Method Article
نقدم هنا، أسلوب اليكتروسبينينج معدلة لاختلاق PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ألياف سميكة والمسام الكبيرة، ووصف وضع بروتوكول لتقييم الأداء في فيفو في نموذج الفئران لاستبدال الشريان الاورطي البطني.
نقدم هنا، بروتوكولا لاختلاق ماكروبوروس PCL الاختلاس والأوعية الدموية، ووصف وضع بروتوكول تقييم باستخدام نموذج الفئران لاستبدال الشريان الاورطي البطني. غالباً ما تمتلك ترقيع الأوعية الدموية اليكتروسبون المسام الصغيرة نسبيا، والتي تحد من اختراق الخلية الطعوم وتعيق التجديد وإعادة عرض النيو-الشرايين. في هذه الدراسة، كانت ملفقة PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ألياف أكثر سمكا (5-6 ميكرومتر) وأكبر المسام (~ 30 ميكرومتر) باستخدام تقنية معالجة معدلة. تم تقييم الأداء على المدى الطويل للاختلاس بغرس في نموذج الفئران الشريان الاورطي البطني. وأظهر تحليل الموجات فوق الصوتية أن الطعوم لا تزال البراءات دون تمدد الأوعية الدموية أو تضيق تحدث حتى بعد 12 شهرا زرع. هيكل ماكروبوروس تحسين إينجرووث خلية وهكذا شجعت الأنسجة مجدد في 3 أشهر. الأهم من ذلك، لا توجد أي إشارة ليعيد البناء الضارة، مثل تكلس داخل الجدار الاختلاس بعد 12 شهرا. ولذلك، اليكتروسبون PCL ترقيع الأوعية الدموية مع ماكروبوروس تعديل تجهيز عقد يحتمل أن تكون بديلاً شريان لغرس طويلة الأجل.
ترقيع الأوعية المصنوعة من البوليمرات الاصطناعية تستخدم على نطاق واسع في عيادة لعلاج أمراض القلب والأوعية الدموية (كفدس). للأسف، في حالة ترقيع الأوعية الدموية الصغيرة-قطر (د < 6 مم) لا تتوفر أي منتجات ناجحة بسبب سالكيه المنخفضة الناجمة عن سرعة تدفق الدم مخفضة، الأمر الذي غالباً ما يؤدي إلى تجلط الدم وفرط إينتيمال، وغيرها 1من المضاعفات.
هندسة الأنسجة يوفر استراتيجية بديلة لتحقيق سالكيه طويلة الأجل والتوازن على أساس سقالة تسترشد تجديد الأوعية الدموية وإعادة الإعمار. بالتفصيل، الاختلاس والأوعية الدموية، كقالب ثلاثي الأبعاد، يمكن أن توفر الدعم الميكانيكية والتوجيه الهيكلية خلال تجديد الوظائف الخلوية الأنسجة الوعائية والنفوذ، بما في ذلك التصاق الخلايا، والهجرة، والانتشار، و إفراز من المصفوفة خارج الخلية2. وحتى الآن، تم تقييمها البوليمرات التركيبية المختلفة لتطبيقات في هندسة الأنسجة الوعائية. من بين هذه البوليمرات، poly(ε-caprolactone) (PCL) التحقيق مكثف نظراً للتوافق الخليوي جيدة وتدهور بطيء تتراوح بين عدة أشهر إلى عامين3. في الفئران الشريان الاورطي نموذجي4،5،6، عرضت ترقيع الأوعية الدموية PCL معالجتها بواسطة اليكتروسبينينج السلامة الهيكلية ممتازة وسالكيه وغزو الخلية بشكل مستمر، وكذلك زيادة ونيوفاسكولاريزيشن في الجدار الابتزاز لمدة تصل إلى 6 أشهر. ومع ذلك، يعيد البناء الأنسجة الضارة، بما في ذلك الانحدار من الخلايا والشعيرات الدموية وتكلس، لوحظت أيضا في تيميبوينتس أطول، حتى لمدة 18 شهرا.
