השרשה שתלי כלי הדם Electrospun עם אופטימיזציה מבנה במודל חולדה

כאן, אנו מציגים שיטה electrospinning ששונה כדי להמציא PCL שתלי כלי הדם עם נקבוביות גדולות וסיבים עבים, לתאר את פרוטוקול כדי להעריך את הביצועים ויוו במודל של עכברים של החלפת העורק הראשי.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפברק macroporous PCL שתל וסקולרית. ומתארות פרוטוקול הערכה באמצעות מודל עכברוש של החלפת העורק הראשי. השתלים כלי הדם electrospun לעיתים קרובות בעלי נקבוביות קטנות יחסית, אשר להגביל חדירה לתא השתלים ומעכבים את ההתחדשות ובניה של הניאו-העורקים. במחקר זה, PCL שתלי כלי הדם עם סיבי עבה יותר (5-6 מיקרומטר), נקבוביות גדולות יותר (~ 30 מיקרומטר) היו מפוברק באמצעות טכניקה לעיבוד ששונה. ביצועים לטווח ארוך של השתל הוערך על ידי ההשרשה במודל חולדה. העורק הראשי. אולטראסאונד הראה כי השתלים נותר פטנט ללא מפרצת או היצרות המתרחשים גם לאחר 12 חודשים של השרשה. Macroporous מבנה משופרת של ingrowth תא וקידם ובכך רקמות מחדש בגיל 3 חודשים. חשוב מכך, לא היה סימן של שיפוץ תופעות לוואי, כגון הסתיידות בתוך הקיר שתל לאחר 12 חודשים. לכן, electrospun PCL שתלי כלי דם עם macroporous ששונה עיבוד החזק פוטנציאל להיות תחליף עורק להשתלה לטווח ארוך.

שתלי כלי הדם מחומרים פולימרים סינתטיים מנוצלים נרחב במרפאה לטיפול במחלות לב וכלי דם (CVDs). למרבה הצער, במקרה של השתלים דם בקוטר קטן (D < 6 מ מ) יש מוצרים מוצלחים זמינים עקב נמוך patency מופעלות על ידי מהירות זרימת דם מופחתת, אשר מובילה לעיתים קרובות פקקת, היפרפלזיה intimal, ועוד סיבוכים¹.

הנדסת רקמות מספק אסטרטגיית חלופיים כדי להבין patency לטווח ארוך, הומאוסטזיס מבוסס על התחדשות נימי הדם מונחה לגרדום שחזור. בפירוט, השתל וסקולרית, כתבנית תלת מימדי, יכול לספק תמיכה מכנית והדרכה מבניים במהלך לרגנרציה של רקמות עילאיים ועל ההשפעה פונקציות הסלולר, כולל תא אדהזיה, הגירה, התפשטות, ו הפרשת מטריצה חוץ-תאית². עד עכשיו, פולימרים סינתטיים שונים תאימותם ליישומים בהנדסת רקמות עילאיים. בין אלה פולימרים, poly(ε-caprolactone) (PCL) נחקר באינטנסיביות עקב תא טוב תאימות והשפלה איטי שנעו בין כמה חודשים עד שנתיים³. בעכברוש העורקים מודל^4,5,6, שתלי כלי הדם PCL שעובדו על-ידי electrospinning הציג המבנית מעולה, patency, עלייה מתמדת כמו גם תא הפלישה, כורוידאלית ב שתל קיר עד 6 חודשים. עם זאת, רקמות לוואי שיפוץ, כולל רגרסיה של תאים, נימים, הסתיידות, גם נצפו ב timepoints יותר, עד ל-18 חודשי.

