Mikrosıvısal çip Situ Crystal x-ışını kırınım ve in Situ dinamik ışık saçılma seri kristalografisi için için

Bu protokolü nasıl imal ve mikrosıvısal cihazlar x-ışını kırınım veri toplama oda sıcaklığında için ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. Ayrıca, protein kristalizasyon tarafından dinamik ışık saçılma izlemek açıklar ve nasıl işlemek ve analiz kırınım veri elde.

Bu iletişim kuralı imalatı mikrosıvısal aygıtları sabit hedef seri kristalografisi gonyometre tabanlı için en iyi duruma getirilmiş düşük X-ray arka plan ile açıklar. Aygıtlar epoksi yapıştırıcı kullanarak yumuşak litografi desenli ve in situ x-ışını kırınım deneyler oda sıcaklığında için uygundur. Örnek wells kırınım veri toplama düşük X-ray arka plan ile izin polimer polimid folyo windows ile her iki tarafta kapaklı. Bu uydurma basit ve ucuz bir yöntemdir. SU-8 ana gofret tedarik sonra tüm üretim dışında bir temiz oda tipik araştırma laboratuarı ortamında tamamlanabilir. Yonga tasarım ve üretim protokolü kullanmak valving kapiller microfluidically sulu bir reaksiyon tanımlanmış nanoliter boyutlu damlacıkları içine bölmek için. Bu yükleme mekanizması kanal ölü biriminden örnek kaybı önler ve kolayca el ile pompaları veya diğer donanım için sıvı çalıştırma kullanmadan yapılabilir. Protein çözüm nasıl izole boyutlu nanoliter damla denetim protein kristal çekirdekleşme ve büyüme için dinamik ışık tarafından izlenen situ saçılma açıklar. Uygun kristalleri yetiştirilen sonra tam x-ışını kırınım veri kümeleri gonyometre dayalı sabit in situ hedef seri x-ışını kristalografisi oda sıcaklığında kullanarak toplanabilir. İletişim kuralı çözmek ve protein kristal yapısı rafine bir yazılım araç paketi kullanarak kırınım veri kümelerini işlemek üzere özel komut dosyaları sağlar. Bu yaklaşım muhtemelen cryo-koruma veya el ile kristal geleneksel kristalografisi deneylerde işleme sırasında indüklenen eserler önler. Biz mevcut ve ile boyutlar-in yaklaşık 10-20 µm yongasında yetiştirilen küçük kristalleri kullanarak çözüldü üç protein yapıları karşılaştırabilirsiniz. Crystallizing ve in situ, kauçuk ve dolayısıyla mekanik diffracting bozuklukları kırılgan kristallerinin simge durumuna küçültülmüş. Protokol nasıl bir özel X-ray şeffaf mikrosıvısal çip in situ seri kristalografisi için uygun imal etmek ayrıntılı. Hemen hemen her kristal kırınım veri toplamak için kullanılan bu mikrosıvısal çip çok verimli kristal teslim yöntem şunlardır.

Bir protein 3D yapısını bilmek onun işlevselliğini anlamak önemlidir. Yakınındaki atomik çözünürlükte yapılar defa en sık x-ışını kristalografisi tarafından elde edilir. Bu teknik protein kristalleri X-ray radyasyon ortaya çıkaran ve ortaya çıkan kırınım desen sonra yapı belirlenmesi ve arıtma için analiz edilir. Geleneksel x-ışını kristalografisi içinde kalma Kryojenik sıcaklıklarda bir tek, ideal olarak büyük, tam kırınım veri kümesi kaydedilir. Bu kristaller ancak, büyümek için önemsiz değildir çoğunlukla ve uygun cryo-koruma koşulları tanımlamak için kendi içinde zorlu olmak ve bazen de sapmalar yerli protein yapısı⁵neden olabilir.

X-ışını serbest elektron lazer (FEL) ve sinkrotron beamlines son teknolojik gelişmeler daha küçük kristaller yapılardan çözmek için izin, mikro odaklanan yeni beamlines olarak artan x-ışını ışınla parlak ve geliştirilmiş x-ışını dedektörleri oldu mevcut^6,7. Genellikle, küçük kristaller daha büyük büyümek ve ücretsiz kristalleri^8,9sığınmak daha kolaydır. Ancak, x-ışını radyasyon hasarı büyük kristaller daha hızlı küçük kristaller muzdarip. Bu çünkü büyük bir kristal karşılaştırıldığında, daha yüksek bir x-ışını doz için karşılaştırılabilir çözünürlük diffract için küçük bir kristal hacim içine öngörülen gerekir. Bu nedenle, hatta kriyojenik koruma tam kırınım veri kümesinden tek bir microcrystal kaydetmek için yeterli genellikle değildir.

Bu engeli aşmak için seri kristalografisi toplamak ve tam bir dataset elde etmek için birçok rasgele odaklı microcrystals Difraksiyon desenlerini birleştirme için seçtiğiniz yöntemi haline gelmiştir. İndüklenen kristal hasar toplam X-ray doz yayarak en aza radyasyon kullanılan bir protein yapı kristalleri^5,10, yüksek bir dizi üzerinden çözmek için. İçinde bir ' diffract önce yok ' FEL deneme, her kristal, yalnızca femto saniyelik X-ray darbeleri kullanarak bir pozlama için kullanılır. Mikro-odak beamlines üçüncü nesil sinkrotron kaynakları, sırayla bir kaç milisaniye kısa X-ray Etkilenmeler^11,12,13,ile¹⁴seri kristalografisi gerçekleştirebilirsiniz. Bir kristal salınım veya döndürme veri toplama sırasında, ancak, yalnızca kısmi Bragg yansımaları kaydedilebilir ve bu nedenle zaman-in bin veya daha fazla kırınım desenleri yapı belirlenmesi¹⁵için genellikle gereklidir. Bugüne kadar çeşitli bir dizi örnek teslim yöntem son zamanlarda gözden geçirilen^{14,16,17,18,19}seri kristalografisi için geliştirilmiştir. O arasında çeşitli sabit hedef örnek teslim böyle önemli ölçüde daha az kırınım desenleri aynı derecede tam veri kümeleri de daha az tüketen süre sağlayabilir stratejileri başarıyla kristal döndürme sırasında x-ışını Etkilenmeler ile kombine edilmiştir dayalı örnek karşılaştırıldığında klasik seri kristalografisi için hareketsiz görüntüler nerede deneyler^{7,16,20,21,22,23} kaydedildi. ^{, 24}.

Biz mikrosıvısal cihazlar düşük X-ray arka plan ile imal etmek bir iletişim kuralı mevcut. Aygıtlar 5-dak epoksi yapıştırıcı kullanarak yumuşak litografi desenli ve oda sıcaklığında ile durum olarak numune hazırlama x-ışını kurulum doğrudan entegre üzerinden yararına in-situ x-ışını kırınım deneyler için uygundur karıştırma kaynaklı Kinetik^18,19izleyin zaman çözülmesi çalışmaları. Mikrosıvısal kanalları ile polimer polimid folyo, kombine düşük X-ray arka plan görüntüleme için izin yaklaşık 16 µm kalınlığında röntgen Windows'da sonuçlanan her iki tarafta kapaklı. Tüm kullanılan malzemeler iyi solvent direnci sağlar. Bu üretim nispeten basit ve ucuz bir yöntemdir. SU-8 ana gofret tedarik sonra tüm üretim dışında bir temiz oda tipik araştırma laboratuarı ortamında tamamlanabilir.

