Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לפברק ופועלים microfluidic התקנים עבור איסוף נתונים של קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. בנוסף, הוא מתאר כיצד לפקח התגבשות חלבונים על ידי פיזור אור דינאמי וקיבלתי כיצד לעבד ולנתח נתונים עקיפה.

פרוטוקול זה מתאר התקני microfluidic שמפברק נמוכה על רקע רנטגן ממוטב עבור מד זווית מבוסס קריסטלוגרפיה טורי יעד קבוע. המכשירים הם בדוגמת משאיפת דבק אפוקסי באמצעות הדפס אבן רכים ומתאימים לניסויים בחיי עיר קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. הבארות לדוגמה הם מכסה משני הצדדים עם פוליאימיד פולימריים רדיד אלומיניום חלונות המאפשרים איסוף נתונים עקיפה עם רקע רנטגן נמוכה. שיטה זו פבריקציה נוספת היא לא תובעני. הסופרמן וזולה. לאחר לחיזוי של רקיק מאסטר סו-8, ניתן להשלים כל פבריקציה נוספת מחוץ חדר נקי בסביבת מעבדה למחקר טיפוסי. פרוטוקול עיצוב, ייצור השבב לנצל valving נימי כדי לפצל לתגובה מימית לתוך טיפות מוגדר nanoliter בגודל microfluidically. מנגנון הטעינה זה מונע אובדן מדגם מאמצעי-ערוץ המלח, ניתן בקלות לבצע באופן ידני ללא שימוש משאבות או ציוד אחר עבור הופעה נוזלים. אנו מתארים nanoliter בגודל כיצד מבודדים, טיפות חלבון פתרון יכול להיות בפיקוח בחיי עיר על ידי אור דינאמי פיזור כדי לשלוט חלבון קריסטל התגרענות וצמיחה. לאחר קריסטלים מתאימים הם מגדלים, ניתן מלאה עקיפה של קרני רנטגן datasets לאסוף באמצעות מד זווית מבוסס בחיי עיר קבוע היעד טורי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. הפרוטוקול מספק קבצי script מותאמים אישית כדי לעבד עקיפה datasets באמצעות חבילת כלי תוכנה כדי לפתור ולמקד את מבנה גבישי החלבון. גישה זו מונע החפצים המושרה ואולי במהלך שימור-הקפאה או קריסטל ידנית טיפול בניסויים קריסטלוגרפיה קונבנציונלי. אנחנו מציגים ומשווים שלושה מבנים חלבון זה נפתרו באמצעות קריסטלים קטנים עם מידות של 10-20 מיקרומטר גדל בשבב. על ידי התגבשות diffracting בחיי עיר, הטיפול ועל מכניים ומכאן הפרעות של גבישים שביר הוא ממוזער. בפרוטוקול פרטים כיצד ליצור מותאם אישית רנטגן microfluidic שקוף שבב מתאים בחיי עיר קריסטלוגרפיה טורי. כמו כמעט כל קריסטל ניתן להשתמש עבור אוסף נתוני דיפרקציה, הצ'יפס הזה, microfluidic הם שיטת משלוח קריסטל יעילה מאוד.

לדעת את מבנה תלת-ממדי של חלבון חיוני להבין את הפונקציונליות שלו. מבנים ברזולוציה ליד-אטומית כה מתקבלים בדרך כלל על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן. טכניקה זו חושפת חלבון קריסטלים לקרינת רנטגן, הדפוסים עקיפה וכתוצאה מכך הם מכן נותחו עבור מכשור לקביעת קשיות ומבנה ועידון. ב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן מסורתי, dataset עקיפה מוחלטת מתועד של גביש יחיד, אידיאלי גדולים, הקפאה בטמפרטורה. גבישים כאלה, לעומת זאת, בעיקר לא טריוויאלי לגדול הינם לזהות תנאי שימור-הקפאה מתאים יכול להיות מאתגר כשלעצמו, עלול לגרום לעיתים גם סטיות בין מבנה החלבון יליד⁵.

ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים (FEL) ו beamlines סינכרוטרון אפשרו לפתור מבנים מקריסטלים קטנים יותר, כמו beamlines מיקרו-התמקדות חדשה, רנטגן מוגבר קרן זוהר, והפך גלאי רנטגן משופר זמין^6,7. בדרך כלל, גבישים קטנים הם יותר קל לגדול יותר גדול לערוק קריסטלים חינם^8,9. עם זאת, קריסטלים קטנים סובלים ניזקי קרינה רנטגן הרבה יותר מהר מאשר גבישים גדולים. זאת משום בהשוואה גביש גדול, חייב להיות מוקרן רנטגן מינון גבוה יותר לאמצעי אחסון קריסטל קטנים כדי מכמותה לרזולוציה דומות. לכן, אפילו קריוגני הגנה מספיקה לעתים קרובות לא להקליט ערכת נתונים עקיפה מוחלטת מן microcrystal יחיד.

