Bir sıçan modelinde en iyi duruma getirilmiş yapısı ile Electrospun vasküler greft implantasyonu

Burada, PCL vasküler Greftler kalın elyaf ve iri gözenekli ile imal ve abdominal aort değiştirme bir sıçan modelinde vivo içinde performansını değerlendirmek için bir iletişim kuralı tanımlamak için modifiye electrospinning yöntemi mevcut.

Burada, macroporous PCL vasküler greft imal ve abdominal aort değiştirme bir fare modeli kullanarak bir değerlendirme protokolü tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Electrospun vasküler Greftler kez hücre infiltrasyonu Greftler içine sınırlamak ve yenilenme ve neo-damarların remodeling engel nispeten küçük gözenekleri, sahip. Bu çalışmada, PCL vasküler Greftler kalın elyaf (5-6 µm) ve daha büyük gözenekler (~ 30 µm) ile modifiye işleme tekniği kullanarak fabrikasyon. Uzun vadeli performansı greft implantasyonu bir sıçan abdominal aort modeli tarafından incelendi. Ultrason analiz Greftler patent anevrizması veya stent implantasyonu bile 12 ay sonra meydana gelen olmadan kaldı gösterdi. Macroporous yapısı hücre ingrowth geliştirilmiş ve böylece 3 ayda yeniden doku terfi. Daha da önemlisi, olumsuz, 12 ay sonra greft duvar içinde kireçlenme gibi şeklinin değiştiğine dair işaret yok oldu. Bu nedenle, electrospun PCL vasküler Greftler değiştirilmiş macroporous işleme ile bir arter yerine uzun vadeli implantasyon için olmak potansiyel tutun.

Vasküler Greftler sentetik polimerler yapılan yaygın olarak klinik kardiyovasküler hastalıklar (CVDs) tedavisi için kullanılmaktadır. Ne yazık ki, söz konusu olduğunda küçük çaplı vasküler Greftler (D < 6 mm) mevcuttur herhangi başarılı bir ürün nedeniyle sık sık kan pıhtılaşması, intimal hiperplazi ve diğer yol açar azaltılmış kan akım hızı tarafından tetiklenen düşük açıklık komplikasyonlar¹.

Doku mühendisliği uzun vadeli açıklık ve bir iskele güdümlü vasküler yenilenme ve yeniden yapılanma dayalı homeostazı gerçekleştirmek için alternatif bir strateji sağlar. Ayrıntılı olarak, vasküler greft, üç boyutlu bir şablon olarak mekanik destek ve dahil hücre adezyon, göç, yayılması, damar dokusu ve etkisi hücresel fonksiyonları yeniden oluşturma sırasında yapısal rehberlik sağlayabilir ve hücre dışı matriks²salgılanmasını. Şu ana kadar çeşitli sentetik polimerler damar doku mühendisliği uygulamalarında değerlendirilir. Bu polimerler arasında poly(ε-caprolactone) (PCL) yoğun bir şekilde iyi hücre uyumluluk ve birkaç ay sonra iki yıl³' e kadar yavaş bozulması nedeniyle soruşturma. Mükemmel yapısal bütünlüğü ve açıklık ve neovaskülarizasyon içinde de kadar sürekli artan hücre işgal PCL vasküler greft electrospinning tarafından işlenen bir sıçan aort modeli^4,5,6' da sergilenen greft duvar 6 aya kadar için. Ancak, olumsuz doku, hücre ve kılcal damarlar ve kalsifikasyon, regresyon dahil olmak üzere remodeling Ayrıca gözlendi daha uzun timepoints yukarı 18 ay.

Cellularization vasküler greft doku rejenerasyonu belirlenmesi ve⁷remolding önemli bir faktördür. Electrospinning, çok yönlü bir teknik olarak yaygın nano-lifli yapısı⁸ile vasküler greft hazırlanması için istihdam edilmiştir. Ne yazık ki, nispeten küçük gözenek yapısı genellikle yetersiz hücre infiltrasyonu sonraki doku rejenerasyonu sınırlar electrospun vasküler greft içinde yol açar. Bu sorunu gidermek için çeşitli teknikler gözenek boyutu ve^9,10, toplayıcı cihazları, lazer radyasyon^{11 tarafından tedavi sonrası modifikasyonu leaching tuz/polimer dahil olmak üzere toplam gözeneklilik artırmak için kurulması denenen} , vs. Aslında, electrospun Greftler (lif çapı, gözenek boyutu ve porozite dahil) yapısını işleme koşulları^12,13ile yakından ilgilidir. Electrospinning sırasında lif çapı kolayca Polimer çözüm, akış hızı, voltaj, vbkonsantrasyonu gibi parametreleri değiştirerek kontrol edilebilir. ^{14 , 15}, ve bu nedenle, gözenek boyutu ve porozite buna göre geliştirilmiştir.