سيلولاريزيشن الفساد والأوعية الدموية عامل رئيسي في تحديد تجديد الأنسجة وإصلاح7. اليكتروسبينينج، كتقنية متعددة الاستعمالات، على نطاق واسع واستخدمت للتحضير ترقيع الأوعية الدموية مع هيكل نانو ليفية8. ولسوء الحظ، هيكل مسام صغيرة نسبيا غالباً ما يؤدي إلى تسلل خلية غير كافية في الفساد اليكتروسبون والأوعية الدموية، مما يحد من تجديد الأنسجة اللاحقة. لحل هذه المشكلة، حاولت تقنيات مختلفة لزيادة حجم المسام والمساميه عموما، بما في ذلك الملح/البوليمر النض9،10، تعديل جهاز جامع، وبعد العلاج بالإشعاع الليزر11 ، إلخ. وفي الواقع، هيكل ترقيع اليكتروسبون (بما في ذلك القطر الألياف وحجم المسام مسامية) ارتباطاً وثيقا بال12،شروط تجهيز13. أثناء اليكتروسبينينج، يمكن التحكم قطر الألياف بسهولة عن طريق تغيير المعلمات، مثل تركيز حل البوليمر، ومعدل التدفق، والجهد، إلخ. 14 , 15، وذلك، حجم المسام مسامية تم تعزيز وتبعاً لذلك.
نحن ذكرت مؤخرا طعم اليكتروسبون PCL معدلة مع هيكل ماكروبوروس (ألياف مع قطرها من 5-7 ميكرون والمسام من 30-40 ميكرون). في فيفو غرس باستبدال الشريان الاورطي البطني الفئران أظهرت ارتفاع معدل سالكيه، فضلا عن تجديد اندوثيلياليزيشن والعضلات الملساء جيدة في الجراحة بعد 3 أشهر16. الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة لا أنسجة ضارة يعيد البناء بما في ذلك الانحدار تكلس وخلية حتى بعد سنة واحدة من زرع.
استخدام الحيوانات التجريبية كان وافق "الحيوانات التجارب الأخلاقية اللجنة من جامعة نانكاى" ونفذ وفقا للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1-تصنيع الطعوم PCL اليكتروسبون
ملاحظة: هذه الوثيقة، استخدم أسلوب اليكتروسبينينج لاختلاق ترقيع الأوعية الدموية.
2-الجرذ الشريان الاورطي البطني غرس النموذجي
ملاحظة: جميع المواد والأدوات المستخدمة في الجراحة عقيمة. أثناء الجراحة، تأكد من أن المشغل ترتدي قناع شاش والقفازات المعقمة لتجنب العدوى. التأكد من درجة حرارة الغرفة يتم الاحتفاظ في 27-30 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. اتبع المبادئ التوجيهية إياكوك المحلية بشأن التسكين.
الطعوم PCL كانت اكسبلانتيد في 3 أشهر و 12 شهرا قد وتحليلها من قبل تقنيات نسيجية القياسية الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E)، الفلورة تلطيخ ل α-SMA، ويحققون فون، ماسون trichrome وجيسون فإن بيرهوف (ففج) مية و vWF الايلاستين. أخذت الصور النسيجي باستخدام مجهر تستقيم، وأخذت الصور الفلورة استخدام مجهر fluorescence.
وأعرب عن جميع البيانات يعني ± التنمية المستدامة. اثنين-الذيل إقران الطالب t-تم استخدام اختبار لمقارنة الاختلافات. قيمة p < اعتبرت 0.05 يعتد به إحصائيا.