Gonyometre sabit hedef seri kristalografisi tabanlı için bir uygulama örnek olarak tarif biz cips. İlk olarak, sulu bir reaksiyon nanoliter boyutlu damlacıkları seçili bir dizi içine bölünmüş microfluidically kılcal valving kullanmak için tasarım ve imalat konuları ele alınmıştır. Bu yükleme mekanizması kanal ölü biriminden örnek kaybı önler ve bölme kolayca el ile pompaları veya diğer donanım için sıvı çalıştırma kullanmadan yapılabilir. Böyle izole nanoliter boyutlu protein çözüm izlenen in situ denetim protein kristal çekirdekleşme ve büyüme için dinamik ışık saçılma (DL) kullanarak damlaları. Daha önce DLS ölçümleri bir cam slayt^25,-²⁶bağlı polydimethylsiloxane (PDMS) yapısının oluşan mikrosıvısal cihazlarda gerçekleştirilebilir kanıtlanmıştır. Polimid katman 550 uzun dalga boyları için yüksek bir iletim olduğundan nm, yaklaşım uzatılabilir X-ray şeffaf cips de, ölçümler bir uygun lazer dalga boyu^27,28kullanırken. DLS sonuçlarına göre ilk çekirdekleşme görülebilir ve daha fazla damlacık buharlaşma daha az ama daha büyük protein kristalleri elde etmek için durdu.

Yeterli kristalleri yetiştirilen sonra tam x-ışını kırınım veri kümeleri sonra oda sıcaklığında gonyometre dayalı sabit in situ hedef seri x-ışını kristalografisi kullanarak toplanabilir. Kırınım veri kümeleri protein kristal yapısı çözmek için yazılım araçları ve özel komut dosyaları kullanılarak işlenir. Bu teknik genellikle cryo-koruma geleneksel kristalografisi deneylerde kullanılan sırasında indüklenen eserler önler.

Biz hakkında kullanarak çözüldü üç protein hedef yapıları karşılaştırmak 10-20 µm küçük kristaller yongasında daha sonra 2 Å çözünürlük için büyüdü. Crystallizing ve in situ, kauçuk ve dolayısıyla mekanik diffracting bozuklukları kırılgan kristallerinin simge durumuna küçültülmüş. Bu iletişim kuralı hangi diffract protein kristalleri için yüksek çözünürlüklü yanı sıra düşük çözünürlük (1.7 Å 3.0 Å) uygulanabilir. Olarak hemen hemen her kristal kırınımı için kullanılabilir, bu yapım bir çok verimli kristal Teslimat yöntemi küçük örnek harcanıyor.

Bu iletişim kuralı, in situ protein kristalizasyon ve kırınım veri toplama için x-ışını şeffaf mikrosıvısal çip hazırlamak ayrıntılı bir rehber sağlar. Prosedürü dikkatle laboratuarda gelişmiş ekipman gerekmeden mikrosıvısal hassas faydalanmak için tasarlanmıştır. Ayrıca, veri toplama sinkrotron beamline adlı bir özel gonyometre veya nemlendirici sonuçlar üreten kolaylaştırmak için gerek kalmadan sigara-uzmanlar tarafından gerçekleştirilebilir. Sunulan teknik cryo-koruma veya kristal işleyerek seri milisaniyelik kristalografisi veri toplama en az radyasyon hasarı tutarken ve stres için kristalleri büyüme sonra tanıtımı olmadan oda sıcaklığında için uygulanabilir. Bu nedenle, açıklanan yöntemi herhangi bir protein kristalizasyon proje için uygundur.

1. tasarım ve ana üretim chip

1. Maske tasarım
   1. Uygun bir CAD çizim programı kullanarak istediðiniz kanala geometrileri anahat. Her fotorezist katmanı için bireysel bir maske hazırlayın. Bu protokol için kullanılan tüm tasarımlar sonuçları bölümünde ayrıntılı olarak ele alınmıştır ve AutoCad kullanılabilir '. DWG' biçiminde ek dosya 1.
      Not: all-PDMS aygıt oluşturmak için kanal yükseklik ve genişlik en boy oranı 1:10 kanal çöküşü önlemek aşmaması gerekir. Polimid folyo ve tedavi epoksi reçine daha dayanıklı ve ilke olarak da daha yüksek boy oranları izin vermelidir. Ancak, biz bilerek bu tasarımları ilk bu yüzden oranı, geleneksel PDMS aygıtları olarak örneklenmekte olabilir 1:10 geçmemişse.
   2. En düşük CAD dosyaları emülsiyon film photomasks çevirmek. Nominal 64 k DPI çözünürlüğe yaklaşık 5 µm boyutu aşağı doğru özellikleri izin vermek için kullanın.
      Not: Bu bir ticari hizmeti aracılığıyla yapılabilir. Hizmetleri görüntüleme dosya dönüştürme maske görüntüleme için verimlilik düzeyini artırmak için farklı çizim kuralları tercih edebilirsiniz. Lütfen zahmetli sorun dönüştürme sırasında çekim önlemek için tercih edilen çizim kuralları hakkında ön bilgi almak. Maskeleri siyah arka plan üzerine şeffaf özellikleri ile SU8 fotorezist özellikler yineleme döküm sırasında fonksiyonel PDMS mikro vermeye gofret üzerine desen. Buna karşılık, şeffaf arka plan maskelerine siyah özellikleri PDMS kalıpları x-ışını küçük parça imalatı için uygun hazırlamak için ihtiyaç vardır. Biz erken prototip ve tasarım doğrulama tasarım X-ray fiş içine çeviri önce PDMS cihazları imal etmek için izin vermek için her iki maske polarizasyona sipariş öneririz.
2. SU8 ana imalat
   Not: Bu bir temiz oda içinde yapılması gereken tek işlemdir. Kritik temiz oda ekipmanları yoksa, tam adım hazır desenli SU8 masters teslim MEMS döküm hizmet şirketleri için dış kaynaklı. Veri sayfası öğretim göre işlem SU8. Adımları 1.2.1-1.2.4 genel SU8 ana üretim iş akışı, Tablo 1' de listelenen üç kat x-ışını çip tasarımı için tam parametrelerle özetler. Hizalama olmuştur çok katmanlı SU8 giriş daha önce²⁹yayınlandı.
   1. Pour SU8 yaklaşık 1 mL SU8 Tablo 1 (şekil 1, adım 1) belirtildiği gibi uygun dönüş hızı ve zaman kullanarak istediğiniz kalınlıkta aşağı 3 inç gofret ve spin kat dayanacak. Fotorezist tabakası kalınlığı 65 ° C ve 95 ° C göre önceden her birkaç dakika pişirin. SU8 photomask için yapışmasını önlemek ve resist yapışma için belgili tanımlık substrate (şekil 1, adım 2) artırmak için katılaşmaya öncesi fırında gerçekleştirin.
   2. UV ışık fotorezist catalytically (şekil 1, adım 3) maruz kalma sırasında başlatılan photoreaction tamamlamak için bir post-exposure-pişir 95 ° c ve ardından Tablo 1 belirtildiği gibi ortaya çıkarmak.
   3. Bu adımları her bir sonraki katman için yineleyin. O zaman photomasks sonraki katman maskesi aligner ve Vernier Kaliper hizalama işaretlerini²⁹kullanarak asıl ile hizalayın.
   4. Tüm yıkamaya SU8 karşı koymak kadar isopropanol artık durulama sütlü yağış (şekil 1, adım 4) ortaya koymaktadır propilen glikol metil eter asetat (PGMEA), gofret geliştirerek silsin. Gofret basınçlı azot ile kuru.
      Not: Isopropanol SU8 için zavallı bir çözücü ve onun yağış kalan iyileşmemiş kalır gösterir.
3. PDMS kalıp imalat
   1. Bir parça alüminyum folyo (15 × 15 cm) bir petri (10 cm) içine yerleştirin ve SU8 asıl PDMS kür sonra master kolay kaldırılması için Petri çanak içine alüminyum folyo üzerine yerleştirin.
   2. Silikon temel bir miktarı 25 g, şiddetle bir kavanoz içinde bir spatula ile sonuçlanan ajan (10:1), veya mekanik karıştırıcı kür ile karıştırın. Petri kabına (10 cm) bir 3 inç gofret PDMS 5 mm kalınlığında levha içinde sonuçlanması yaklaşık 25 bin tüketir.
   3. Hava kabarcıkları Hayır kadar kaldırmak için önceden karışık PDMS SU8-master (şekil 1, adım 5) bir yükseklik, 4 mm. Desiccate 5 min için PDMS üzerine dökün, ya da sadece birkaç kabarcıklar PDMS yüzeyde kalır.
   4. 1s için 70 ° c fırında PDMS tedavi. O zaman bir neşter ile tedavi PDMS kesip ve yavaşça SU8 Efendi (şekil 1, adım 6) PDMS kalıp soyma. Peeling sırasında PDMS çatlakları önlemek için asıl sonuna kadar aşağı kesilmiş.
   5. İsteğe bağlı: kesitsel dilimleri tüm SU8-katmanları asıl istenilen kalınlıkta (şekil 1) sahip olduğunuzu doğrulamak için PDMS kalıpları hazırlamak. Erken mikrosıvısal kanal düzeni test tüm PDMS fiş gerçekleştirilebilir.
      Not: Bir yineleme-kalıp PDMS için doğrudan cam alt katman içine PDMS 20 kullanarak O₂ plazma etkinleştirmesi üzerinden erişim bağlantı noktalarının (Adım 3.3) Delme sonra bağlı s, 0.4 mbar O₂, 50 W, 13.56 MHz. Bölüm 1. 2'de belirtilenler., bu gerektirir karşısında maske polarite ve bu nedenle x-ışını çip imalat için anahat gofret.

