Имплантация Electrospun сосудистых имплантатов с оптимизированной структурой в мышиной модели

Здесь мы представляем модифицированных electrospinning метод изготовления PCL сосудистых имплантатов с толщиной волокон и большие поры, и описать протокол для оценки производительности в естественных условиях в мышиной модели замены брюшной аорты.

Здесь мы представляем протокол изготовления Макропористые PCL сосудистого трансплантата и описать протокол оценки с использованием модели крыс брюшной аорты замены. Electrospun сосудистая графтов часто обладают сравнительно небольшие поры, которые ограничить проникновение в клетки в графтов и помешать регенерации и Ремоделирование нео-артерий. В этом исследовании были сфабрикованы PCL сосудистых имплантатов с толще волокон (5-6 мкм) и большие поры (~ 30 мкм) с помощью метода изменение обработки. Долгосрочной производительности трансплантата была оценена имплантации в модели брюшной аорты крысы. УЗИ анализ показал, что трансплантаты оставался патент без аневризма или стенозом, даже после 12 месяцев имплантации. Макропористые структура улучшить врастание клеток и таким образом способствовали ткани регенерировать на 3 месяца. Что еще более важно нет никаких признаков неблагоприятных ремоделирования, таких как обызвествление в пределах трансплантата стены после 12 месяцев. Таким образом electrospun PCL сосудистых имплантатов с модифицированных Макропористые обработки провести потенциал, чтобы заменить артерии для долгосрочного имплантации.

Сосудистых имплантатов из синтетических полимеров широко используются в клинике для лечения сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). К сожалению, в случае малого диаметра сосудов графтов (D < 6 мм) существует без успешных продуктов из-за низкой проходимостью, вызвано снижение скорости кровотока, что часто приводит к тромбоз, гиперплазия интимы и другие ¹осложнений.

Тканевая инженерия предоставляет альтернативную стратегию реализовать долгосрочные проходимость и основанный на эшафот руководствуясь сосудистой регенерации и восстановления гомеостаза. В деталях, сосудистого трансплантата, как трехмерные шаблон, может обеспечить механическую поддержку и структурных руководство во время регенерации сосудистых тканей и влияние клеточных функций, включая клеточной адгезии, миграция, распространение, и секрецию внеклеточная матрица². До настоящего времени были оценены различных синтетических полимеров для приложений в сосудистой тканевой инженерии. Среди этих полимеров благодаря совместимости хорошие клетки и медленной деградации, начиная от нескольких месяцев до двух лет³интенсивно исследована poly(ε-caprolactone) (PCL). В крыса аорты модель^4,5,6, PCL сосудистых имплантатов, обрабатываемые electrospinning выставлены отличные структурной целостности и проходимость, а также как непрерывно увеличение клеток вторжения и неоваскуляризации в Трансплантат стены на срок до 6 месяцев. Однако неблагоприятные тканей ремоделирования, включая регрессии клеток и капилляров и кальцификации, были также отмечены на более timepoints, до 18 месяцев.

Cellularization сосудистого трансплантата является ключевым фактором определения регенерации тканей и свергая⁷. Electrospinning, как универсальный метод, широко использовался для подготовки сосудистых имплантатов с нано волокнистая структура⁸. К сожалению относительно небольшой поровой структуры часто приводит к недостаточности клеток инфильтрата в electrospun сосудистого трансплантата, который ограничивает последующего регенерацию. Для решения этой проблемы, различные техники пытались увеличить размер поры и общая пористость, включая соли/полимерных выщелачивания^9,10, модификация аппарата коллектора, после лечения, лазерного излучения¹¹ , и т.д. В самом деле структура electrospun графтов (включая диаметр волокна, размер поры и пористость) тесно связана с обработки условий^12,13. Во electrospinning диаметр волокна легко регулируется путем изменения параметров, как концентрация раствора полимера, скорость потока, напряжения и т.д. ^{14 , 15}, и таким образом, размер пор пористость укрепились и соответственно.