כדי להתגבר על המשוכה הזו, קריסטלוגרפיה טורי הפכה לשיטת הבחירה כדי לאסוף ולמזג את דפוסי עקיפה של רבים microcrystals מונחה באופן אקראי לקבל dataset מלאה. קרינה קריסטל המושרה נזק למינימלי בעקבות הפצת המינון רנטגן הכולל המשמשת לפתרון מבנה החלבון על פני מספר רב של גבישים^5,10. ב ' מכמותה לפני להרוס ' FEL ניסוי, כל קריסטל משמש רק עבור חשיפה אחת באמצעות פולסים רנטגן femto-שנייה. Beamlines מיקרו-פוקוס על מקורות synchrotron הדור השלישי בתורו יכול לבצע קריסטלוגרפיה סדרתי עם כמה אלפיות השנייה קצרה רנטגן חשיפות^11,12,13,14. בלי תנודה קריסטל או סיבוב בעת איסוף הנתונים, עם זאת, רק השתקפויות בראג חלקית ניתן להקליט ומכאן עשרות אלפים או תבניות עקיפה יותר נדרשים בדרך כלל עבור קביעת מבנה ה¹⁵. עד היום מערכת מגוונת של שיטות משלוח הדגימה פותחה עבור קריסטלוגרפיה טורי, כפי שנסקרה לאחרונה^{14,16,17,18,19}. בין אלה, מספר קבוע-יעד המבוסס על משלוח הדגימה אסטרטגיות בהצלחה משולב עם קריסטל סיבוב במהלך חשיפות רנטגן כך באופן משמעותי פחות תבניות עקיפה יכול לספק באותה מידה datasets מלאה תוך כדי גם צורכים פחות לדוגמה בהשוואה ל קריסטלוגרפיה קלאסית טורי ניסויים איפה תמונות סטילס הקליט^{7,16,20,21,22,23 , 24}.

אנו מציגים פרוטוקול כדי לבדות microfluidic מכשירים עם רקע רנטגן נמוכה. המכשירים הם בדוגמת משאיפת דבק אפוקסי 5-מין באמצעות הדפס אבן רכים ומתאימים ל ניסויים קרני רנטגן מקומיים בטמפרטורת החדר הנהנים שילוב של הכנת הדוגמא ישירות הסידור רנטגן, כמו במקרה של מחקרים זמן לפתור אחרי ערבוב-induced קינטיקה^18,19. ערוצי Microfluidic הם מכסה משני הצדדים בנייר פוליאימיד פולימריים, וכתוצאה מכך רנטגן windows עם עובי משולב של-16 מיקרומטר לאפשר לדימות רקע נמוך רנטגן. כל החומרים בשימוש מספקים טוב התנגדות הממס. שיטה זו פבריקציה נוספת היא פשוט וזול וזהובה. לאחר לחיזוי של רקיק מאסטר סו-8, ניתן להשלים כל פבריקציה נוספת מחוץ חדר נקי באווירה מעבדת מחקר טיפוסי.

בדוגמה ליישום, נתאר אסימונים עבור מד זווית מבוסס קריסטלוגרפיה טורי יעד קבוע. ראשית, נדונים השיקולים העיצוב ועל פבריקציה נוספת לשימוש נימי valving כדי microfluidically לפצל לתגובה מימית למספר טיפות nanoliter בגודל שנבחר. מנגנון הטעינה זה מונע אובדן מדגם מאמצעי-ערוץ המלח, פיצול ניתן בקלות לבצע באופן ידני ללא שימוש משאבות או ציוד אחר עבור הופעה נוזלים. טיפות מבודד nanoliter בגודל כזה של חלבון פתרון נמצאים תחת פיקוח בחיי עיר באמצעות פיזור אור דינאמי (DLS) כדי לשלוט חלבון קריסטל התגרענות וצמיחה. זה בעבר הוכח כי ניתן לבצע מדידות DLS במכשירים microfluidic המורכב של מבנה polydimethylsiloxane (PDMS) מודבקת זכוכית שקופית^25,26. כי השכבה פוליאימיד יש שידור גבוהה עבור אורכי גל ארוך יותר 550 ננומטר, הגישה ניתן להרחיב את מידות רנטגן שבבי שקוף, בעת שימוש של אורך גל לייזר מתאים^27,28. בהתבסס על תוצאות DLS, התגרענות הראשוני יכול להיות שנצפו, אידוי droplet נוספות ניתן לעצור כדי להשיג קריסטלים פחות אך יותר חלבון.

לאחר קריסטלים מספיק מבוגר, מלאה עקיפה של קרני רנטגן datasets ואז ניתן לאסוף באמצעות מד זווית מבוסס בחיי עיר קבוע היעד טורי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן בטמפרטורת החדר. עקיפה datasets מעובדים באמצעות חבילת כלי תוכנה וקבצי script מותאמים אישית כדי לפתור את מבנה גבישי החלבון. טכניקה זו מונע חפצים לעיתים קרובות המושרה במהלך שימוש בניסויים קריסטלוגרפיה קונבנציונאלי שימור-הקפאה.