2. Situ X-ray çip imalat

1. Her iki epoksi reçine öncüleri son etanol konsantrasyonu 40 wt % etanol içinde sulandırmak. Her epoksi reçine habercisi etanol içinde 0, 25 g toplam kütlesinin bir 1 cm² küçük parça için yeterlidir.
   Not: Bu kabarcık-Alerjik karıştırma ve yineleme-kalıp döküm kolaylaştırmak için ve son tedavi epoksi katman kalınlığı en aza indirmek için elde edilen 5 dk epoksi viskozite azaltır. Etanol ile PDMS kür adımı sırasında buharlaşır.
2. Böylece küçük hava emebilir PDMS vakum desiccator 30 dk içinde kalıp Degas epoksi reçine kalıplama adımı sırasında kabarcıklar.
3. Polimid folyo yaklaşık 70 × 70 mm ve çevresinde 75 × 50 mm cam bir düz ve sert zemine bant ile arka almak için bant kullanarak slayt aralığı kestim. Plazma etkinleştirmek folyo ile 50 W, 13.56 MHz, 0.4 mbar O₂ plazma 20 s, sulu bir çözüm 1 vol % (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTS) veya (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) 20 ° C'de 5 dakika içinde tam folyo kaymalı kuluçkaya
4. En iyi kür davranışı sağlamak için her iki seyreltilmiş etanol epoksi öncü çözümler iyice karıştırın. Vakum odasından PDMS kalıpları almak ve düz bir yüzeye koyun. Sonra hızlı bir şekilde dağıtmak bir damlacık bir micropipette (1 cm² . microstructures başına yaklaşık 10 µL) kullanarak kalıp üzerinde her Mikroyapı üzerine karışık reçine (şekil 1, adım 7a).
5. Polimid folyo-slayt sandviç sulu silane (APTS veya GTPS) eriyik--dan almak. Folyo ile basınçlı hava veya azot kuru.
6. Hazırlanan polimid folyo-cam-slayt sandviç yatırılan epoksi reçine (şekil 1, adım 7b) üzerine yerleştirin. Polimid folyo PDMS kalıp karşı bağlı cam slayt bastırın. Bir metal levha cam slayt ve epoksi reçine tedaviler oda sıcaklığında ise 1 h için ilâ 1.4 N/cm² baskı uygulamak için depozito ağırlıkları üzerine yerleştirin.
   Not: İdeal olarak, hiçbir reçine folyo kalıp yapılarda maksimum yükseklik olduğu alanlarda kalır. Bunlar nerede kristalizasyon sonra gerçekleşir kristalizasyon wells karşılık gelir.
   1. İsteğe bağlı: küçük özelliklerin doğru kalıplama önemliyse, PDMS kalıp döküm sırasında bir aliminyum çerçeve takviyeli³¹adım.
7. Polimid folyo ve desenli epoksi cam slayt PDMS kalıp (şekil 1 adım 8) peeling tarafından kaldırın. Plazma etkinleştirmek için 20 50 W, 13.56 MHz, 0.4 mbar O₂ plazma ile desenli epoksi yan s.
8. Plazma odası üzerinden polimid folyo kaldırıldıktan sonra 1 vol % sulu APTS (veya GPTS) çözümünde epoksi desenli folyo 20 ° C'de 5 min için kuluçkaya Benzer şekilde, bir ikinci un desenli polimid folyo tamamlayıcı 1 vol % GPTS (veya APTS) silane aktivasyonu ile hazırlayın. Kuluçka sonra yapılandırılmış ve yapılandırılmamış folyo ile basınçlı hava kuru.
9. Epoksi yan yüzleri yukarı kıvrık folyo engellemek ve maksimal düzlemsellik emin olmak için bir damla su altında yüzey gerilimi bir arabulucu olarak kullanarak düz bir yüzeye yerleştirin. Sonra ikinci aktif polimid folyo üst ve yavaşça bir köşede onları bağ kurmak ve kabarcıklar oluşumunu önlemek için tam tersi için parmağınızla çizgi üzerine yerleştirin.

3. erişim bağlantı noktalarının'sıvı dır

1. 4 mm SU8 asıl kullanmadan bir petri adımları 1.3.1-1.3.3 göre kalın PDMS plaka hazırlayın. Levha bireysel kristalizasyon bölmeleri çipin kapsayan olmadan çip, tüm giriş noktalarına karşılamak için uygun büyüklükte PDMS bloklar halinde kesilmiş.
2. Plazma harekete geçirmek her ikisi de, kütük parçası belgili tanımlık küçük parça ve PDMS 50 W, 13.56 MHz, 0.4 mbar O₂ plazma 20 s. Kimyasal bağlar için sonra her bölümü bir çözümde 1 vol % sulu APTS veya GPTS 20 ° C'de 5 min için kuluçkaya Her bölümü basınçlı hava ile kuru ve PDMS levha folyo çip üzerine basın.
3. Bağ geliştirmek için çip üzerinde düz bir PDMS levha yerleştirin ve ardından temiz cam slayt ve metal bir blok bir plastik folyo ile kapak. Son olarak, yaklaşık 1 h için ilâ 1.4 N/cm² baskı uygulamak için ağırlıklar Kasası.
4. Yumruk erişim 0,75 mm biyopsi ile nerede giriş ve çıkış bağlantı noktaları çip tasarımında işaretlenir ve arkadaki bant ile mühür her pozisyonda delikler. Çip şimdi (olarak detaylı içinde adım 4.2) delik çapi eşleşen bir dış çap ile herhangi bir boru için erişilemez.