Biz son zamanlarda değiştirilmiş bir PCL electrospun greft macroporous yapısı (5-7 µm çapını ve 30-40 µm gözeneklerin lifleri) ile bildirdi. Karın sıçan Aortası değiştirerek in vivo implantasyon 3 ay ameliyat sonrası¹⁶, açıklık, hem de iyi endothelialization ve düz kas yenilenme oranı yüksek gösterdi. Daha da önemlisi, hiçbir olumsuz doku kalsifikasyon ve hücre regresyon dahil olmak üzere remodeling implantasyon bile bir yıl sonra gözlenen.

Deneysel hayvan kullanımı hayvan deneyleri Etik Komitesi Nankai Üniversitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve Laboratuvar hayvanlarının kullanmak için Kılavuzu uygun olarak yürütülmektedir.

1. Electrospun PCL Greftler imalatı

Not: Burada, vasküler Greftler imal etmek bir electrospinning tekniği kullanılmıştır.

1. PCL çözümleri 25 wt % ve 10 wt %, sırasıyla, metanol ve kloroform, karışımı PCL çözülerek hazırlamak (1:5 hacim oranı), oda sıcaklığında (RT) 12 h için.
2. PCL çözüm 10 mL Cam şırınga yükleyin.
3. Şırınga ile 21-G iğne yerleştirin.
4. Paslanmaz çelik mandrel (2 mm çapında, uzunluğu 25 cm) koleksiyon araç üzerinde yerleştirin.
5. Lif kalın Greftler için kullanın PCL çözüm 25 wt %, çalışma mesafesi toplayıcı için iğne ucu 17 cm, 8 mL/h debi ve gerilim 11 kV electrospinning parametre olarak. İnce lifli greft için 10 wt %, iğne ucu 20 cm toplayıcı için çalışma mesafesi, 2 mL/h debi ve gerilim 18 PCL çözüm kullanın kV electrospinning parametre olarak.
6. Elde edilen Greftler gecede kalan solvent kaldırmak için vakum yerleştirilir emin olun. Önce yordamı tüm aletleri sterilize ve aseptik teknik boyunca korumak.
7. İmplantasyon öncesinde Greftler dezenfekte onları 10 ml % 75 etanol için 30 dk çeker ve sonra onları ifşa UV ışığı gecede.
8. Lif ve gözenek boyutu ölçüleri: ImageJ yazılım elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri taramak tabanlı kullanarak ortalama lif çapı hesaplamak.
9. Mekanik iskele test:
   1. Bir tıraş bıçağı kullanarak uzunluğu 3 mm bölümlere borulu iskele kesti. Bir mikrometre kullanarak iskele kalınlığını ölçmek.
   2. 100 N. yük kapasiteli bir gerilme test makinede borulu iskele yerleştirin
   3. 1 mm arası kelepçe mesafe ve 10 mm/dk hızında boyuna çekme ile iskele rüptürü kadar kelepçe. Çekme dayanımı ve kopma nihai uzama ölçmek. Young katsayısı ilk doğrusal bölgesinden hesaplamak (en fazla % 5 zorlanma) stres gerginlik eğrisi.

2. fare Abdominal aort implantasyon modeli

Not: Tüm malzeme ve kullanılan aletler steril. Ameliyat sırasında operatör bir gazlı bez maske ve enfeksiyonları önlemek için steril eldiven giyer emin olun. Oda sıcaklığında hayvan vücut ısısını korumak için 27-30 ° C'de tutulur emin olun. Analjezi ile ilgili yerel IACUC yönergeleri izleyin.