נשווה שלושה מבנים חלבון המטרה נפתרו באמצעות על 10-20 מיקרומטר קטן גבישים שגידלו בשבב לרזולוציה Å טוב יותר אז 2. על ידי התגבשות diffracting בחיי עיר, הטיפול ועל מכניים ומכאן הפרעות של גבישים שביר הוא ממוזער. פרוטוקול זה ניתן להחיל עבור גבישים חלבון אשר מכמותה ברזולוציה גבוהה, כמו גם ברזולוציה נמוכה (1.7 Å Å 3.0). כמו כמעט כל קריסטל יכול לשמש עקיפה, מדגם קטן מבוזבזים, מה שהופך את שיטת משלוח קריסטל יעילה מאוד.

פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט על איך להכין צ'יפס microfluidic שקוף רנטגן בחיי עיר חלבון התגבשות ואת עקיפה איסוף נתונים. ההליך תוכנן בקפידה כדי להפיק תועלת microfluidic דיוק ללא צורך ציוד מתוחכם במעבדה. כמו כן, ניתן לבצע איסוף נתונים-הפרעות לקרן החלקיקים סינכרוטרון ללא צורך מד זווית מיוחדים או מכשיר אדים כדי להקל על לשחזר את התוצאות של מומחים שאינם. הטכניקה שהוצגו יכול להיות מיושם עבור אלפית טורי קריסטלוגרפיה איסוף נתונים בטמפרטורת החדר, תוך שמירה על הנזק קרינה מינימלית וללא היכרות מתח הקריסטלים לאחר הצמיחה על ידי טיפול הקפאה-הגנה או קריסטל. לכן, השיטה המתוארת מתאימה לכל פרויקט התגבשות של חלבון.