Cellularization של כלי הדם השתל היא גורם מפתח בקביעת התחדשות רקמות, ותתמוך⁷. Electrospinning, כמו טכניקה רב-תכליתי, כבר נרחב מועסקים עבור הכנת שתלי כלי הדם עם מבנה סיבי ננו⁸. למרבה הצער, המבנה הנקבובית קטן יחסית מובילה לעיתים קרובות לא מספיקות תא בחדירת השתל electrospun כלי דם, אשר מגביל את התחדשות רקמות עוקבות. כדי לפתור בעיה זו, טכניקות שונות נוסו כדי להגדיל את גודל הנקבוביות נקבוביות הכוללת, לרבות המלח/הפולימר שטיפת^9,10, שינוי של אספן המנגנון, שלאחר הטיפול על ידי קרינת לייזר¹¹ , ועוד. למעשה, המבנה של שתלי electrospun (כולל סיבים בקוטר גודל הנקבוביות, נקבוביות) קשורה קשר הדוק עיבוד התנאים^12,13. במהלך electrospinning, קוטר סיבים ניתן לשלוט בקלות על-ידי שינוי הפרמטרים, כגון הריכוז של פולימר פתרון, קצב הזרימה, מתח, וכו '. ^{14 , 15}, ו. לכן, גודל הנקבוביות ואת נקבוביות שופרו בהתאם.

לאחרונה דיווחנו PCL ששונה electrospun שתל למבנה macroporous (סיבי עם קוטר של 5-7 מיקרומטר, הנקבוביות של 30-40 µm). In vivo השרשה על-ידי החלפת עכברוש. העורק הראו שיעור גבוה של patency, כמו גם התחדשות endothelialization, שריר חלק טוב בגיל 3 חודשים לאחר הניתוח¹⁶. וחשוב מכך, אין תופעות לוואי רקמות כולל רגרסיה הסתיידות והתא יכול להיות שנצפו גם לאחר שנה אחת של השרשה.

השימוש של חיות ניסוי שאושרו על-ידי חיה ניסויים אתית הוועדה של שינקאנסן האוניברסיטה, ביצעו תואם המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה.

1. ייצור שתלי Electrospun PCL

הערה: בזאת, טכניקת electrospinning היה מנוצל כדי לבדות שתלי כלי הדם.

1. להכין PCL פתרונות של 25 wt % ו 10 wt %, על ידי המסת PCL בתערובת של מתנול, כלורופורם, בהתאמה, (יחס נפח של 1:5), בטמפרטורת החדר (RT) במשך 12 שעות.
2. לטעון את הפתרון PCL לתוך מזרק זכוכית 10-mL.
3. מקם את המזרק עם מחט 21-G.
4. מניחים את מוט פלדה אל חלד (2 מ מ בקוטר 25 ס מ אורך) על המכשיר אוסף.
5. עבור שתלים סיבי עבה יותר, השתמש PCL הפתרון של 25 wt %, ומרחק עבודה של 17 ס מ מחט לאספן, קצב הזרימה של 8 mL/h, מתח של 11 kV כפרמטרים electrospinning. לשימוש שתלי רזה-סיבים, הפתרון PCL של 10 wt %, ומרחק עבודה של 20 ס מ מחט לאספן, קצב זרימה של 2 מ ל/h, מתח של 18 kV כפרמטרים electrospinning.
6. ודא כי השתלים שהושג מוצבים בתוך ואקום למשך הלילה כדי להסיר שאריות הממס. לעקר את כל הכלים לפני ההליך ולשמור על הטכניקה aseptic ברחבי.
7. לפני ההשתלה, לחטא את השתלים על ידי אנו ממליצים להם 10 מ"ל של 75% אתנול למשך 30 דקות ואז לחשוף אותם לאור אולטרא סגול לילה.
8. מדידות גודל סיבים, נקבוביות: לחשב את הקוטר הממוצע סיבים באמצעות תוכנת ImageJ מבוסס על סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM).
9. בדיקות מכניות של פיגומים:
   1. חותכים פיגומים צינורי למקטעים 3 מ מ אורך בעזרת סכין גילוח. למדוד את העובי של פיגומים באמצעות מיקרומטר.
   2. למקם פיגומים הכרישים על מכונת בדיקות מתיחה עם עומס קיבולת של 100 ש
   3. מלחציים פיגומים עם 1 מ"מ הבין-קלאמפ מרחק, למשוך longitudinally בקצב של 10 מ מ/דקה עד קרע. למדוד את חוזק ואת האולטימטיבי התארכות בהפסקה. לחשב את האלסטיות של האזור הליניארי הראשונית (עד 5% זן) של העקומה מתח-זן.