4. yüzey işleme

1. 1:20 hazırlamak 9 wt % floropolimer stokta fluoro-solvent son konsantrasyonu 0,45 wt % seyreltme. Hisse senedi çözümleri ve dilutions 4 ° C'de karanlık bir buzdolabında saklayın
2. 1:20 yük floropolimer seyreltme 1 mL radarı-kilit enjektör içine. Bir 27G × 5/8" eklemek iğne şırınga ve iğne için PTFE boru.
3. Tüp x-ışını fiş prize bağlayın ve tüm kanallar doldurulur kadar 4.1 adımda hazırlanan floropolimer çalışma çözüm enjekte.
4. Belgili tanımlık küçük parça düz tarafı ile 190 ° C sıcak bir tabak içine ince film kaplama floropolimer yatırmak tüm solvent buharlaşır 5 min için yerleştirin.
   Not: yeni bir geometri kullanırken, kanalları ile floropolimer bu kaplama işlemi sırasında tıkanmış eğer bakın. Eğer öyleyse, daha fazla hisse senedi çözüm oranında seyreltin.

5. protein hazırlık

1. Thaumatin liyofilize tartmak ve 40 mg mL^-1son protein konsantrasyonu elde etmek için uygun birim Tablo 2 ' de listelenen bir tampon çözelti içinde çözülür.
2. Glukoz izomeraz üretici protokole göre Tablo 2 ' de listelenen arabellek karşı diyaliz.
3. Protein thioredoxin Schubert et. al. tarafından daha önce açıklandığı şekilde hazırlayın ³⁰.
4. Photometrically ProtParam³²yazılımı tarafından hesaplanan Tablo 2, özetlenen tükenme katsayıları kullanarak son protein konsantrasyonları doğrulayın.
5. Tüm çözümler ultrasaf su kullanarak hazırlamak ve onları 0.2 µm filtre ile filtre.
6. Protein çözümleri 16100 x g de 15 dakika 20 ° C'de santrifüj kapasitesi ve süpernatant kristalizasyon deneyler için al.

6. protein kristalizasyon X-ray yongası

1. Proteinler mikrosıvısal çip içinde kristalize için protein çözüm ve precipitant çözüm eşit miktarda karıştırın. Protein konsantrasyonu, arabellek oluşturma ve precipitant kompozisyon Tablo 2' de özetlenmiştir. Toplam hacmi yaklaşık 20 µL bir mikrosıvısal çip doldurmak için hazırlayın.
2. Hemen karıştırma sonra çözüm enjekte çip bir şırınga ile giriş portuna bir 27G × 5/8" için iğne ve PTFE boru 0,75 mm dış çap (ayrıntılı adım 4.2) ile birleştiğinde.
   Not: Dolgu yordam seri düzeni için en kolay çıkış bağlantı noktasından giriş bağlantı noktası üzerinden kristalizasyon çözüm enjekte önce flüorlu petrol yükleyerek yapılır flüorlu yağ ile önceki bir astar çipin gerektirir. Tüm yükleme adımlarını uygulanan şırınga basınç ve karşılık gelen akış hızı kontrol etmek için bir mikroskop kullanarak takip edilmelidir."
3. Çip dolu sonra çipi giriş portuna flüorlu yağ enjekte edilerek bireysel kristalizasyon bölmeleri ayırın. Çip çip, tüm giriş ve çıkış bağlantı noktalarını bloke ederek kapatın. Bu bir ataş ekleyerek yapılabilir.
   Not: çünkü kristalizasyon bölmeleri protein/precipitant çözüm tarafından doldurulur, flüorlu petrol sadece çip, giriş kanalı kristalizasyon bölmeleri çözümde etkilemeden doldurur.
4. Buharı difüzyon kristalizasyon Kinetik taklit etmek için mühürlü çip ortam sıcaklığı ve damlacık polimid folyo yoluyla su buharlaşma tarafından daraltmanız kristalizasyon bölmeye izin vermek için normal atmosfer yerleştirin.
5. Kristal sonra yolu ile mikroskop oluşum görülmektedir veya DLS ölçümleri (7. adım) uygun precipitant çözüm daha fazla kadar x-ışını kırınım kristalizasyon kuyulardan buharlaşma durdurmak için içine tam mikrosıvısal çip transfer deney yapılır.

7. dinamik ışık saçılma ölçüleri kristalizasyon Wells yongası

Not: Were kılınmak DLS ölçümleri 100 lazer çıkış gücü ile mW, bir dalga boyu 660 nm ve dağınık ışık bir saçılma 142 ° açıyla algılandı. Çünkü tüm incelenen örnek çözümler sulu suyun Kırılma indisi (n = 1.33) tüm hesaplamalarda kullanılan.

1. Mikrosıvısal çip yer SBS formatı plaka tutucu 8.1. adımda anlatılan bağdaştırıcısı kullanarak DLS enstrümanın. Adaptörü cihaza takın.
2. Dikkatle lazer odak mikrosıvısal çip bölmesi içinde motorlu x, y, z-sahne kullanarak ayarlayın. Mikrosıvısal çip çok ince olduğundan, küçük artış adımları uygulayarak z-düzeyini ayarlayın.
   Not: Doğru ayarı yüksek bir kesme noktası ve DLS ölçü elde edilen otokorelasyon işlevinin düzgün bir kuyruk tarafından onaylanır. Kalibrasyon dosyası mikrosıvısal çip birkaç bölmeleri otomatik DLS ölçümlerde zaman içinde izin de her bireysel kristalizasyon konumuna uygun şekilde oluşturulabilir.
3. Her DLS ölçüm 293 k 30 s ve tekrar gerçekleştirmek ölçüm kristalizasyon deneme sonuna kadar her 5 dakikada.
   Not: İlk çekirdekleşme DLS ölçümleri RADIUS dağıtım zamanla tarafından takip edilebilir ve başarılı kristal oluşumu paralel olarak DLS plaka okuyucu dahili mikroskop tarafından takip edilebilir.

8. kırınım veri toplama

1. Bağdaştırıcılar için beamline goniometers
   1. Konumlandırmak ve x-ışını cips crystallographic veri toplama sırasında döndürmek için bağdaştırıcılar için plaka gonyometre yazdırın.
   2. Bağdaştırıcılar için üretici tarafından önerilen varsayılan parametre ayarları kullanarak bir hobi-grade 3D printerlere harcama maddeler üzerinde temel gonyometre imal.
      Not: Bağdaştırıcıların bir 3D-CAD-sistemi kullanarak tasarlanmış ve içinde ekli bağdaştırıcıları koordinat dosyaları '. STL'-ek dosya biçiminde.
   3. Çift taraflı bant kullanarak bağdaştırıcıyı için x-ışını fiş düzelt.
2. situ x-ışını kristalografisi
   1. 296 K. kullanım x-ışınları 12,8 bir enerji ile 10 × 5 µm (Gauss profil FWHM) kiriş boyutunu kullanarak kırınım verisi toplamak keV ve akı 2.2 · 10¹¹ fotonlar · s^-1 zayıflatılmış kiriş ve Pilatus 6 M hybrid piksel dedektörü kullanarak kayıt kırınım desenleri.
      Not: mikrosıvısal cihazların thaumatin, glukoz izomeraz veya thioredoxin kristalleri PETRA III sinkrotron EMBL beamline P14, in situ x-ışını crystallographic deneyler için kullanılır. Kullanılabilir ışın odak boyutu ve akı diğer x-ışını kaynakları farklı olabilir. Maruz protein kristalleri, kırınım desen her kristal, pozlama başına salınım açısı aralığı ve çekim hızı kaydedilen sayısını sayısını Tablo 3' te özetlenmiştir.
   2. İşlemi kullanarak tek tek program XDS³³iki ardışık kırınım deseni ayarlar. Bash betiği "Eki'nde bulunan xds.sh" kullanın.
   3. HKL dosyaları her veri kümesi için bütün kristalleri oluşturmak ve yazılım XSCALE³³kullanarak ölçeklendirme. Bash komut "xscale.sh" ek olarak XSCALE için bir giriş dosyası oluşturmak için kullanın.
      Not: Yalnızca veri korelasyon katsayıları isomorphism yüksek derecede gösterir, %90 büyük var kristallerinin ölçekli olmalıdır. Muhafazakar ölçüt ‹I/σ (I) › (> 2) en yüksek çözünürlük kabuk belirlemek için kullanılmalıdır. Moleküler değiştirme programı MOLREP^{34 35} CCP4 Süiti kullanarak daha fazla modeli 3B koordinatları, Protein veri Bankası ( Tablo 3' te gösterilen PDB) kullanarak oluşturma aşamaları elde etmek için kullanılabilir.
   4. İsotopically Refmac5^35,36 kullanarak tüm yapılar rafine ve COOT³⁷ son modelinde görsel muayene için kullanın.
      Not: Çözücü molekülleri arıtma işlemi sırasında otomatik olarak eklenmesi gerektiğini ve kimyasal olarak makul pozisyonlar onaylamak için kontrol edilmesi gerekir. Tüm modeller Ramachandran outliers tanımlamak için kontrol gerekir.