1. שבב עיצוב פבריקציה מאסטר

1. עיצוב מסכת
   1. חלוקה לרמות גיאומטריות הערוץ הרצוי באמצעות תוכנית מתאימה של ציור CAD. עבור כל שכבה photoresist, להכין מסיכת בודדים. כל העיצובים בשימוש פרוטוקול זה מתוארים בפירוט במקטע תוצאות והם זמינים כמו AutoCad '. ה-DWG' תבנית קובץ משלים 1.
      הערה: לבניית כל-PDMS התקנים, יחס גובה-רוחב הערוץ לא יעלה על 1:10 כדי למנוע התמוטטות ערוץ. רדיד פוליאימיד והן שרף אפוקסי נרפא הן יציבות ולאפשר באופן עקרוני צריך גם יחסי גודל גבוה יותר. עם זאת, אנחנו בכוונה לא יעלה על 10:1 יחס, אז זה ראשי תיבות עיצובים יכול להיות אבטיפוס כהתקני PDMS המסורתי.
   2. לתרגם את קבצי CAD לתוך אמולסיה הסרט photomasks. השתמש ברזולוציה k DPI 64 הנומינלי כדי לאפשר תכונות מדויק עד כ-5 µm גודל.
      הערה: ניתן לבצע זאת באמצעות שירות מסחרי. שירותי הדמיה, מעדיפות מוסכמות ציור שונות כדי לייעל את המרת קובץ עבור מסכת הדמיה. אנא בררו על המועדפת הציור מוסכמות מראש כדי למנוע צרות מפרך הירי במהלך ההמרה. מסכות עם תכונות שקוף על רקע שחור תבנית SU8 photoresist תכונות כשהפחד להניב microchannels PDMS תפקודית במהלך לכייר עותק משוכפל. בתורו, תכונות שחור על רקע שקוף מסכות נדרשים להכין בתבניות PDMS מתאים רנטגן שבב פבריקציה נוספת. אנו ממליצים על הזמנת שני בין קצוות של מסיכה כדי לאפשר אימות שטנץ ועיצוב המוקדמים ליצור התקנים PDMS לפני לתרגם את העיצוב רנטגן צ'יפס.
2. ייצור אב SU8
   הערה: זהו תהליך היחידה שצריכה להתבצע חדר נקי. אם ציוד קריטי חדר נקי אינה זמינה, הצעד המלא ניתן תתבצע במיקור חוץ לחברות MEMS יציקה שירות המספקים מוכן בדוגמת SU8 מאסטרס. תהליך SU8 על פי ההוראה גליון נתונים. צעדים 1.2.1 כדי 1.2.4 סיכום כללי SU8 ייצור בסיס זרימת העבודה, עם הפרמטרים מלאה על תכנון השבב רנטגן תלת שכבתי המפורטים בטבלה1. מבוא SU8 רב-שכבתית יישור כבר פורסם בעבר²⁹.
   1. לשפוך על 1 מ ל SU8 להתנגד על גבי השכבה וופל ולסחוט 3 אינץ את SU8 עד העובי הרצוי באמצעות זמן ומהירות סיבוב המתאים כמצוין בטבלה 1 (איור 1, שלב 1). מראש אופים את photoresist על פי עובי שכבת ב 65 ° C ו 95 ° C במשך כמה דקות כל אחד. לבצע את לאפות מראש שבמהלכו SU8 כדי למנוע את זה דבק photomask וכדי לשפר להתנגד הדבקה על המצע (איור 1, שלב 2).
   2. לחשוף את photoresist לאור-UV כמצוין בטבלה 1 ואחריו פוסט-exposure-אופים ב 95 ° C catalytically להשלים את photoreaction שמאותחלת במהלך החשיפה (איור 1, שלב 3).
   3. חזור על שלבים אלה עבור כל שכבה עוקבות. ואז ישר את photomasks של השכבה לאחר מכן עם המאסטר באמצעות מסיכת aligner ורניה caliper יישור סימני²⁹.
   4. לשטוף את כל SU8 שלא נחשפו להתנגד על ידי פיתוח כשהפחד בכלוריד מתיל אתר אצטט (PGMEA), עד אלכוהול איזופרופיל שטיפה כבר לא חושף משקעים חלבי (איור 1, שלב 4). יבש את וופל עם חנקן בלחץ.
      הערה: אלכוהול איזופרופיל הוא הפשר עניים SU8 ומציין משקעים שלה נשאר משומרים שיורית.
3. ייצור תבנית PDMS
   1. מניחים חתיכת נייר אלומיניום (15 × 15 ס מ) לתוך צלחת פטרי (10 ס מ) ומניחים את המאסטר SU8 על גבי האלומיניום לתוך הפטרי הסרה קלה של המאסטר לאחר ריפוי PDMS.
   2. מערבבים בסיס סיליקון עם אשפרה הסוכן (10:1), וכתוצאה מכך סכום כולל של 25 גרם, נמרצות עם מרית בצנצנת או מערבל מכני. רקיק 3 אינץ בצלחת פטרי (10 ס מ) צורכת כ 25 גר' PDMS את התוצאה לוח בעובי 5 מ מ.
   3. יוצקים טרום מעורב PDMS אל SU8-המאסטר (איור 1, שלב 5) עד לגובה של 4 מ מ. Desiccate PDMS במשך 5 דקות כדי להסיר בועות אוויר עד לא, או רק כמה בועות להשאר על המשטח PDMS.
   4. לרפא את PDMS בתנור ב 70 ° C עבור 1 h. ואז לגזור את PDMS נרפא עם איזמל, מקלפים בעדינות את התבנית PDMS של המאסטר SU8 (איור 1, לשלב 6). חותכים כל הדרך אל המאסטר כדי למנוע סדקים PDMS במהלך פילינג.
   5. אופציונלי: להכין פרוסות חתך הרוחב של התבניות PDMS כדי לוודא כי כל SU8-השכבות בתבנית הבסיס יש את עוביים הרצוי (איור 1). מוקדם microfluidic ערוץ פריסה בדיקות ניתן לבצע גם כל הז'יטונים PDMS.
      הערה: PDMS מיוצר משוכפל יכול להיות מודבקת ישירות מצע זכוכית לאחר ניקוב גישה יציאות (שלב 3.3) לתוך PDMS באמצעות הפעלת הפלזמה של₂ O באמצעות 20 s, 0.4 mbar O₂, 50 W, 13.56 מגה-הרץ. כפי שמצוין בסעיף 1.2., זה דורש מול מסכת קוטביות, ומכאן וופל לרמות עבור ייצור השבב רנטגן.