1. Vasküler greft alıcıları 240-270 g ağırlığında erkek Sprague Dawley rat kullanın. Fareyi ameliyattan önce 24 saat oruç emin olun. 24 h açlık sıçanlara amacı boş dışkı bağırsak yeterince, böylece operatörün ufku genişletmek.
2. Sıçan arka boyun kavramak ve kafasını aşağıya doğru tutmak, alt karın karın boşluğuna springe iğne yerleştirin. Kloral hidrat (330 mg/kg) ile anestezi için fare mayi iğne tarafından ikna etmek.
3. Yeterli anesthetization sıçan kasları ve düzenli nefes rahat sağlayarak onaylayın. Çalışma mikroskop altında fare sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
4. Petrolatum oftalmik veteriner merhem Gözlerde kuruluk anestezi iken altında önlemek için geçerlidir. AntiCoagulation (100 UI/kg) ameliyattan önce kuyruk ven enjeksiyonla heparinized fizyolojik serum çözüm (50 UI/mL) ile yönetebilirsiniz.
5. Bir tıraş bıçağı kullanarak ön karın duvarındaki kürk kapalı tıraş ve deri iyot çözüm ve Tıbbi alkol çözümü kullanarak temiz.
6. Laparotomi ensizyon cerrahi makas ile gerçekleştirmek ve belgili tanımlık kesme yaklaşık 4-5 cm uzunluğunda olduğundan emin olun ve karın boşluğu karşı karşıya.
7. Geri çekmek ve bağırsak ile tuzlu çözüm tercihen ıslatılmış gazlı bez ile sarın.
8. Abdominal aort dikkatle incelemek.
9. Tanımlamak ve tüm küçük dalları 9-0 monofilament naylon dikiş kullanarak ligate.
10. İzole bölüm kelepçe (ilâ 1 cm uzunluğunda) iki damar kelepçeler kullanılarak aort. Aorta için 20-30 dk klempe kalabilir.
11. İki kelepçeler anastomoz siteleri oluşturmak için mikro-makas kullanarak arasında karın aortu transect.
12. Artık kan kaldırmak için heparinized serum fizyolojik (50 UI/mL) çözüm kullanarak aort iki ucunun floş.
13. Mikro-makas kullanarak adventitia soyma.
14. Greft ile 2 mm iç çap ve 1 cm uzunluğunda sıçan abdominal aort için 9-0 monofilament naylon dikiş kullanarak bir sekiz şekli dikiş desen ile anastomose.
15. İlk olarak, dört anastomoses, 9, 3, 12 ve 06: 00 proksimal yan konumlarda sırasına göre oluşturmak, sonra iki dikiş arasında 4 dikiş kesilmiş kenarları anastomose. Proksimal dikiş bittikten sonra aynı yöntemle distal yan dikiş.
    Not: Her dikiş yerli yan biraz greft gömülü olduğu için gereklidir.
16. Kan nakli akışını sağlamak için distal klempi kaldırın, sonra proksimal klemp kaldırın.
17. Dikiş biter steril bir pamuk veya bir küçük gazlı bez sünger kullanarak kanamayı durdurmak için tuşuna basın. Yaklaşık 3 dakika için hemostazın kadar basın.
18. Bağırsak karın boşluğuna dönün.
19. Karın boşluğu sıcak fizyolojik serum çözüm gentamisin ile (320 U/mL) kullanarak floş.
20. 3-0 naylon dikiş kas ve deri katmanının içinde sırasıyla kullanarak karın duvarına kadar dikmek.
21. Fareyi bir temiz ve kuru kafesin içine yerleştirin ve bir ısıtma yastığı hayvan vücut ısısını korumak için kafes altında koymak; daha sonra fareyi anesteziden kurtarmak bekleyin. Sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar hayvan için katılmak.
22. Bilinci yerine sonra yiyecek ve su ile tek bir kafes içinde fare koydu. İyot ameliyattan sonra enfeksiyonu önlemek için yaranın üzerine uygulayın. Tamamen iyileşene kadar fareyi diğer hayvanlar şirkete geri.
23. Fareler önceden belirlenmiş zaman noktalarda kurumsal esaslarına göre ötenazi.

PCL Greftler 3 ay ve 12 ay post-operatively explanted ve hematoksilen eozin (H & E) için standart histolojik teknikler Masson trichrome, Verhoeff-van Gieson (VVG), Von Kossa ve α-SMA için boyama ayirt analiz, MYH, vWF ve elastin. Histolojik görüntüleri dik bir mikroskop kullanarak alındı ve fluorescence mikroskop kullanarak ayirt görüntüleri alındı.

Tüm verileri ± SD demek gibi ifade edildi Eşleştirilmiş iki kuyruklu öğrenci t-testi farkları karşılaştırmak için kullanıldı. P değeri < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı olmak olarak kabul.