2. עכברוש. העורק השרשה מודל

הערה: כל חומרים, כלים המשמשים בניתוח הם סטרילי. במהלך הניתוח, ודא כי המפעיל לובש מסכה גזה וכפפות סטרילי למניעת זיהומים. ודא שטמפרטורת החדר נשמרת ב- 27-30 ° C כדי לשמור על טמפרטורת הגוף בבעלי חיים. פעל לפי ההנחיות IACUC המקומית בנוגע שיכוך כאבים.

1. השתמש חולדות ספראג Dawley זכר שוקל 240-270 גרם מקבלים שתל של כלי הדם. ודא שהחולדה יש התענה 24 שעות לפני הניתוח. המטרה של חולדות צום של 24 שעות היא ריקה הצואה של המעיים מספיק, ובכך להרחיב האופק של המפעיל.
2. לתפוס הצוואר האחורי של החולדה, הראש כלפי מטה, את המחט springe לתוך חלל הבטן הבטן התחתונה. זירוז של עכברוש בשביל הרדמה עם קלוראל-הידרייט (330 מ ג/ק ג) על ידי זריקה בקרום הבטן.
3. לאשר ההרדמה נאותה על ידי הבטחת העכברוש הגמיש השרירים ונשימה יציבה. מקם את החולדה תחת המיקרוסקופ ההפעלה במצב פרקדן.
4. החל וזלין הוטרינר אופטלמולוגיות משחה על העיניים למניעת יובש תחת הרדמה. לנהל בדיקות דם (UI 100/kg) עם תמיסת מלח פיזיולוגית heparinized פתרון (UI 50/mL) בזריקה וריד הזנב לפני הניתוח.
5. לגלח את הפרווה בקיר הבטן הקדמי באמצעות סכין גילוח, לנקות את העור באמצעות יודיפלור תמיסה תמיסת כוהל רפואי.
6. לבצע חתך laparotomy קו האמצע עם מספריים כירורגיים להבטיח החתך כ 4-5 ס"מ ו ואז לחשוף את חלל הבטן.
7. . משכי, עוטפים את המעיים עם גזה לחלח עם תמיסת מעדיפים.
8. לנתח את העורק הראשי בקפידה.
9. לזהות, מאתרים ומפסיקים את כל הענפים קטן בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.
10. תהדק את המקטע מבודד (עד 1 ס מ אורך) של אבי העורקים באמצעות שני תופסנים כלי הדם. אבי העורקים יכולים להישאר בחוזקה למשך 20-30 דקות.
11. Transect העורק הראשי בין שני תופסנים באמצעות מיקרו-מספריים כדי ליצור את האתרים anastomotic.
12. לרוקן את שני הקצוות של אבי העורקים באמצעות פתרון heparinized מלוחים (UI 50/mL) כדי להסיר את שאריות הדם.
13. לקלף את adventitia באמצעות מיקרו-מספריים.
14. Anastomose השתל ועם הקוטר הפנימי של 2 מ מ 1 ס"מ אורך על העורק הראשי של החולדה עם דפוס התפר של-שמונה בעזרת תפרים ניילון monofilament 9-0.
15. ראשית, לבנות ארבע. חיבור בהתאם לרצף של 9, 3, 12, ו 6 o ' שעון עמדות על הצד צינתור, ואז anastomose את הקצוות לחתוך 4 תפרים בין שני תפרים. לאחר שסיים את התפר צינתור, תפר הצד דיסטלי באותה שיטה.
    הערה: כל תפר נדרש כדי להבטיח שהצד יליד מעט שמוטבע השתל.
16. להסיר את המלחציים דיסטלי כדי לאפשר את הדם לזרום לתוך השתל ולאחר מכן להסיר את המלחציים הפרוקסימלית.
17. הקש את הקצוות התפר כדי לעצור את הדימום באמצעות כדור צמר גפן סטרילי או ספוג גזה קטנים. הקש על 3 דק ', עד hemostasis.
18. להחזיר את המעיים לתוך חלל הבטן.
19. לשטוף את חלל הבטן בעזרת תמיסת מלח פיזיולוגית חמימים פתרון גנטמיצין (320 U/mL).
20. לתפור לקיר הבטן באמצעות ניילון 3-0 בתפר לשכבת השריר והעור, בהתאמה.
21. למקם את החולדה לתוך כלוב נקי ויבש, לשים כרית החימום תחת הכלוב כדי לשמור על טמפרטורת הגוף החי; ואז לחכות החולדה להתאושש מן ההרדמה. לטפל החיה עד זה שהכרתו מספיק כדי לשמור על recumbency בחזה ובצלעות.
22. אחרי זה יחזור להכרה, לשים את החולדה לכלוב יחיד עם מים ואוכל. החל יוד על הפצע כדי למנוע זיהום לאחר הניתוח. להחזיר את החולדה מחברתם של חיות אחרות עד זה יחלים במלואו.
23. המתת חסד חולדות בהתאם להנחיות מוסדיים בנקודות זמן מוגדרים מראש.