2. בחיי עיר -רנטגן שבב פבריקציה נוספת

1. לדלל שני מבשרי שרף אפוקסי אתנול כדי ריכוז האתנול הסופי של 40 wt %. מסה הכולל של 0.25 g של כל קודמן שרף אפוקסי אתנול מספיקה עבור שבב אחד של² 1 ס מ.
   הערה: זה מפחית צמיגות של אפוקסי 5 דקות וכתוצאה מכך כדי לפשט בועה ללא ערבוב, עותק משוכפל-עובש הליהוק וכדי לצמצם את עובי השכבה האחרונה אפוקסי נרפא. האתנול מתאדה דרך PDMS במהלך השלב ריפוי.
2. דגה כייר PDMS ב desiccator ואקום במשך 30 דקות, כך שהיא מסוגלת לספוג את בועות אוויר קטנות של שרף אפוקסי במהלך השלב צורניים.
3. חותכים את רדיד האלומיניום פוליאימיד כ 70 × 70 מ מ, טווח זה 75 × 50 מ מ זכוכית שקופיות באמצעות הקלטת כדי להשיג משטח שטוח ונוקשה עם הקלטת בצדו האחורי. פלזמה להפעיל את רדיד האלומיניום עם 50 W, 13.56 MHz, פלזמה₂ mbar O 0.4 20 s, ואז דגירה רדיד-השקופית מלאה בתמיסה המימית vol 1% (3-aminopropyl) trimethoxysilane (דירות) או (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GPTS) עבור 5 דקות ב 20 º C.
4. ביסודיות מערבבים שני פתרונות קודמן אפוקסי אתנול מדולל כדי להבטיח התנהגות ריפוי אופטימלי. לאחזר PDMS-עובש מן החדר ואקום ולמקם אותם על גבי משטח שטוח. ואז לדלג במהירות droplet של שרף מעורבים על גבי כל מיקרו על העובש באמצעות של micropipette (כ-10 µL לכל 1 ס מ² של מזערים) (איור 1, שלב 7 א).
5. לאחזר את הכריך רדיד שקופית פוליאימיד מהפתרון silane מימית (' מעל כולם ' או ' GTPS '). יבש את רדיד האלומיניום עם אוויר בלחץ או חנקן.
6. מקם את הכריך רדיד-זכוכית-שקופית פוליאימיד מוכן אל שרף אפוקסי הפקיד (איור 1, שלב 7 ב). לחץ בחוזקה את השקופית זכוכית מחובר מסכל פוליאימיד נגד כייר PDMS. הנח גיליון מתכת על גבי זכוכית שקופית ולאחר מכן הפיקדון משקולות כדי ללחוץ עד 1.4 N/cm² עבור h 1, ואילו תרופות שרף אפוקסי בטמפרטורת החדר.
   הערה: באופן אידיאלי, שרף לא נשאר על מסכל באזורים שבו מבני העובש יש גובה מקסימלי. אלה תואמות הבארות התגבשות שם התגבשויות מתקיים לאחר מכן.
   1. אופציונלי: אם דפוס מדויק של תכונות קטן הוא קריטי, אפשר לחזק את התבנית PDMS עם מסגרת אלומיניום במהלך המכייר שלב³¹.
7. להסיר את השקופית זכוכית ועם פוליאימיד מסכל את אפוקסי בדוגמת על ידי פילינג זה מן כייר PDMS (איור 1 שלב 8). פלזמה להפעיל את הצד אפוקסי בדוגמת עם 50 W, 13.56 MHz, פלזמה₂ mbar O 0.4 20 s.
8. לאחר הסרת מסכל פוליאימיד מן החדר פלזמה, דגירה מסכל בדוגמת אפוקסי בפתרון vol 1% מעל כולם מימית (או GPTS) למשך 5 דקות ב 20 º C. באופן דומה, להכין תשובה מכשילה פוליאימיד בדוגמת האו ם השניה עם משלימים 1 vol % GPTS (או מעל כולם) silane הפעלת. לאחר הדגירה, יבש רדיד מובנים ולא מובנים עם אוויר בלחץ.
9. מקם את אפוקסי הצד עם הפנים למעלה על משטח שטוח, באמצעות את מתח הפנים של טיפת מים מתחת כמתווך כדי למנוע החלקה של מסכל ולהבטיח שטיחות מקסימלי. ואז למקם את רדיד האלומיניום פוליאימיד מופעל השני למעלה, בעדינות פס עם האצבע מפינה אחת כדי ההפך כדי לגרום להן להתחבר וכדי למנוע היווצרות בועות.

3. גישה יציאות עבור משלוח נוזל

1. להכין 4 מ מ עובי לוחות PDMS בצלחת פטרי לפי השלבים 1.3.1 כדי 1.3.3 ללא שימוש SU8-המאסטר. לחתוך המתים לגושי PDMS בגודל המתאים כדי לכסות את כל היציאות כניסת השבב, ללא כיסוי של תאים בודדים התגבשות של השבב.
2. פלזמה להפעיל את שניהם, את השבב, PDMS את חסום ב 50 W, 13.56 MHz, פלזמה₂ mbar O 0.4 20 s. עבור קשרים כימיים, ואז דגירה כל חלק ב כרך 1% מעל כולם או GPTS תמיסה מימית למשך 5 דקות ב 20 º C. כל חלק עם נשוף אוויר יבש והקש המתים PDMS על גבי השבב בנייר כסף.
3. כדי לשפר את מליטה, למקם את השבב על לוח PDMS שטוח, לכסות אותו ברדיד ניילון, ואחריו שקופית זכוכית נקי, גוש מתכת. לבסוף, להפקיד משקולות כדי ללחוץ עד 1.4 N/cm² לשעה בערך.
4. ניקוב חורים גישה עם ביופסיה 0.75 מ מ פונץ '-לכל תפקיד שבו יציאות כניסת ולשקע מסומנים עיצוב שבב ויסגור את האחורי עם הקלטת. השבב נגיש כעת עבור כל צינורות בקוטר חיצוני התאמת קוטר החור (כמפורט בשלב 4.2).