Roman electrospun PCL greft ile en iyi duruma getirilmiş yapısı, diğer bir deyişle, daha kalın elyaf ve daha büyük gözenekler, başarılı bir şekilde bu çalışmada fabrikasyon. SEM görüntüleri gösterdi ortalama lif çapı yaklaşık 8 kat daha kalın olarak değiştirilmiş Greftler (Şekil 1A) geleneksel olarak bir (Şekil 1B) (5.59 ± 0.67 0.69 ± 0.54 µm karşı). Sonuç olarak, ortalama gözenek boyutu belirgin oldu artış, ~ ince lifli greft için 4.66 µm ~ daha kalın lifli bir 40.88 µm. Kesit duvar içinde homojen fiber dağıtım borulu greft daha kalın lifli (Şekil 1 d-F) ve ince lifli grupları (Şekil 1G-ben) gösterdi. Duvar kalınlığı hakkındaydı 400-500 µm. Greft mekanik özellikleri çekme test ederek karakterize ve tipik stres gerginlik eğrileri Şekil 1 cgösterildi. Mekanik özellikleri iki greft uzaması açısından açıkça farklıydı. Lif kalın Greftler karşılık gelen değeri Gelişmiş tokluk düşündüren ince lifli Greftler yaklaşık 3 kat daha yüksek.

Hazırlanan vasküler Greftler (2.0 mm iç çapı) ve 1 cm uzunluğunda (Şekil 2A) fare (Şekil 2B) yerel abdominal aort bir parçasını değiştirmek için implante edildi. Önceden belirlenmiş zaman noktalarda, implante greft açıklık ultrason tarafından incelenmiştir. Sonuçları Greftler çoğunu patent olduğunu gösterdi (Şekil 2C). Ayrıca, kan akımı hızı 12 ay greft ve bitişik yerel kan damarları arasında benzer. Explanted greft anevrizma (Şekil 2B) olmadan iyi morfoloji muhafaza ve hiçbir stenoz veya olu_umu luminal yüzeyinde (Şekil 2E) gözlenen.

Daha fazla doku rejenerasyonu ve ECM salgısı 3 aylıkken Histoloji analizleri tarafından değerlendirildi. H & E boyama neo-doku tabakası (Şekil 3 g-H) greft lümen üzerinde kuruldu gösterdi. Ayrıca, vWF boyama göster luminal yüzeyden tamamen bu yerel aort (Şekil 3B) benzeyen yeni kurulan endotel tarafından (Şekil 3A), kaplıydı. Bu arada birkaç kat MYH-pozitif hücrelerinin yenilenme vasküler medya (Şekil 3 c-D) gösteren sirkumferansiyel yön organize edilmiştir. Hücre dışı matriks sentezi Masson ve boyama, sırasıyla VVG tarafından gözlenmiştir. Önemli miktarda kolajen ve elastin fibröz (Şekil 3i-e-J, K-L), vasküler yenilenme ve yenileme önemli bir rol oynamaktadır greft içinde gözlenen. Ayirt boyama daha fazla elastin yapısını çepeçevre bir desende böyle yerli arter (Şekil 3E-F) uyumlu gösterdi.

Ayrıca, endotel ve düz kas bakımı da dahil olmak üzere rejenere doku entegre ve implantasyon (Şekil 4A-C) 12 ay sonra gerileme değil. Daha da önemlisi, Von (Şekil 4 d) boyama Kossa üzerinde dayalı greft duvar içinde meydana gelen kireçlenme belirtisi yok oldu.