Недавно мы сообщили модифицированных трансплантата electrospun PCL с Макропористые структуры (волокна с диаметром 5-7 мкм и поры 30-40 мкм). В естественных условиях имплантации, заменив крыс брюшной аорты показал высокий уровень проходимости, а также хорошее endothelialization и гладких мышц регенерации в 3 месяца после операции¹⁶. Что еще более важно не неблагоприятные тканей ремоделирования, включая кальцификации и клеток регрессии можно наблюдать даже после одного года имплантации.

Использование экспериментальных животных был одобрен животных эксперименты этического Комитета Нанкай университета и осуществлялась в соответствии с руководством для ухода и использования лабораторных животных.

1. Изготовление Electrospun PCL графтов

Примечание: в настоящем документе, метод electrospinning использовался для изготовления сосудов.

1. Подготовка решений PCL 25 wt % и 10 wt %, путем растворения PCL в смеси метаноле и хлороформе, соответственно, (1:5 тома соотношение), при комнатной температуре (RT) для 12 h.
2. Загрузите PCL раствор в шприц 10 мл стекла.
3. Поместите шприц с иглой 21 G.
4. Место на инструмента сбора оправки из нержавеющей стали (2 мм в диаметре, 25 см в длину).
5. Для волоконно толще графтов, используйте 25 wt % раствора PCL, рабочее расстояние 17 см от кончика иглы сборщику, скорость потока 8 мл/ч и напряжение 11 кв как параметры electrospinning. Для волоконно тоньше графтов, использовать решение PCL 10 wt %, рабочее расстояние 20 см от кончика иглы сборщику, скорость потока 2 мл/ч и напряжение 18 кв как параметры electrospinning.
6. Убедитесь, что полученный графтов помещены в вакууме на ночь, чтобы удалить остаточные растворителя. Стерилизовать всех инструментов до процедуры и поддержание асептической техники во всем.
7. До имплантации продезинфицируйте графтов, погружая их в 10 мл 75% этанола для 30 мин и затем подвергая их воздействию УФ-излучения на ночь.
8. Волокно и поры размеры: вычислить среднее волокно диаметр с помощью ImageJ программного обеспечения, основанные на сканирование изображений электронная микроскопия (SEM).
9. Механические испытания строительных лесов:
   1. Вырежьте трубчатых лесов на секции 3 мм в длину, с помощью лезвия бритвы. Измерьте толщину леса с помощью микрометра.
   2. Место трубчатых лесов на машине испытания на растяжение с грузоподъемностью 100 н.
   3. Зажим леса с 1 мм расстояние между зажимом и тянуть продольно в размере 10 мм/мин до разрыва. Измеряют предел прочности на разрыв и удлинения при разрыве. Рассчитать Юнга от первоначального линейной региона (вплоть до 5% деформации) из кривая напряжение деформация.

2. крыс брюшной аорты имплантации модель

Примечание: Все материалы и инструменты, используемые в хирургии являются стерильными. Во время операции убедитесь, что оператор носит марлевые маски и стерильные перчатки, чтобы избежать инфекции. Убедитесь, что температура в помещении поддерживается на 27-30 ° C для поддержания температуры тела животного. Следуйте местных IACUC руководящие принципы относительно анальгезии.