4. שטח

1. להכין 1:20 דילול של 9% wt fluoropolymer מניות של פטור-ממס כדי ריכוז סופי של 0.45 wt %. לאחסן דילולים והפתרונות מלאי במקרר בחושך ב 4 º C.
2. לטעון על 1:20 דילול fluoropolymer לתוך מזרק 1 מ"ל סכינים סטריליים-lock. צירוף של 27G × 5/8" מחט המזרק, ולאחר מכן אבובים PTFE לבין המחט.
3. לאורך צינור להתחבר לשקע שבב רנטגן ולהזריק את הפתרון עובד fluoropolymer מוכן בשלב 4.1 עד כל הערוצים מלאים.
4. מקם את השבב עם הצד השטוח למטה על פלטה חמה 190 מעלות במשך 5 דקות עד להתאדות כל הממס להפקיד את fluoropolymer לתוך ציפוי סרט דק.
   הערה: בעת שימוש של הגיאומטריה החדשה, בדוק אם ערוצי היו סתומות עם fluoropolymer במהלך תהליך ציפוי זה. אם כך, בהמשך לדלל את הפתרון מניות.

5. חלבון הכנה

1. שוקל lyophilized thaumatin, להמיס אותו בתמיסת בופר המפורטים בטבלה מס ' 2 לאמצעי האחסון המתאימה להשגת ריכוז החלבון הסופי של 40 מ ג מ ל^-1.
2. Dialyze גלוקוז איזומראז נגד המאגר המפורטים בטבלה מס ' 2 לפי הפרוטוקול היצרן.
3. להכין את thioredoxin חלבון כפי שתואר לעיל מאת שוברט. et. al. ³⁰.
4. ודא ריכוז החלבון הסופי photometrically באמצעות מקדמי הכחדה מסוכמות בטבלה 2, המחושב על-ידי התוכנה ProtParam³².
5. להכין את כל הפתרונות באמצעות הנדסה גנטית מים ולסנן אותם עם מסנן 0.2 µm.
6. Centrifuge הפתרונות חלבון ב 20 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ב g 16100 x, ולקחת את תגובת שיקוע לניסויים התגבשות.

6. חלבון התגבשות בשבב רנטגן

1. כדי לגבש חלבונים באסימוני microfluidic, מערבבים כמויות שוות של חלבון פתרון פתרון precipitant. ריכוז חלבון, מאגר הרכב והרכב precipitant מסוכמים בטבלה מס ' 2. להכין את הנפח הכולל של µL בערך 20 למלא שבב microfluidic.
2. מיד לאחר ערבוב, להזריק את הפתרון לתוך הנמל כניסת של השבב באמצעות מזרק מצמידים 27G × 5/8" מחט ו PTFE אבובים עם 0.75 מ"מ קוטר חיצוני (מפורט בשלב 4.2).
   הערה: תהליך מילוי עבור הפריסה טורי מחייבת לקרקע מוקדמת של השבב בשמן fluorinated, אשר קל נעשה על-ידי טעינת הנפט fluorinated מיציאת ה-outlet לפני הזרקת הפתרון התגבשות דרך היציאה מפרץ צר. כל השלבים טעינה צריך לפקח באמצעות מיקרוסקופ כדי לשלוט על הלחץ מזרק יישומית ועל קצב הזרימה המתאימה."
3. לאחר השבב הוא מלא, להפריד התאים התגבשות בודדים על-ידי הזרקת fluorinated שמן לתוך יציאת כניסת של השבב. חותם את השבב על-ידי חסימת כל יציאות כניסת ו- outlet של השבב. זה יכול להיעשות על-ידי הוספת המהדק.
   הערה: כי התאים התגבשות מתמלאות על-ידי פתרון חלבון/precipitant, שמן fluorinated רק ממלא ערוץ כניסה של השבב, מבלי להשפיע על הפתרון בתאים התגבשות.
4. לחקות אדי דיפוזיה התגבשות קינטיקה, למקם את השבב אטומה בטמפרטורת סביבה ואווירה רגיל כדי לאפשר את ה-droplet בתא התגבשות להתכווץ על ידי האידוי של מים דרך מסכל פוליאימיד.
5. לאחר קריסטל היווצרות נצפית דרך מיקרוסקופ או DLS מדידות (שלב 7), להעביר את השבב microfluidic להשלים הפתרון המתאים precipitant, לעצור עוד אידוי מן הבארות התגבשות עד עקיפה קרני רנטגן הניסוי מבוצעת.

7. אור פיזור מדידות בבארות התגבשות בשבב דינאמי

הערה: DLS מדידות בוצעו עם לייזר פלט כוח של 100 מגה-וואט, אורך גל של 660 ננומטר והאור פזורים זוהה בזווית של פיזור של 142 מעלות. כי כל הפתרונות מדגם ובדוקים היו מימית מקדם שבירה של מים (n = 1.33) היה בשימוש כל החישובים.