Resim 1 : Yapı ve mekanik özellik PCL greft. Electrospun SEM görüntüleri PCL kalın elyaf(a)ve ince lifleri (B) ile paspaslar. Kesit kalın lifli borulu Greftler (D-F) ve ince lifli Greftler (G-ben). Temsilcisi zorlanma-stres eğrisi (C) gösterilir. Bu rakamlar Zhao, et al. değiştirildi ¹⁶ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Bir fare abdominal aort modelindeki vasküler greft implantasyonu. 1 cm uzunluğunda(a)Electrospun PCL vasküler greft fare (B) abdominal aort içine cerrahi olarak interposed. Ultrason görüntüsü greft 1 yıl (C) patent vivo içinde olduğunu gösterdi. Stereomicroscopic görüntüleri göstermek greft ile bitişik yerli Aort Anevrizma (D) olmadan iyi entegre ve luminal yüzeyi temiz ve ücretsiz trombüsü (E) olarak yer alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Doku rejenerasyonu ve birikimi ECM explanted greft olarak 3 ay ile karşılaştırıldığında yerel aort. Rejenere Greftler (A, Cve E) ve (B, Dve F) yerel arter kesitsel görüntülerini immunostained endotel hücreleri, düz kas hücreleri ve elastin tespit edildi. H & E boyama yerli aort (H) göre doku rejenerasyonu explanted Greftler (G) olarak gösterir. Masson'ın boyama ortaya bu kollajen explanted Greftler (ben) ve yerel aort (J) varlığı. VVG boyama elastin varlığı explanted Greftler (K) ve yerel aort (L) gösterdi. Bu rakamlar Zhao, et al. değiştirildi ¹⁶ Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : 12 ayda explanted greft histolojik analiz. (A) H & E explanted greft doku rejenerasyonu gösterdi boyama. (B) endotel immunostained vWF antikor tarafından yapıldı. (C) düz kas immunostained α-SMA antikor tarafından yapıldı. (D) kalsifikasyon Von boyama Kossa tarafından değerlendirilmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Hücre infiltrasyonu rejenerasyon için kritik ve remodeling vasküler greft vivo içinde¹⁶. Sınırlı hücre infiltrasyonu kez hücreleri geçiş greft duvara engel greft nispeten küçük gözeneklerin ilgilidir. Bu zorluk adrese, electrospun PCL vasküler greft büyük gözenek yapısı ile hazırlamak için değiştirilmiş bir yöntem geliştirdi. Ayrıntılı olarak, kolayca işleme parametreleri tarafından kontrol edilebilir fiber kalınlığı artış ile gözenek boyutu artmıştır. Sonuçlar konak hücreleri kolayca vivo içinde implantasyon sonra bu macroporous greft duvar sızmak ve cellularity açık hücre regresyon, 12 ay sonrası ameliyat olmadan nispeten yüksek bir seviyede kaldı gösterdi.

Yerel arter esas olarak üç katmandan, diğer bir deyişle, endotel, tunica medya ve adventitia oluşur. Endotel, bir anti-trombojenik arayüzü olarak, kan damarı uzun vadeli a_ılabilinirse korumada önemli bir rol oynar. Bizim çalışmada, greft üzerinde tam endothelialization 3 ay gözlendi. Buna ek olarak, düz kas hücrelerinin birkaç kat oluşan tunica medya kan damarı işlevini düzenleyen ve arter uygun mekanik özellikleri sağlamak çok önemlidir. Çalışmanın electrospun PCL kalın-fiber ile greft ve büyük gözenek belirgin fonksiyonel tunica medya yenilenme gelişmiş ortaya. Ayrıca, rejenere düz kas yapısını yerel tunica medya için benzer. Ayirt boyama birkaç tabaka-in düz kas hücrelerinin contractile fenotip çepeçevre yansıtan elastin ağ içinde dağıtılmış MYH⁺ hücreleri gösterdi. Daha da önemlisi, dokuları bozulmadan muhafaza (endotel ve düz kas) yeniden ve hiçbir olumsuz remodeling ECM sentezi ve yıkımı arasındaki dengesizlik nedeniyle 12 ay sonra bile vardı.

Kalsifikasyon hala kardiyovasküler komponentlerde, özellikle vasküler greft ile ilgili önemli bir sorundur. Vasküler düz kas hücreleri (VSMCs) kendi özgün fenotip kaybetmek ve trans-farklılaşma vasküler kalsifikasyon işlemi sırasında ektopik Qafqaz için önde gelen osteochondrogenic yönüne deneyim. Bizim çalışma greft duvar içinde implantasyon bile 12 ay sonra meydana gelen hiçbir kalsiyum birikimi olduğunu gösterdi. Makro gözenekli vasküler greft Inhibe kalsifikasyon için başlıca nedenleri şunlardır: (1) makro gözenekli greft yapısını iyon exchange arasındaki hücreleri ve kan; gibi metabolizma teşvik etmektedir. (2) greft yapısının fiziksel ipuçları düzenleyen veya VSMC farklılaşma osteoblast¹içine inhibe, iri gözenekli (3) iyi hücre infiltrasyonu ECM salgılanmasını teşvik ve -ecek tetik onun yıkımı inhibe kalsifikasyon¹⁷ve (4) normal veya fonksiyonel VSMCs kalsiyum birikimi¹⁸önlemek için bir potansiyele sahiptir.

Özetle, makro gözenekli electrospun PCL vasküler Greftler sıçan abdominal aort modelindeki uzun vadeli değerlendirilmesi önemli potansiyel sorunlar aşağıdaki araştırma yönlendirecektir parçalanabilir vasküler greft içgörü sağlar.

Yazarlar hiçbir çakışan mali ilgi alanlarına sahip.

Bu eser mali NSFC projeler (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 ve 81401534) tarafından desteklenmiştir.