9. veri değerlendirme

1. Radyasyon hasarı
   1. Owen ve ark³⁸tarafından açıklanan bir yöntemle zamanla kırınım güç çürüme analiz. Bunun için tüm dizin oluşturulmuş yansımaları veri kümesinin bir başvuru değeri olarak kullanılacak her değerlendirilmiş kırınım (2 ardışık kırınım deseni), I/σ(I) (XDS³³tarafından sağlanan) toplam toplamını hesaplamak. Gelen supplement bash komut "ISigma.sh" kullanın.
   2. Her veri kümesi ilk veri kümesi ortalama kırınım gücüne kırınım gücünü normalleştirmek.
   3. Rmeas değerleri zaman içindeki değişimi XDS³³ (bash komut "Rmeas.sh" gelen supplement) elde edilen Correct.LP dosyalarından Rmeas değerleri alarak analiz.
2. Kristal yönlendirme
   1. Kristal kafes yönelimleri açısından laboratuvar koordinat sistemi dağıtımı hakkında bilgi edinmek için Euler açıları belirler. Çıktı dosyası XPARM³⁹ yazılım Matlab kullanarak verilen XDS yönlendirme matris Euler açıları hesaplamak. Bash komut "rotation_matrix.sh" her kristal XPARM dosyasından rotasyon matrisi ayıklamak için kullanın. Matlab işlevi rotro2eu.m (ek dosyası) kullanılarak Euler açıları hesaplamak için giriş Matlab olarak çıktı dosyası kullanın.
      Not: Zarrine-Afşar ve ark⁴⁰tarafından hesaplama detaylı bir açıklama yayınladı.
   2. Elde edilen Euler açılar radyan cinsinden dereceye çevirmek. Elde edilen Euler açıları için tüm üç dönüş uçak (xy, xz ve zy) 10 ° sınıflarda grup ve onları yanında istimal bilgisayar yazılımı Origin9 arsa.

Epoksi bir x-ışını çip imalat için mükemmel dolgu malzemesidir. Ucuz, basit ve güçlü işlem için özel araçlar (şekil 1) gerek kalmadan. Epoksi viskozite 40 wt % etanol ile sulandrarak azaltarak tanımlanmış X-ray Windows'da kaynaklanan aşırı reçine kristalizasyon iyi yukarıda kaldırılması kolaylaştırdı. Daha yüksek etanol dilutions tedavi reçine hataları sonuçlandı. X-ışını çip kesit analiz ederek, biz çok 2 × 7.5 µm (Şekil 2) kullanılan polimid folyo nominal kalınlık yakın olan toplam pencere kalınlığı yaklaşık 19 µm kalınlığında, olmak her iki kararlı

Kristalizasyon denemeler⁴¹daha önce açıklandığı gibi bir kılcal damar Kapak mekanizması kullanmanın birkaç boy nanoliter reaksiyon bölmeleri her, izole. Bu yükleme 'mağaza-o-Oluştur' teknik kanal ölü biriminden örnek kaybı önler ve kolayca el ile pompaları veya diğer ekipmanların sıvı çalıştırma⁴²için kullanma gereksinimini ortadan kaldırarak yapılabilir. Çip flüorlu yağı ile sulu örnek yüklemeden önce astarlanmalıdır. Yüzey gerilimi astar petrol ve arayüz arasında basınç farkı sonuçlarında sulu örnek arasında yağ-su arayüz. Bu Laplace basınç hem eğrilik yarıçapı ve yüzey gerilimi arabiriminin bağlıdır. Enerjisini en aza indirmek için arabirim eğriliği sürekli ses seviyesinde ana onun yarıçaplarını maksimize için eşdeğeri olan yüzeyi en aza indirmek gerekir. Düşük eğriliği arayüzü geniş bir kanalda alt Laplace basınç sonra dar kanal segment yüksek eğriliği arabiriminde var. Bu nedenle, örnek tak tercihen girer ve geniş akıyor dar kapiller Vana kısıtlamaları akan yerine kanal bypass. Son olarak, örnek tak flüorlu petrol örnek wells bağımsız damlacıkları ayırmak için izler.

Sağlam ve güvenilir yükleme akış hızı en fazla 1 mL/saat, bir seri ve paralel iyi düzenleme (şekil 3) ile sağlanır. 'Seri' düzende de giriş ve kılcal Vana boğumların sırayla bir yan yol kanal³¹bağlı. Buna ek olarak, 'paralel' düzeni, iki ayrı ana kanal tüm iyi alıcılar bağlanmak veya kılcal sadece⁴³vanalar. Her iki düzenleme kavramları daha önce yararlı bir yönü de protein kristalizasyon^43,44ekran kompozisyon denetimine formülasyonu ile kombine edilmiştir. Seri tasarım sadece iki sıvı bağlantı noktası, bir giriş ve bir çıkış yok. Daha az sıvı portu bulunmaktadır ve bu nedenle, oluşturmak ve işletmek kolaydır. 4 sıvı bağlantı noktası, kuyuları bağlayan ana kanal için 2 ve 2 hava veya aşırı yağ kaçış izin kılcal vanaları kadar bağlama için paralel düzeni vardır. Yükleme bu nedenle her iki ana kanal taraftan devam edebilirsiniz. Genel olarak bu düzene sahip düşük akış direnci kuyular onun kısa yan yol nedeniyle eşit sayıda için. Bu dolayısıyla daha iyi kuyuları yüksek sayıda yukarı ölçekli cihazlar için uygundur. Ayrıca, örnek kuyu vardır daha yakın birlikte odaklı, hangi sunuyor avantajları Imaging otomatik için.

Ya iki yükseklik veya üç-yükseklik tasarım olarak oluşturulduysa tam bir örnek de yükleme için her iki düzenler, gözlendi. İki-yükseklik tasarımında, iyi örnek ve yan yol kanalları eşit yüksekliği vardır. Üç-yükseklik tasarım üçüncü maskesi gerektirir, ek SU8 katmanı ve daha fazla örnek wells önceki daha yüksek haline emin olmak için bir hizalama adım kanalları bypass. Bu yükseklik-diferansiyel örnek sıvıyla boğumların, akışı durur ilke valving aynı kılcal damar yoluyla kuyunun içine girme teşvik etmektedir. Burada, daha yüksek iyi tavan öyle ki Vana boğumların diğer akışını engellemek ve yan yol aktarma kuyu tamamen doldurduktan sonra ilerleyen Menisküs ve akış yan yol yön boyunca Laplace basıncı sadece tercih edilir bir alt karşılık gelir. Ancak, başarılı yükleme uygun kapiller valving da kanal genişlikleri buna göre ayarlayarak elde edilebilir gibi yan yol yüksek olduğu wells kesinlikle gerektirmez. Yine de, bizim deneyim, daha yüksek wells gerçekleştirilen önemli ölçüde daha sağlam ve kusur ücretsiz yükleme, en çok on kez daha yüksek debi tüm üç-yükseklik tasarımlarında iki yükseklik eşdeğerlerine karşılaştırıldığında gözlendi. Bu etkiyi daha paralel düzeninde öldüğü ilan edildi.