1. המקום microfluidic םרות בפורמט SBS לוחית של המכשיר DLS באמצעות המתאם שמתואר בשלב 8.1. הכנס את המתאם המכשיר.
2. בזהירות לכוונן את המוקד לייזר לתוך תא של השבב microfluidic באמצעות את ממונע x, y, z-שלב. כי השבב microfluidic הוא מאוד דק, להתאים את z-רמת על-ידי החלת צעדים תוספת קטנה.
   הערה: התאמה נכונה אושר על ידי חיתוך גבוה וזנב חלקה של הפונקציה המתקבלת autocorrelation המדידה DLS. ניתן ליצור קובץ כיול כדי להתאים את המיקום של כל התגבשות בודדים היטב השבב microfluidic, המאפשר מדידות אוטומטיות DLS בתאים מספר לאורך זמן.
3. לבצע כל אחת מהמידות DLS-293 K עבור 30 s וחזור על המדידה כל 5 דקות עד תום הניסוי התגבשות.
   הערה: התגרענות הראשונית יכולה להיות מלווה את רדיוס ההפצה של המדידות DLS לאורך זמן, היווצרות הגביש מוצלח אפשר במקביל לאחריו המיקרוסקופ המובנית של DLS צלחת הקורא.

8. איסוף נתונים של עקיפה

1. מתאמי עבור הפרעות לקרן החלקיקים goniometers
   1. הדפס את המתאמים מד זווית צלחת למיקום ושינוי לסובב את האסימונים רנטגן בעת איסוף הנתונים לחקר הגבישים.
   2. לפברק את המתאמים מד זווית הבסיס מדפסת תלת-ממד תחביב-כיתה באמצעות הגדרות ברירת המחדל של הפרמטר כפי שהומלץ על ידי היצרן.
      הערה: המתאמים תוכננו באמצעות 3D CAD-מערכת ואת הקבצים קואורדינטות המתאמים מחוברים ב '. STL'-קובץ בפורמט תוספת.
   3. לתקן את האסימונים רנטגן למתאם באמצעות הקלטת צדדית כפולה.
2. בחיי עיר קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן
   1. לאסוף נתונים עקיפה באמצעות קרן גודל של 10 × 5 מיקרומטר (FWHM לפי עקומת גאוס פרופיל)-296 ק שימוש רנטגן עם אנרגיה של 12.8 קוו וזרימה של 2.2 · 10¹¹ פוטונים · s^-1 קרן הקלוש, תבניות עקיפה הרשומה באמצעות גלאי פיקסל פילאטוס היברידית 6 מ'.
      הערה: התקנים Microfluidic המכיל thaumatin, קריסטלים איזומראז או thioredoxin גלוקוז משמשים לניסויים בחיי עיר רנטגן לחקר הגבישים-EMBL הפרעות לקרן החלקיקים P14 של סינכרוטרון פטרה השלישי. גודל המוקד קרן זמין, שטף עשויים להיות שונים על מקורות אחרים רנטגן. המספר של חלבון חשוף קריסטלים, מספר תבניות עקיפה הקליט כל קריסטל, הטווח זווית תנודה לכל חשיפה, חשיפה הזמן מסוכמים בטבלה3.
   2. תהליך ערכות של שני תבנית עקיפה רצופים בנפרד באמצעות התוכנית XDS³³. השתמש בתסריט bash "xds.sh" שנמצאו תוספת.
   3. ליצור HKL קבצים עבור כל ערכת נתונים מתוך כל קריסטלים ולשנות אותם באמצעות התוכנה XSCALE³³. השתמש בתסריט bash "xscale.sh" בתוספת ליצירת קובץ הקלט עבור XSCALE.
      הערה: רק datasets של גבישים בעלי מקדמי המתאם הגדולים מ- 90%, אשר מצביע על רמה גבוהה של איזומורפיזם, יותאם. › ‹I/σ (I) קריטריון השמרני (> 2) צריך לשמש כדי לקבוע את הקליפה ברזולוציה הגבוהה ביותר. החלפת מולקולרית באמצעות התוכנית MOLREP³⁴ מ- סוויטת CCP4³⁵ יכול לשמש כדי להשיג את השלבים עבור דגם נוסף הבניין על ידי בעזרת הקואורדינטות תלת-ממד של ה חלבון בנק מידע (-PDB) שמוצג בטבלה3.
   4. ללטש מבנים כל isotopically באמצעות^35,Refmac5³⁶ ומשתמשים הנרגן³⁷ בדיקה ויזואלית של הדגם הסופי.
      הערה: מולקולות הממס אמור להתווסף באופן אוטומטי במהלך תהליך עידון ויש צורך לבדוק כדי לאשר את עמדות סבירה מבחינה כימית. כל הדגמים יש לבדוק כדי לזהות Ramachandran ליניאריים.