השתלים PCL היו explanted ב 3 חודשים ל- 12 חודשים וכאב לאחר הניתוח, נותחו על ידי טכניקות היסטולוגית סטנדרטי עבור hematoxylin ואאוזין (H & E), מאסון trichrome, Verhoeff-ואן Gieson (VVG), פון Kossa ו- immunofluorescence מכתים עבור α-SMA, MYH, vWF ואלסטין. היסטולוגית התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ זקוף, immunofluorescence התמונות צולמו באמצעות מיקרוסקופ fluorescence.

כל הנתונים שבאו לידי ביטוי אומר ± SD. דו-זנבית של סטודנט tלזווג-מבחן שימש את ההשוואה. ערך של p < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית.

שתלי PCL electrospun הרומן עם אופטימיזציה מבנה, כלומר, סיבי עבה יותר, נקבוביות גדולות יותר, זוייפו בהצלחה במחקר זה. תמונות SEM הדגימו כי הקוטר סיבים בממוצע היה עבה כמעט 8 פעמים ב השתלים ששונתה (איור 1 א') מאשר בהמקובל אחד (איור 1B) (5.59 ± 0.67 לעומת 0.69 ± 0.54 מיקרומטר). כתוצאה מכך, גודל הנקבוביות בממוצע היה במידה ניכרת מוגבר, מ ~ מיקרומטר 4.66 ברזה-סיבים שתל כדי ~ מיקרומטר 40.88 ב עבה-סיבים אחד. חתכים הראה התפלגות סיב הומוגנית בתוך הקיר השתלים צינורי סיבי עבה (איור 1D–F) והן קבוצות סיבים רזה (איור 1 ג'י–אני). עובי הקיר היה על 400-500 מיקרומטר. תכונות מכניות של שתלי התאפיינו בדיקות מתיחה, העיקולים מתח טיפוסי-זן היו שמוצג באיור 1C. תכונות מכניות של שני שתלים היו ללא ספק שונה במונחים של התארכות. הערך המתאים שתלי סיבים עבים היה בערך 3 פעמים גבוה יותר מאשר השתלים רזה-סיבים, רומז קשיחות משופרת.

מוכנה השתלים וסקולרית (הקוטר הפנימי של 2.0 מ מ) ואורך של 1 ס מ (איור 2 א) שהיו מושתלים להחלפת קטע מקורי העורק הראשי של עכברוש (איור 2B). בנקודות זמן מוגדרים מראש, patency של השתלים מושתל נבדק על ידי אולטרסאונד. התוצאות הראו כי רוב השתלים היו פטנטים (איור 2C). יתר על כן, המהירות של זרימת הדם היה דומה בין השתל לבין כלי הדם הסמוכים יליד 12 חודשים. שתלים explanted נשמר מורפולוגיה טוב בלי מפרצת (איור דו-ממדי), ללא היצרות או thrombi יכול להיות שנצפו על פני luminal (2E איור).