اليكتروسبون رواية PCL الطعوم مع الهيكل الأمثل، أي ألياف أكثر سمكا والمسام الكبيرة، كانت ملفقة بنجاح في هذه الدراسة. صور SEM تثبت أن قطر الألياف متوسط تقريبا 8 مرات أكثر سمكا في ترقيع المعدلة (الشكل 1A) مما في التقليدية واحد (الشكل 1B) (± 5.59 0.67 مقابل 0.69 ± 0.54 ميكرومتر). كنتيجة لذلك، كان حجم المسام متوسط ملحوظ زيادة، من ~ ميكرومتر 4.66 في الاختلاس أرق-الألياف إلى ~ 40.88 مليميكرون أثخن الألياف أحد. وأظهرت المقاطع العرضية توزيع الألياف متجانسة داخل الجدار الطعوم أنبوبي في أثخن الألياف (الشكل 1–و) ومجموعات أرق-الألياف (الشكل 1–أنا). وكان سمك الجدار عن 400-500 ميكرون. الخواص الميكانيكية ترقيع اتسمت باختبار الشد، ومنحنيات الإجهاد-الانفعال نموذجي مبين في الشكل 1. الخواص الميكانيكية ترقيع اثنين كان من الواضح أنها مختلفة من حيث الاستطالة. وكان القيمة المقابلة ترقيع أثخن الألياف حوالي 3 إضعاف الطعوم أرق-الألياف، مما يوحي بالمتانة المحسنة.
ترقيع الأوعية الدموية المعدة (القطر الداخلي 2.0 مم) وطول 1 سم (الشكل 2A) تم زرعها لاستبدال جزء من الشريان الاورطي البطني الأصلية في الفئران (الشكل 2). عند نقطة زمنية محددة مسبقاً، تم فحص سالكيه الطعوم مزروع بالموجات فوق الصوتية. النتائج أظهرت أن معظم الطعوم من براءات الاختراع (الشكل 2). علاوة على ذلك، كانت سرعة تدفق الدم مماثلة بين الفساد والأوعية الدموية الأصلية المجاورة في غضون 12 شهرا. اكسبلانتيد ترقيع الاحتفاظ مورفولوجيا جيدة دون تمدد الأوعية الدموية (الشكل 2D)، ويمكن ملاحظة لا تضيق أو الجلطات على سطح لومينال (الشكل 2E).
كذلك تم تقييم تجديد الأنسجة وإفراز ECM في 3 أشهر بتحاليل الأنسجة. ح & ه تلطيخ أظهرت أن تشكلت طبقة من أنسجة الأجسام القريبة من الأرض في التجويف الاختلاس (الشكل 3-H). وعلاوة على ذلك، تلطيخ vWF تبين أن السطح لومينال مشمولة بالكامل في البطانة المشكلة حديثا (الشكل 3 ألف)، تشبه من الشريان الاورطي الأصلي (الشكل 3B). وفي الوقت نفسه نظمت عدة طبقات من الخلايا إيجابية مية على طول اتجاه كفافى، مشيراً إلى تجديد وسائط الأوعية الدموية (الشكل 3–د). ولاحظ توليف المصفوفة خارج الخلية ماسون وففج تلطيخ، على التوالي. ويمكن ملاحظة كمية كبيرة من الكولاجين وألياف الايلاستين ضمن الابتزاز (الشكل 3I–ي، ك–L)، الذي يلعب دوراً مهما في تجديد الأوعية الدموية ويعيد البناء. كما أظهرت تلطيخ الفلورة هيكل الايلاستين تمت محاذاة circumferentially في نمط مثل هذا في الشريان الأصلي (الشكل 3E–و).
وعلاوة على ذلك، الأنسجة المجددة بما في ذلك البطانة والحفاظ على العضلات الملساء المتكاملة وعدم التراجع بعد 12 شهرا غرس (4A الرقم–ج). الأهم من ذلك، لا توجد أي إشارة تكلس التي تحدث داخل الجدار الاختلاس استناداً إلى كوسي فون تلطيخ (الشكل 4).