Buharı difüzyon kristalizasyon Kinetik taklit etmek için polimid folyo sonlu geçirgenliği su buharlaşma zaman içinde kontrol etmek için istismar edildi. Deneysel buharlaşma oranlarını bırakma yüzey alanı ve iyi yükseklik (şekil 4 c) eşitleyerek damlacık birim zaman içindeki değişimi izleyerek sayısal. X-ışını çip kristalizasyon kuyulardan buharlaşma saat⁴⁵üzerinde azaltılmış buharlaşma hızı sonuçlarında çözünen konsantrasyonu artan rastlayan açılan bir daralma yüzey alanı olarak doğrusal bir biçimde devam etmez. İlk buharlaşma yaklaşık doğrusal bir oranı 0.5 nL s^-1 seri mizanpaj geometrisini Wells hakkında takip ettim.

Kristalizasyon Kinetik daha iyi anlamak için dl ölçümleri mikrosıvısal çip kristalizasyon wells gerçekleştirilmiştir. İlk DLS ölçülerini cam slayda gümrüklü PDMS çip ışık saçılma deneme için daha iyi optik özellikleri sağlamak için kullanılmıştır. Bu çip X-ray çip aynı iyi boyutlarda vardı. PDMS X-ray çip⁴⁵polimid Windows'da polimid daha yüksek bir su buharı geçirgenliği vardır. Beri akı doğrusal mesafe ile ölçekler, polimid pencereli buharlaşma yörüngesini de uygun kalınlıkta bir karşılık gelen PDMS penceresiyle eşleştirilir.

RADIUS dağıtım DLS ölçümleri önce ilk kristal parçacıkları gözlenen ilk çekirdekleşme algılamaya izin gösteren (şekil 4A-B), zaman içerisinde değişen DLS sonuçları göster. Bu bilgiler nucleate ve dışarıdan buharlaşma hızı ayarlayarak iyi başına tek kristalleri büyümek için kullanılabilir ve bu nedenle supersaturation çekirdekleşme⁴⁶erken bir aşamada düzeyleri.

X-ışını çip SBS uyumlu plaka gonyometre PETRA III (şekil 5A), sinkrotron P14 EMBL beamline adlı bir 3D yazdırılan bağdaştırıcısında tespit edildi. Alternatif olarak, daha küçük bir 3D yazdırılan çerçeve mount x-ışını fiş standart beamline goniometers²¹için kullanılabilir. Thaumatin kristalleri 10-20 µm (şekil 5B) büyüklüğe sahip ve 2.0 çözünürlüğe kadar diffract Å (şekil 5C). Beklendiği gibi x-ışını kökenli katkıları, iki ince polimid folyo Windows'un x-ışını çip üzerinden 11 Å polimid polimer saçılma halkalar için sınırlıdır (2θ ~ 5°) ve 33 Å (2θ ~ 1.7°) için x-ışını dalga boyu 0,97 Å. Bu iki yüzük veri işleme rahatsız etmeyin. Toplam veri kümesi 83 thaumatin kristalleri ile toplanan ve 10 kırınım desenleri kalma her 1 ° döndürme sırasında her çerçeve ile kaydedildi. Thaumatin veri kümesi istatistiklerinin yanı sıra veri işleme ve arıtma parametreleri listelenir ve aynı zamanda toplanan in situ listelenen Tablo 3 ve olan iki diğer veri kümeleri glukoz izomeraz ve thioredoxin ile karşılaştırıldığında Tablo 4.

Zaman içinde normalleştirilmiş kırınım güç yoğunluğu çürüme beş alt veri kümeleri içine thaumatin veri kümesi kadar bölerek araştırılmıştır (iki kırınım desen kullanılmıştır alt tam veri kümelerini korumak için). Şekil 6Bgösterildiği gibi kırınım güç ilk alt veri kümesi sonra azalmaya başladı ve dördüncü alt kümesinde % 50'in altında yapıldı. Sonuç olarak, Rmeas değerleri alt veri kümeleri veri koleksiyon sırasında x-ışını radyasyon zarar gösteren zamanla da artmaktadır. Serbest radikallerin X-ray pozlama sırasında hızlı bir şekilde oluşturulan aynı tepki yerde komşu kristalleri aşağılamak öngörmekteyiz. Örneğin, ikincil x-ışını zarara, nerede kristalleri polimid sandviç²¹önemli ölçüde daha büyük bir alan üzerinde dağıtılmış bir ilgili deneysel yaklaşım, daha az belirgin oldu. Genel X-ray hasarı en aza indirmek için belirli bir kristal kırınım desenlerini yalnızca az sayıda oda sıcaklığında toplanmalıdır. Ayrıca, tek tek protein kristal mikrosıvısal çip kartı yuvası maruz. Yine de, işlenmiş veri kümelerini kullanarak rafine tüm yapı modelleri çok iyi stereokimya ve uygun istatistik (Tablo 4) gösterir. Buna ek olarak, tüm son elektron yoğunluğu haritalar çok kaliteli edildi.

X-ışını şeffaf cips önceki kristalografisi yaklaşımlar, yönünü ve kristalleri düzenlenmesi kasten kristal yönelimleri⁴⁰ rasgele bir dağılım elde etmek için manipüle edilebilir zorunda veya kristal hareketlerle elde edildi içinde sıvı katman²¹. Bu protokol için açıklanan X-ray şeffaf mikrosıvısal çip kristal yönde değerlendirmek için laboratuvar koordinat sistemi ile ilgili tüm maruz kristalleri birim hücre yönünü tespit edilmiştir. Glukoz izomeraz kristalleri (şekil 7B) için geniş ölçekli bir dağıtım elde ederken bipyramidal thaumatin kristalleri için (şekil 7A), hafif bir tercih gözlendi. Nanometre ölçeğinde önemli pürüzlülük çoğu malzeme sergi gerekçeli. Bu nedenle, kristaller kendiliğinden önemli ölçüde daha az önyargılı yönelimleri yüzey üzerinde kendiliğinden nucleate. Böyle bir küçük kristal çekirdek yüzey normal göre reorienting olmadan uygun boyuta büyümeye devam ederken bir yönlendirme içine kilitlenmiş olabilir. Aslında, yüzey aracılı kristal çekirdekleşme uzun süreç içinde kristal zarar vermeden ekli bir kristal yüzey kapalı döngü için crystallographers için bir baş belası olmuştur. Burada, doğrudan böyle kristal kırınım veri toplama için kullanabilir. Ancak, sistem belirli sınırlamalar var thioredoxin xy-, xz - ve yz-uçaklar (şekil 7C) bazı yönler için güçlü bir tercih ortaya. Gösterdi örnekler yönlendirme dağıtım sadece büyüme ortamı aynı zamanda kristal şekli bağlı değildir göstermektedir. Thioredoxin kristalleri olan tetragonal bipyramidal thaumatin kristalleri veya Ortorombik glukoz izomeraz kristalleri bu davranışı gösterme ise tercih edilen yönde büyümeye şekiller uzamış. Ancak, her durumda, proteinler bile tercih edilen yönelimleri kristal rotasyonlar erişilebilir aralığı içinde karşılıklı alan ve bu nedenle veri takımları yeterince iyi kapsama alanı için sonuçlandı ile araştırıldı. Böylece, hiçbir ek tedbir kristalleri Xray maruz seçerken alınması gerekiyordu.