1. Используйте Sprague-Dawley самцах массой 240-270 g как получатели сосудистого трансплантата. Убедитесь, что крыса постились 24 ч до операции. Цель поста крыс для 24 h является пустой фекалий в желудочно-кишечном тракте достаточно, тем самым расширить горизонт оператора.
2. Понять крыса спины шеи и держать его голову вниз, вставить иглу Шпринге в брюшной полости нижней части живота. Вызвать крыс для анестезии с хлораль гидрат (330 мг/кг), внутрибрюшной инъекции.
3. Подтвердите адекватной анестезии путем обеспечения того, что крысы имеет расслабленной мышцы и устойчивый дыхание. Место крысу под операционных микроскопов в лежачем положении.
4. Примените мазь офтальмологический ветеринар вазелин на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Администрировать антикоагуляционная (100 UI/кг) с гепаринизированным физиологического раствора раствор (50 UI/мл), инъекции Вену хвоста до операции.
5. Сбрить мех в передней брюшной стенке с помощью лезвия бритвы и очистить кожу, используя раствор йода и медицинского спирта раствор.
6. Выполните разрез срединная лапаротомия с Ножницы хирургические и убедитесь, что разрез длиной 4-5 см, а затем подвергать брюшной полости.
7. Убрать и оберните кишечника с марлей, смоченной раствором преференциально.
8. Тщательно анализировать брюшной аорты.
9. Выявление и перевязать все мелкие ветки, используя швы нейлон Мононить 9-0.
10. Зажим изолированные секции (до 1 см в длину) аорты с помощью двух сосудистых зажимов. Аорты может оставаться зажимается на 20-30 мин.
11. Разрез брюшной аорты между двумя зажимами с помощью микро ножницы для создания анастомоза сайтов.
12. Промойте два концы аорты гепаринизированным солевой раствор (50 UI/мл) раствора для удаления остатков крови.
13. Отделите адвентиции с помощью микро ножницы.
14. Анастомозируют лоскута с внутренним диаметром 2 мм и 1 см в длину для крыс брюшной аорты с восьмерка шовные выкройку швами нейлон Мононить 9-0.
15. Во-первых построить четыре анастомозов согласно последовательности 9, 3, 12 и 6 часов позиции в проксимальной части, а затем анастомозируют срезанных краев в 4 швы между двумя швами. После окончания проксимальной шовный материал, шов дистальной стороны таким же методом.
    Примечание: Каждый стежок требуется убедиться, что родной стороне слегка внедряется в трансплантата.
16. Удаление дистальной зажим позволяет крови течь в трансплантата, затем удалите проксимальной зажим.
17. Нажмите концы швов остановить кровотечение стерильным ватным тампоном или небольшой марлевые губкой. Пресс для около 3 минут, до гемостаз.
18. Возвращение кишечника в брюшную полость.
19. Промойте брюшную полость, с использованием теплого физиологического раствора раствор с гентамицина (320 ед/мл).
20. Зашейте брюшной стенки с использованием нейлон накладывать шов 3-0 в слой мышц и кожи, соответственно.
21. Поместите крыса в клетку чистой и сухой и положить грелку под клетку для поддержания температуры тела животного; затем дождитесь крысу, чтобы оправиться от анестезии. Присутствовать на животных до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency.
22. После того, как он приходит в сознание, положите крысу в одной клетке с пищей и водой. Примените йода на рану для предотвращения инфекции после операции. Вернуться крыса в компании других животных до тех пор, пока он полностью восстанавливается.
23. Усыпить крыс согласно институциональных руководящих точках интервала.

PCL графтов были описаны на 3 месяцев и 12 месяцев постоперационно и анализируются стандартные гистологических методов гематоксилином и эозином (H & E), Массон trichrome, Верхоеф Ван Гизону (VVG), фон Kossa и пятнать для α-SMA, иммунофлюоресценции MYH, vWF и эластина. Гистологические изображения были взяты с помощью прямо микроскопом, и иммунофлюоресценции изображения были взяты с помощью микроскопа fluorescence.

Все данные были высказаны как означает ± SD. Двух белохвоста в паре студента t-тест был использован для сравнения различий. Значение p < 0,05 считается статистически значимой.