الشكل 1 : هيكل والخصائص الميكانيكية للاختلاس PCL. صور SEM اليكتروسبون PCL الحصير ألياف أكثر سمكا (A) وأرق ألياف (ب). المقاطع العرضية أثخن الألياف الطعوم أنبوبي (د–و) والطعوم أرق-الألياف (ز–أنا). (ج) يبين منحنى الإجهاد إجهاد تمثيلية. وقد تم تعديل هذه الأرقام من تشاو, et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : غرس ترقيع الأوعية الدموية في الشريان الاورطي البطني نموذج الفئران. وكان الفساد PCL اليكتروسبون الأوعية الدموية من 1 سم في الطول (A) جراحيا ستفصل في الشريان الاورطي البطني في الفئران (ب). صورة بالموجات فوق الصوتية أظهرت أن الاختلاس براءات الاختراع في فيفو في السنة 1 (ج). صور ستيريوميكروسكوبيك تظهر أن الاختلاس متكامل مع الشريان الاورطي الأصلية المجاورة دون تمدد الأوعية الدموية (د)، والسطح لومينال نظيفة وخالية من خثرة (E). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تجديد الأنسجة وترسب ECM في ترقيع اكسبلانتيد في 3 أشهر بالمقارنة مع الشريان الاورطي الأصلي- الصور المقطعية الطعوم المجددة (Aو Cو E) والشريان الأصلي (ب ود، وواو) كانت إيمونوستينيد للكشف عن خلايا بطانية، خلايا العضلات الملساء، والايلاستين. ح & ه تلطيخ يظهر تجديد الأنسجة في ترقيع اكسبلانتيد (ز) مقارنة بالشريان الاورطي الأصلي (ح). ماسون في تلطيخ كشفت أن وجود الكولاجين في ترقيع اكسبلانتيد (أنا) والشريان الاورطي الأصلي (J). تلوين ففج أظهرت وجود الايلاستين في ترقيع اكسبلانتيد (K) والشريان الاورطي الأصلي (L). وقد تم تعديل هذه الأرقام من تشاو, et al. 16 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : التحليل النسيجي ترقيع اكسبلانتيد في 12 شهرا- (أ) ح & ه تلطيخ أظهر تجديد الأنسجة في ترقيع اكسبلانتيد. (ب) البطانة كان إيمونوستينيد بجسم فوف. العضلات الملساء (ج) كان إيمونوستينيد بجسم α-SMA. وكان تقييم تكلس (د) فون كوسي تلطيخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تسلل خلية حاسم بالنسبة للتجديد ويعيد للابتزاز والأوعية الدموية في الجسم الحي16. تسلل خلية محدودة غالباً ما تتصل بمسام صغيرة نسبيا الاختلاس التي تعوق هجرة الخلايا إلى الجدار الاختلاس. ولمواجهة هذه الصعوبة، قمنا بتطوير طريقة معدلة لإعداد اليكتروسبون PCL ترقيع الأوعية الدموية مع هيكل المسام الكبيرة. بالتفصيل، زيادة حجم المسام مع زيادة سمك الألياف التي يمكن التحكم في سهولة بمعالجة معلمات. وأظهرت النتائج أن الخلايا المضيفة يمكن بسهولة التسلل إلى الجدار لهذا الابتزاز ماكروبوروس بعد في فيفو غرس وسيلولاريتي ظلت على مستوى عال نسبيا دون الانحدار الخلية واضحة في الجراحة بعد 12 شهرا.
يتكون الشريان الأصلي أساسا من ثلاث طبقات، هي البطانة، والغلالة وسائل الإعلام، والغلالة. البطانة، كواجهة ثرومبوجينيك المضادة، تلعب دوراً حيويا في الحفاظ على سالكيه طويلة الأجل من الأوعية الدموية. في دراستنا، لوحظ endothelialization كاملة على الاختلاس في 3 أشهر. وبالإضافة إلى ذلك، وسائل الإعلام الغلالة تتكون من عدة طبقات من خلايا العضلات الملساء مهمة جداً في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية وتوفير الخصائص الميكانيكية الملائمة الشريان. كشفت هذه الدراسة أن ترقيع PCL اليكتروسبون مع ألياف سميكة والمسام كبير ملحوظ تعزيز التجديد لوسائل الإعلام الغلالة الوظيفية. وإلى جانب ذلك، بنية العضلات الملساء المجددة مماثلة لتلك التي الأصلي الغلالة وسائل الإعلام. وأظهرت عدة طبقات من خلايا مية+ موزعة داخل شبكة الايلاستين، مما يعكس النمط الظاهري الهوس من خلايا العضلات الملساء circumferentially تلطيخ الفلورة. أكثر الأهم من ذلك، إعادة إنشاء الأنسجة (العضلات الملساء والبطانة) تبقى سليمة وكان هناك لا يعيد البناء الضارة حتى بعد 12 شهرا بسبب اختلال التوازن بين التوليف إدارة المحتوى في المؤسسة، والتدهور.