התחדשות רקמות והפרשת ECM בגיל 3 חודשים היו עוד יותר לאומדן היסטולוגיה ניתוחים. צביעת המטוקסילין הראה כי שכבה של ניאו-רקמת הוקמה ב לומן של השתל (איור 3G-H). יתר על כן, vWF מכתים מראים כי השטח luminal היה מכוסה במלואה שהוקם אנדותל (איור 3 א), הדומה לזה של העורקים יליד (איור 3B). בינתיים מספר שכבות של תאים MYH-חיוביות היו מאורגנים לאורך לכיוון במבניו, המציין את ההתחדשות של מדיה כלי הדם (איור 3C–D). מטריצה חוץ-תאית סינתזה נצפתה על ידי מאסון VVG מכתים, בהתאמה. יכול להיות שנצפו כמות משמעותית של סיבי האלסטין והקולגן בתוך השתל (דמות 3עכשיו–J, K–L), אשר ממלא תפקיד חשוב וסקולרית התחדשות ובניה. Immunofluorescence מכתים נוסף הראה שהמבנה של אלסטין היה מיושר circumferentially בדפוס ככה בעורק מקורי (איור 3E–F).

יתר על כן, הרקמות מחדש כולל אנדותל, שריר חלק מתוחזק משולב, לא לסגת לאחר 12 חודשים של השרשה (איור 4A–C). חשוב מכך, לא היה כל סימן של הסתיידות המתרחשים בתוך קיר שתל מבוסס על Kossa פון מכתים (איור 4D).

איור 1 : המבנה ואת המאפיין מכני של השתל PCL. תמונות SEM של electrospun PCL מחצלות עם סיבי עבה יותר (A) וסיבים רזה (B). חתכי רוחב של סיבי עבה שתלי צינורי (נד–), שתלי רזה-סיבים (G–אני). העקומה נציג מתח-מתח מוצג (C). הדמויות שונו מזאו, et al. ¹⁶ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : השתלת שתלי כלי הדם במודל העורק הראשי של עכברוש. Electrospun PCL שתל כלי הדם של 1 ס מ אורך (א) היה בניתוח התערב לתוך העורק הראשי של עכברוש (B). תמונת אולטרסאונד הראו כי השתל היה פטנט ויוו -1 שנה (C). תמונות stereomicroscopic מראים כי השתל הייתה משולבת היטב עם אבי העורקים יליד סמוכים ללא מפרצת (D), פני השטח luminal הוא נקי וללא כגון (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : התחדשות רקמות, תצהיר של ECM עוד השתלים explanted בגיל 3 חודשים לעומת אבי העורקים יליד. תמונות חתך של שתלי מחדש (A, Cו- E), יליד עורק (B, Dו- F) היו immunostained כדי לזהות את תאי אנדותל תאי שריר חלק, אלסטין. צביעת המטוקסילין מציג את התחדשות רקמות ב השתלים explanted (G) לעומת אבי העורקים יליד (H). מאסון של צביעת חשף כי הנוכחות של קולגן שתלי explanted (אני), יליד אבי העורקים (J). VVG מכתים הראה הנוכחות של אלסטין שתלי explanted (K), יליד אבי העורקים (L). הדמויות שונו מזאו, et al. ¹⁶ אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : ניתוח היסטולוגית של השתלים explanted 12 חודשים- (א) H & E מכתים הראה את התחדשות רקמות ב השתלים explanted. (ב) אנדותל היה immunostained על ידי נוגדנים vWF. שריר חלק (C) היה immunostained על ידי נוגדנים α-SMA. הסתיידות (D) הוערך על ידי פון Kossa מכתים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