Роман electrospun графтов PCL с оптимизированной структуры, то есть, толще волокон и большие поры, успешно были сфабрикованы в этом исследовании. SEM изображения показали, что почти в 8 раз толще в модифицированных графтов (рис. 1A), чем в обычных усредненной волокна диаметром один (рис. 1B) (5.59 ± 0,67 против 0,69 ± 0,54 мкм). В результате, усредненный поры был заметно увеличилось, с ~ 4.66 мкм в тоньше волокна трансплантата для ~ 40.88 мкм в толще волокна, один. Сечения показал распределение однородной волокон внутри стены трубчатых графтов в толще волокна (рис. 1 d–F) и тоньше волоконно групп (рис. 1 g–я). Толщина стенки было около 400-500 мкм. Механические свойства графтов характеризовались испытания на растяжение, и кривые типичного напряженно деформированного были показаны на рисунке 1 c. Механические свойства двух графтов были явно различных с точки зрения относительного удлинения. Соответствующее значение толще волокна графтов было примерно в 3 раза выше, чем тоньше волокна графтов, предлагая Расширенные выносливость.

Подготовленные сосудистых имплантатов (внутренний диаметр 2,0 мм) и длиной 1 см (рис. 2A) были имплантированы заменить сегмент родной брюшной аорты в крыса (рис. 2B). В заданное время точках проходимость имплантированных графтов было расмотрено УЗИ. Результаты показали, что большинство графтов патент (рис. 2 c). Кроме того скорость потока крови был похож между трансплантата и прилегающих родной кровеносных сосудов на 12 месяцев. Описаны графтов сохранил хорошие морфология без аневризмы (Рисунок 2D), а на поверхности Люминал (Рисунок 2E) может наблюдаться не стеноз или тромбов.

Регенерации тканей и секрецию ECM на 3 месяца Далее оценивали по гистологии анализы. H & E пятнать показал, что слой нео-ткани была сформирована на просвет имплантата (Рисунок 3 g-H). Кроме того vWF пятнать показывают, что Люминал поверхность полностью охватывается новообразованной эндотелия (Рисунок 3А), напоминающий родные аорты (рис. 3B). Тем временем несколько слоев MYH-положительных клеток были организованы вдоль окружности, указывающее регенерации сосудистой СМИ (рис. 3 c–D). Синтез внеклеточной матрицы наблюдалось Masson и ВВГ, окрашивание, соответственно. Значительное количество коллагена и эластина, волокнистых можно наблюдать в пределах трансплантата (Рисунок 3I–J, K–L), который играет важную роль в сосудистой возрождения и реконструкции. Пятнать иммунофлюоресценции далее показал, что структура эластина была выровняна окружности в шаблоне как в родной артерии (Fрис 3E–).

Кроме того регенерации тканей, включая эндотелия и гладкой мускулатуры поддерживается интегрированный и не регрессирует после 12 месяцев имплантации (рис. 4A–C). Что еще более важно нет никаких признаков кальцификации, происходящих в пределах трансплантата стены, основанный на фон Kossa, окрашивание (рис. 4 d).