تكلس لا تزال مشكلة رئيسية المرتبطة بزراعة القلب والأوعية الدموية، لا سيما في الابتزاز والأوعية الدموية. خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية (فسمكس) تفقد النمط الظاهري الأصلي وتجربة التمايز عبر اتجاه أوستيوتشوندروجينيك، مما يؤدي إلى حمل خارج الرحم من التمعدن أثناء العملية تكلس الأوعية الدموية. وأظهرت دراستنا أن كان هناك لا ترسب الكالسيوم التي تحدث داخل الجدار الفساد حتى بعد 12 شهرا زرع. وتشمل الأسباب الرئيسية تكلس تحول دون في الابتزاز والأوعية الدموية ماكرو المسامية: (1) هيكل الاختلاس الماكرو المسامية يعزز التمثيل الغذائي، مثل التبادل الأيوني بين الخلايا والدم؛ (2) الرموز المادية هيكل الفساد يمكن أن تنظم أو تمنع التفريق بين فسمك إلى أوستيوبلاست1، (3) تسلل خلية جيدة في المسام الكبيرة تعزز إفراز إدارة المحتوى في المؤسسة، ويحول دون تدهورها الذي سيقوم بتشغيل تكلس17، و (4) فسمكس طبيعية أو وظيفية على إمكانيات لمنع ترسب الكالسيوم18.
وباختصار، التقييم طويل الأجل من اليكتروسبون الماكرو المسامية PCL ترقيع الأوعية الدموية في نموذج الفئران الشريان الاورطي البطني ثاقبة هامة التحديات المحتملة ترقيع الأوعية القابلة للتحلل، التي سوف توجه البحوث التالية.
المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.
وأيد هذا العمل ماليا المشاريع تشرف (81522023، 81530059، 91639113، 81772000، 81371699 و 81401534).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Poly(ε-caprolactone) (PCL) pellets (Mn=80,000) | Sigma | 704067 | |
Methanol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1060 | |
Alcohol | Tianjin Chemical Reagent Company | 1083 | |
Chloroform | Tianjin Chemical Reagent Company | A1007 | |
Sucrose | Tianjin Fengchuan Company | 2296 | |
Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
Sprague Dawley rats | Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medical Sciences | ||
Normal saline | Hebei Tiancheng Pharmaceutical company | ||
Chloral hydrate | Tianjin Ruijinte chemical company | 2223 | |
Heparin sodium Injection | Tianjin Biochem Pharmaceutical company | ||
Gentamycin Sulfate Injection | Jiangsu Lianshui Pharmaceutical company | ||
Mouse anti-α-SMA primary antibody | Abcam | ab7817 | |
Mouse anti-smooth MYH primary antibody | Abcam | ab683 | |
Rabbit polyclonal anti-rat elastin antibody | Abcam | ab23748 | |
Rabbit anti-von Willebrand factor primary antibody | Abcam | ab6994 | |
Goat anti-mouse IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150117 | |
Goat anti-rabbit IgG (Alexa Fluor 488) | Invitrogen | ab150077 | |
5% normal goat serum | Zhongshan Golden bridge | ZLI9022 | |
Hematoxylin and eosin (H&E) | Beijing leagene biotech | DH0006 | |
Masson's trichrome | Beijing leagene biotech | DC0032 | |
Verhoeff-van Gieson (VVG) | Beijing leagene biotech | DC0059 | |
Von Kossa | Beijing leagene biotech | DS0003 | |
Surgical sutures needles with thread,3-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | G3002b | |
Surgical sutures needles with thread,9-0 silk | Shanghai Jinhuan medical supplies company | H901 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved