yaklaşık 950 uzunluğu ile kullanılan Fab fajının kitaplığının nasıl yapılacağını okumak CDRH1, CDRH2, CDRH3 ve CDRL3 kapsayan bp değil ulaşılabilir; Ancak, scFv tahmin etmek mümkündür (yaklaşık 700 bp) Kütüphane çeşitlilik milyonlarca aralığında^24,25. İnşa Kütüphane çeşitliliği değerlendirmek için başka bir anahtar standardı antijenleri birçok farklı türlerine karşı pan ve Kütüphane çeşitlilik doğrudan antijen başarılı oranı ile korelasyon beri yakalanan olumlu klonlar hesaplamak için kütüphane kullanmaktır ²⁶kaydırma. Yüksek işlem hacmi seçimi platformu bu amaç için de uygun olduğu ve okuyucuların ayrıntılı bir protokol Miersch vd tarafından bildirilen başvurabilirsiniz ²⁷

Teorik olarak, özel çeşitlilik kitaplıklarıyla sentetik antikor fajının görüntülenen herhangi bir antijen hedef ve bu nedenle geniş uygulamalar için kullanılabilir. Şu anda, Cambridge antikor teknoloji (kedi), MedImmune, greentech, Dyax, Bioinvent, Pfizer ve MorphoSys gibi şirketler tedavi antikor geliştirme²⁸fajının ekran platformlarda güveniyorsun. Ayrıca, birçok fajının ekran çekirdek teknolojisi patent²⁹dolmuş. Hiç şüphesiz, bu fajının görüntülenen antikor teknoloji maksimum potansiyelini açığa çıkarmak.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yazarlar için kritik yorum Kunkel'ın yöntemi göre sentetik Fab fajının Kütüphane inşaat üstünde Sidhu Laboratuarı'ndan Dr. Frederic Fellouse için teşekkür ederiz. Bayan Alevtina Pavlenco ve diğer üyeler için yüksek verimli elektro-yetkili hazırlama değerli yardım etmek Sidhu laboratuarından yazarlar takdir E. coli hücreleri ve yüksek kaliteli dU-ssDNA. Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından desteklenmiştir (Grant No: 81572698, 31771006) için DW ve ShanghaiTech Üniversitesi tarafından (Grant No: F-0301-13-005) laboratuvar antikor mühendislik için.