Resim 1 : Mikrosıvısal X-ray çip üretim düzeninin. (1) SU-8 bir silikon substrat ve istenen katman kalınlığı elde etmek için kaplı spin üzerinde kalmaması. (2) fotorezist bir maske ile UV-radyasyona maruz kalmaktadır. (3) yıkamaya fotorezist sonra uzağa arka arkaya PGMEA ve isopropanol ile yıkayarak, geliştirilmiştir (4) kaynaklanan bir SU-8 master daha fazla döküm için adımlar. (5) PDMS üzerine, dökülür ve (6) sonra kür PDMS kalıp SU-8 ustadan soyulmuş. (7a) epoksi yapıştırıcı PDMS kalıp kalmaması ve (7b) bir aktif polimid folyo kimyasal epoksi reçine bağlı. (8) kür sonra polimid yaprak desenli ince epoksi film ile PDMS kalıp soyulmuş. (9) son adımında, cihazın bir kapalı düşük X-ray arka plan mikrosıvısal çip verim için ikinci bir polimid folyo ile kapaklı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Fotoğraf (solda) ve kesitleri son fiş mikroskobu görüntüleri. Bir temsilci kanal segment (orta) ve iki ayrı Chips (sağda) kristalizasyon iyi gösterilir. Oklar ölçülen mesafe gösterir. Tüm boyutlardır µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Şemalar kristalleşme de tasarımlar [A] paralel veya [B] seri düzeni, üstten ve yandan, µm içinde belirtilen boyutlarda haliyle. Tipik kanal heights vardı: 50 µm yan yol, 50-60 µm kristalizasyon iyi, 5-10 µm kapiller Vana birimler, yaklaşık 2,5 iyi karşılık gelen, nL (paralel düzen) ve 8 nL (seri düzeni). İyi davranış yükleme temsilcisi Gıda boyaları kullanarak gösterilmiştir. Gıda boyası depolama kuyu enjekte önce çip ile 12 wt % 1 H, 1 H, 2 H, 2 H-Perfloro-1-octanol FC-43, astarlanmalıdır. Beyaz oklar, akış yönünü gösterir. Genel bakış görüntüler tüm wells yüklü yüklü aygıtlar gösterinin ücretsiz, gösteren sağlam örnek yükleme defekt. Seri düzeni wells ile iki-yükseklik tasarım olarak tasvir edilir ve eşit yükseklik sahip yan yol paralel düzeni ile kristalizasyon kuyu yan yol, daha yüksek bir üç-yükseklik tasarım olarak gösterilmektedir. Tipik akış oranları yaklaşık 150 µL/h yükleme sırasında vardı, ama kusur ücretsiz yükleme için en fazla 1 mL/saat üç yükseklik-tasarım flowrates gözlendi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Situ dinamik ışık saçılma de zamanla kristalizasyon. [A] mikroskobik görüntü kristalizasyon iyi dizi. Zaman içinde su buharı buharlaşır gibi saklı damlacık sürekli küçülür. İlk thaumatin microcrystals 4 h [B] sorumlu hidrodinamik RADIUS dağıtım [A] fotoğrafı aynı kristalizasyon işlemi sırasında DLS tarafından ölçülen thaumatin parçacıkların sonra görülebilir. Yaklaşık 1-2 h. [C] temsilcisi birimin arkasında ilk çekirdekleşme olaylar görülebilir gösteren ikinci bir RADIUS kesir oluşumunu azaltmak Evaporatif su kaybı nedeniyle iki başvuru damlacık birimlerin zaman içinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : situ kırınım veri toplama. [A] bireysel mikrosıvısal çip bir 3D yazdırılan bağdaştırıcısında (mavi) plaka gonyometre tarafından monte edilir. [B] Thaumatin kristaller mikrosıvısal X-ray pozlama sırasında satır içi mikroskop beamline P14, tarafından yansıma gibi chip. [C] thaumatin kristal kırınım 2.0 çözünürlüğe kaydedildi Å, negligibly düşük bir arka plan ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6 : Veri değerlendirme mikrosıvısal çip thaumatin kristaller kırınım veri kaydedilen oda sıcaklığında. [A] elektron yoğunluğu 1-2 yalnızca veri kümesi (1,5 σ, mavi kontür) çerçeve kullanarak rafine thaumatin modeli. [B] thaumatin kristalleri çürüme yoğunluk fonksiyonu x-ışını doz olarak. [C] Rmeas değeri üzerinden x-ışını doz evrimi. Kutu çizer [B] ve [C] Dörttebirlikler (üst değer %75, medyan değerleri % 50, alt değerleri % 25 ve ortalama) ve bıyık ile % 95 güven aralıkları kırınım yoğunluğu çürüme ve Rmeas tüm maruz kristallerinin temsil ile (n = 83). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7 : Birim hücre yönelimleri mikrosıvısal çip folyo laboratuvar koordinat sistemine göre dağılımı. [A] bipyramidal thaumatin kristalleri yönelimleri yaklaşık 180 ° xy-(mavi), xz-uçak (yeşil) ve yz-(red) uçağı kapsayan geniş bir dağılım gösterdi. [B] [C] thioredoxin güçlü bir tercih bazı yönler gösterdi iken glukoz izomeraz da geniş çaplı bir dağıtım gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tablo 1: SU8 süreç örneği üç kat paralel X-ray çip tasarımı için. Bu katman sıralama X-ray çip imalat için PDMS kalıp döküm için izin verir. Doğrudan bir PDMS prototipleme sırasında kalıp için bunun yerine 1^st kat ile bitirmek 3^rd başlatmak için ana imalat sırasında sipariş katman ters.

Tablo 2: Kristalizasyon koşulları ve yok olma katsayısı ve pdb kodu da dahil olmak üzere hazırlanmış, protein kristalleri grupları alanı.

Tablo 3: x-ışını kırınım veri koleksiyon parametresi.

Veri toplama istatistikleribir	thaumatin (Çerçeve 1-20)	glukoz izomeraz (çerçeve 1-100)	thioredoxin (1-10 en-boy)
Beamline		P14
Dalga boyu [Å]		0.96863
Alan grubu	P41212	I222	P42212
Birim hücre parametreleri: bir b, c [Å] =	58.62, 151.48	93.91, 99.60, 103.04	58.45, 151.59
Kristalleri sayısı	101	41	34
Toplam salınım [°]	10	10	10
Çözünürlük [Å]	30.1.1989 (1.95-1.89)	30.1.1975 (1,80-1.75)	30.3.2000 (3,20-3,00)
Sıcaklık [K]	296	296	296
R p.i.m.b	7.5 (25,5)	8,8 (28.0)	9.1 (33.2)
Ölçülen yansımalar	1553200	690000	1111196
Benzersiz yansımalar	21850	48942	44449
Ortalama I/σ(I)	6,07 (1,78)	5.85 (1.66)	4.08 (1.47)
MN(I) yarı-set korelasyon CC(1/2)	96.2 (72.2)	95,8 (68.2)	97,9 (75.3)
Bütünlüğü [%]	99.8 (100.0)	100.0 (99.9)	99.9 (100.0)
Artıklık	71.1	14,1	25
Arıtma istatistikleri
Çözünürlük aralığı [Å]	1/30/1989	1/30/1975	3/30/2000
R / Rücretsiz [%]	18.8/23.9	18.1/20.5	18.9/23.1
Protein atomlar	1550	3045	1129
Su molekülleri	51	111	164
Ligand molekülleri	20	0	0
RMS sapma
Bond-uzunluğu [Å]	0,02	0.026	0,01
Bond açısı [°]	2.04	2.22	1.43
B faktör [Å2]
Protein	22,6	20	50
Su	25,1	27,1	29,7
Ligand	20,4
Ramachandran arsa analizi
En çok tercih edilen bölgeler [%]	97.67	95.32	96.13
İzin verilen bölgeler [%]	2.44	4,16	3.64
Cömertçe bölgeleri [%] izin	0,49	0,52	0,23
Re: yüksek çözünürlük kabuğunda değerlerdir parantez içinde.
b: (), nerede ben (hkl) yansımaları hkl ortalama yoğunluğu olduğunu, Σhkl toplamı tüm yansımaları ve Σi toplamı üzerinde yansıma hkl ölçümleri.