Рисунок 1 : Структура и механические свойства PCL трансплантата. SEM образы electrospun PCL коврики Толстые волокна (A) и тоньше волокон (B). Поперечное сечение толще волокна трубчатых графтов (FD–) и тоньше волокна графтов (G–я). Представитель штамм стресса кривой показано на (C). Эти цифры были изменены с Чжао, и др. ¹⁶ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Имплантация сосудистых имплантатов в модели брюшной аорты крысы. Electrospun PCL сосудистого трансплантата 1 см в длину (A) был хирургическим разъединительных в брюшной аорты в крыса (B). Ультразвуковые изображения показали, что трансплантат патент в естественных условиях на 1 год (C). Stereomicroscopic изображения показывают что трансплантат хорошо интегрированы с прилегающих родной аорты без аневризмы (D), и просветный поверхность чистой и свободной от тромбов (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Осаждение ECM в explanted графтов на 3 месяца по сравнению с родной аорты и регенерации тканей. Поперечные изображения регенерированный графтов (A, Cи E) и родной артерии (B, Dи F) были immunostained для обнаружения эндотелиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры и эластина. H & E пятнать показывает регенерации тканей в explanted графтов (G) по сравнению с родной аорты (H). Массон в пятнать показал, что присутствие коллагена в описаны графтов (я) и родной аорты (J). ВВГ пятнать показал наличие эластина в описаны графтов (K) и родной аорты (L). Эти цифры были изменены с Чжао, и др. ¹⁶ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Гистологический анализ explanted графтов на 12 месяцев. (A) H & E пятнать показал регенерации тканей в explanted графтов. (B) эндотелием был immunostained vWF антителом. (C) гладких мышц был immunostained α-SMA антителом. (D) кальцификации была оценена фон Kossa окрашивание. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Решающее значение для восстановления и реконструкции сосудистого трансплантата в естественных условиях¹⁶клеток инфильтрата. Ограниченное клеток инфильтрата часто связаны с относительно небольшой поры трансплантата, которые препятствуют миграции клеток в стену трансплантата. Для преодоления этой трудности, мы разработали модифицированный метод подготовить electrospun PCL сосудистых имплантатов с большой пористую структуру. В деталях размер пор увеличилась с увеличением толщины волокна, который может быть легко контролируется параметры обработки. Результаты показали, что клетки хозяина могут легко проникнуть в стене этой Макропористые трансплантата после имплантации в естественных условиях и клеточности оставался на относительно высоком уровне без очевидных клеток регрессии на 12 месяцев после операции.

Родной артерии главным образом состоит из трех слоев, то есть, эндотелий, туника СМИ и адвентиции. Эндотелий, как анти тромбогенного интерфейс, играет жизненно важную роль в поддержании долгосрочной проходимость кровеносных сосудов. В нашем исследовании полное endothelialization на трансплантата было отмечено на 3 месяца. Кроме того очень важную роль в регулировании функции кровеносных сосудов и предоставляя соответствующие механические свойства артерии туника СМИ, состоящий из нескольких слоев гладких мышечных клеток. Настоящее исследование показало, что electrospun PCL графтов с толстым волокна и большие поры заметно улучшено восстановление функциональных туника СМИ. Кроме того структура регенерированный гладких мышц похож на родной туника СМИ. Пятнать иммунофлюоресценции показал несколько слоев MYH⁺ клеток, распределенных в рамках сети эластина, отражающие сократительной фенотип гладкомышечные клетки окружности. Более важно, регенерации тканей (эндотелия и гладкой мускулатуры) сохранены и не было никаких негативных ремоделирования даже после 12 месяцев из-за дисбаланса между ECM синтеза и деградации.

Кальцификации по-прежнему является одной из основных проблем, связанных с сердечно-сосудистые имплантаты, особенно в сосудистого трансплантата. Сосудистые гладких мышечных клеток (VSMCs) теряют свои оригинальные фенотипа и опыт транс дифференциация в направлении osteochondrogenic, ведущих к внематочной минерализации в процессе сосудистой кальцификации. Наше исследование показало, что без осаждения кальция, происходящих в пределах трансплантата стены даже после 12 месяцев имплантации. Основными причинами препятствует кальцификации в макро пористых сосудистого трансплантата включают в себя: (1) структура макро пористых трансплантата способствует обмену веществ, таких как ионного обмена между клетками и крови; (2) физические сигналы трансплантата структуры могли бы регулировать или препятствовать дифференциация VSMC в остеобластов¹, (3) хорошо клеток инфильтрата в большие поры способствует секреции ECM и тормозит ее деградации, которые будут вызывать кальцификации¹⁷и (4) нормальный или функциональные VSMCs имеют потенциал для предотвращения осаждения кальция¹⁸.

Таким образом долгосрочные оценки макро пористых electrospun PCL сосудистых имплантатов в модели брюшной аорты крысы дает важные потенциальные проблемы разложению сосудистых имплантатов, которые будут направлять следующие исследования.

Авторы имеют не конфликтующие финансовые интересы.

Эта работа была финансово поддержана NSFC проектов (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 и 81401534).