חדירה לתא הוא קריטי עבור ההתחדשות, שיפוץ של שתל וסקולרית ויוו¹⁶. חדירה לתא מוגבל קשורה לעיתים קרובות הנקבוביות קטן יחסית של השתל המעכבים את ההעברה של תאים לתוך הקיר שתל. כדי לטפל הקושי הזה, פיתחנו שיטה שונה להכין electrospun PCL שתלי כלי הדם עם מבנה גדול שם. בפירוט, גודל הנקבוביות גדל עם הגידול של עובי סיבים זה יכול להיות נשלט בקלות על ידי הפרמטרים עיבוד. התוצאות הראו כי התאים מארח יכול בקלות לחדור לתוך הקיר של שתל macroporous הזה לאחר ההשתלה ויוו , cellularity נשאר ברמה יחסית גבוהה ללא תא ברור רגרסיה ב 12 חודשים לאחר הניתוח.

עורק יליד מורכבת בעיקר שלוש שכבות, כלומר, אנדותל, tunica מדיה ו- adventitia. אנדותל, כממשק anti-thrombogenic, ממלא תפקיד חיוני בשמירה על patency לטווח ארוך של כלי הדם. במחקר שלנו, endothelialization מלא בשתל נצפתה בגיל 3 חודשים. בנוסף, התקשורת tunica המורכב ממספר שכבות של תאי שריר חלק חשובים מאוד ויסות תפקוד כלי דם ומספקת המתאים תכונות מכניות של העורק. המחקר הנוכחי חשף כי electrospun שתלי PCL עם סיבי עבה, נקבוביות גדולות משופרת במידה ניכרת לרגנרציה של מדיה tunica פונקציונלי. חוץ מזה, המבנה של שריר חלק regenerated דומה לזה של התקשורת tunica מקורית. Immunofluorescence מכתים הראו מספר שכבות של תאים MYH⁺ מופץ בתוך רשת אלסטין, המשקף את פנוטיפ כויץ תאי שריר חלק circumferentially. יותר חשוב, מחדש רקמות (אנדותל והן שריר חלק) שמרה תמים ולא היה שום שיפוץ לוואי אפילו לאחר 12 חודשים עקב חוסר האיזון בין ECM סינתזה והשפלה.

הסתיידות היא עדיין בעיה רצינית המשויך השתלות לב וכלי דם, בפרט השתל כלי הדם. תאי השריר החלק בכלי הדם (VSMCs) לאבד פנוטיפ המקורי שלהם וניסיון הטרנס-בידול כלפי כיוון osteochondrogenic, שמוביל מינרליזציה חוץ רחמי במהלך התהליך של הסתיידות כלי הדם. המחקר שלנו מראים כי אין התצהיר סידן המתרחשים בתוך הקיר שתל גם לאחר 12 חודשים של השרשה. הסיבות העיקריות הסתיידות עכבות של השתל וסקולרית נקבובי מאקרו כוללים: (1) המבנה של השתל מאקרו נקבובי מקדמת את חילוף החומרים, כגון חילוף יונים בין תאי דם; (2) רמזים הפיזי של מבנה השתל יכול לווסת או לעכב את הבידול של VSMC לתוך אוסטאובלסט¹, חדירה לתא טוב (3) על נקבוביות גדולות מקדמת את הפרשת ה-ECM, מעכב והשפלות שלו שיפעילו הסתיידות¹⁷, VSMCs רגיל או תפקודית (4) יש פוטנציאל למנוע את התצהיר של סידן¹⁸.

לסיכום, הערכת לטווח ארוך electrospun מאקרו נקבובי PCL שתלי כלי הדם במודל חולדה. העורק הראשי מספק תובנה חשובה אתגרים פוטנציאליים שתלי כלי הדם מתכלה, שינחו את המחקר הבא.

המחברים יש אינטרסים כלכליים לא סותרים.

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי פרויקטים NSFC (81522023, 81530059, 91639113, 81772000, 81371699 ו- 81401534).