Tablo 4: Veri koleksiyon istatistik veri kümeleri thaumatin, glukoz izomeraz ve thioredoxin.

Supplementry-dosya 1: chip_geometry.dwg. CAD dosyasında kullanılan çip geometrileri. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry-dosya 2: goniometer_adapter.stl. STL dosya x-ışını çip gonyometre bağdaştırıcısı belirtme. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry dosyası 3: xds.sh. Bash betiği takozlar XDS tarafından kırınım veri işlemek için giriş dosyaları oluşturmak için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry-dosya 4: xscale.sh. Bash betiği alt kümeleri kırınım verileri birleştirebilir ve HKL dosyası oluşturmak için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry-dosya 5: ISigma.sh. Bash betiği bireysel alt kümeleri ISigma değerleri ayıklamak için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry-dosya 6: Rmeas.sh. Bash betiği bireysel alt kümeleri Rmeas değerleri ayıklamak için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Supplementry-dosya 7: rotation_matrix.sh. Bash betiği rotasyon matrisi Euler açıları hesaplamak Matlab giriş dosyasını hazırlamak için. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Biz mikrosıvısal cihazlar in situ x-ışını kırınımı için epoksi reçine malzeme ve polimid folyo pencere malzemesi olarak doldurma olarak biçimlenme tarafından imal. Bizim yordamı imalat sürecinin çeşitli adımlar önceki x-ışını çip tasarımları^16,21en iyi duruma getirilmiş. Biz pencere kalınlığı azaltmak ve böylece aynı zamanda fabrikasyon hareket hızı ise saçılma arka plan olarak daha az işlem adımları gereklidir. situ kristalizasyon açıklanan protokolünü kullanarak önemli faydaları vardır. Oda sıcaklığında kırınım veri toplama sağlar ve dolayısıyla protein yapısı aktarımında tanıtmaktan riski içeren bazı durumlarda cryo koruma ihtiyacı dışarıda tutar. Kristalleri transferi yerli çevreleri önlenebilir çünkü Ayrıca, kristaller fiziksel stres tabi değildir. Bu işlem ile kristaller onların en yüksek kalitesini korumak ve herhangi bir tedavi olmaz.

Deneyim, protokol içinde en önemli adımlar kristalizasyon işlem kontrol etrafında döner. X-ışını uygun kristalleri uygun boyutları ile elde etmek için parametreler ampirik olarak tanımlanması gerekir ve doğrudan buharı difüzyon deneylerden esir olamaz. Protein ve precipitant özdeş konsantrasyonları kullanılması her zaman kristalleri farklı fiş veya zaman zaman aynı çip içinde farklı Wells neden değil. Bu kristal çekirdekleşme ve büyüme etkileyen tüm faktörler dikkatle, anne içki kompozisyon veya kristalizasyon Kinetik (yoluyla buharlaşma yörünge) gibi incelenmesi gereken gösterir. Daha büyük kristaller daha yüksek çözünürlük için diffract gibi uygun büyük kristaller ideal olarak yetiştirilmektedir. Kristal çekirdekleşme ve büyüme sürecinin DLS ölçümleri ile takip edilebilir. ~ 50 µm içinde lazer odak ayarlama ince kristalizasyon bölmeleri çipin zor olabilir ve dikkatli manuel hizalama gerektirebilir. Öyle ki birden çok kuyu otomatik satın alma programları takip edilebilir 100 µm derin kuyu, lazer otomatik hizalama uygulanabilir ve güvenilir, kullanmaktı.

Sadece düşük bir arka plan dayalı polimid X-ray yongaları üretmek ve biz üç modeli proteinler için yapıları çözerek bu cihazlar oyununa x-ışını kırınım veri toplama uygunluğu göstermek. Daha önce elde çözünürlük, önemli ölçüde daha büyük protein kristalleri ve konvansiyonel röntgen veri toplama ile karşılaştırıldığında yongasında elde edilen en iyi çözünürlük farklıydı. Bu çeşitli faktörler nedeniyle olabilir ve daha fazla kristalizasyon koşulu optimizasyonu daha fazla kırınım geliştirmek. Situ kırınım veri uygulanan kristal ile 30 µm daha küçük boyutları 1.8 Å çözünürlüğe kadar toplamak mümkün. Thaumatin Difraksiyon veri ayrıntılı analizini radyasyon hasarı hakkında kavrayışlar sağlanan. Radikaller için ve komşu kristalleri Difüzyon oluşabilir gibi Genişlet radyasyon hasarı sınırlamak için yalnızca bir tek kristal kompartımanda mikrosıvısal aygıt başına maruz. Veri toplama hızını artırmak için bu gelecekte otomatik.

Kristal Morfoloji nedeniyle, bazı durumlarda tercih edilen bir yönünü ortaya çıkabilir. Bu örneğin thioredoxin veri kümesi kristalleri kuvvetle tercih edilen bir yönüne göre çip windows vardı nerede olduğu. Hatta burada, bir tam kırınım veri toplayabilirsiniz. Eğer kristaller çip tercih edilen bir yönde sergi ve karşılık gelen alan grubundaki de düşük bir simetri varsa, özellikle sonra veri kümesi completeness toplama sırasında yeterli kırınım desenleri baston olmak öyle ki takip edilmelidir toplanan.

Işık kullanarak bağlı bir pompa-sonda yaklaşım reaksiyon zaman zaman çözüldü çalışmalar bu fişleri kullanarak doğrudan mümkündür. COC kullanılabilir ya polimid folyo ışık geçirgenliği pompa lazer için aydınlatılmamıştır ve alternatif olarak, optik polimid temizlemek gerekiyor. Geçerli mikrosıvısal geometrileri kristalleri yetiştirilen sonra deneyler karıştırma substrat için izin vermez. Ancak, biz de böyle her iki kez çözüldü x-ışını kırınımı için tasarımlar karıştırma gibi için yaklaşımlar¹⁹saçılma uygun olarak açıklanan X-ray çip imalat Protokolü bekliyoruz.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu eser PIF-2015-46 PIER tohum fonu tarafından desteklenen, 05K16GUA ve 05K12GU3 ve Deutsche 'Hamburg merkezi için Ultrafast düşsel-yapısı, dinamiği ve kontrol maddenin atomik ölçekli' mükemmellik kümesi BMBF verir Forschungsgemeinschaft (DFG). Yazarlar için serbest elektron lazer bilim merkezi ile bağlı iş odaklı program fonları aracılığıyla Helmholtz Derneği tarafından finanse edildi. Sinkrotron MX veriler P14 işletilen beamline PETRA III depolama yüzük (DESY, Hamburg, Almanya) EMBL Hamburg tarafından toplanmıştır.