9. נתוני הערכה

1. נזק הקרינה
   1. לנתח את הדעיכה של עקיפה כוח לאורך זמן באמצעות שיטה מתוארת על ידי אואן ואח³⁸. בשביל זה, לחשב את הסכום הכולל של I/σ(I) (שסופק על-ידי XDS³³) של כל אינדקס השתקפויות של כל dataset עקיפה הערכה (2 תבנית עקיפה ברציפות), כדי להשתמש כערך הפניה. השתמש בתסריט bash "ISigma.sh" של תוספת.
   2. לנרמל את הכוח עקיפה של כל הנתונים (dataset) בחזקת רשע עקיפה ערכת הנתונים הראשון.
   3. לנתח את השינוי של ערכי Rmeas לאורך זמן על ידי לקיחת הערכים Rmeas מקבצי ה- Correct.LP המתקבל XDS³³ (bash סקריפט "Rmeas.sh" של תוספת).
2. התמצאות קריסטל
   1. לקבוע את זוויות אוילר כדי לקבל מידע על חלוקת כיווני סריג הגביש בהקשר למערכת הקואורדינטות מעבדה. לחשב את זוויות אוילר מתוך מטריצת התמצאות XDS נתון בקובץ הפלט XPARM³⁹ שימוש בתוכנת Matlab. להשתמש בתסריט bash "rotation_matrix.sh" כדי לחלץ את מטריצת סיבוב כל קריסטל מהקובץ XPARM. השתמש בקובץ הפלט כקלט ב- Matlab כדי לחשב את זוויות אוילר באמצעות rotro2eu.m פונקציה של Matlab (קובץ משלים).
      הערה: תיאור מפורט של החישוב שפורסם ב Zarrine-יצחק מויאל ואח⁴⁰.
   2. להמיר את זוויות אוילר שהושג מרדיאנים למעלות. לקבץ את זוויות אוילר שהושג עבור כל סיבוב שלושה מטוסים (xy, xz zy) בכיתות של 10 מעלות, מניחים אותם באמצעות התוכנה Origin9.

אפוקסי הוא חומר מילוי מעולה עבור ייצור השבב רנטגן. זה זול, פשוט וחזק לתהליך ללא צורך בכלים מיוחדים (איור 1). הפחתת צמיגות אפוקסי על ידי לדלל אותה עם 40 wt % אתנול הקלה ההסרה של שרף עודף מעל הבאר התגבשות, וכתוצאה מכך windows רנטגן מוגדרים. גבוה יותר דילולים אתנול הביא פגמים שרף נרפא. על ידי ניתוח רנטגן שבב חתכים, קבענו את עובי חלון הכולל של שני הצדדים להיות עבה, בערך 19 מיקרומטר אשר קרובה מאוד בעובי נומינלי של foils פוליאימיד בשימוש של 2 × 7.5 מיקרומטר (איור 2)

התגבשות הניסויים היו מבודדים לתוך מספר nanoliter בגודל תגובת תאי כל אחת, באמצעות מנגנון שסתום נימי כפי שתואר לעיל⁴¹. טכניקה זו 'חנות-אז-צור' טעינת מונע אובדן מדגם מאמצעי-ערוץ המלח, ניתן בקלות לבצע באופן ידני, ומבטל את הצורך להשתמש משאבות או ציוד אחר עבור הופעה נוזלים⁴². השבב יעבוד עם fluorinated שמן לפני שיטען הדוגמה מימית. מתח פנים-הממשק שמן מים בין שמן לקרקע ותוצאות הדגימה מימית הבדל לחץ ברחבי הממשק. הלחץ הזה לפלס תלוי את רדיוס עקמומיות והן את מתח הפנים של הממשק. כדי למזער את האנרגיה שלו, הממשק נובע כי חובה למזער את פני השטח שלו, אשר מקבילה כדי למקסם את רדיוס הראשי של עקמומיות בהיקף קבוע. ממשק עקמומיות נמוך בתוך ערוץ רחב יש לפלס בלחץ נמוך יותר ואז ממשק עקמומיות גבוהה לפי קטע ערוץ צר. לכן, התקע מדגם מעדיפים מזין, הזורם דרך הרחבים לעקוף ערוץ במקום לזרום דרך ההגבלות שסתום נימי צרים. בסופו של דבר, התקע מדגם ואחריו fluorinated שמן כדי להפריד בין הבארות מדגם לתוך טיפות עצמאית.

טעינת עמיד ואמין הושגה עם תזרים שיעור של עד 1 מ"ל/h, סדרתי והן סידור טוב מקבילים (איור 3). בפריסה 'טורי', ובכן constrictions שסתום כניסת ו נימי ברצף מחוברים דרך ערוץ עוקף³¹. לעומת זאת, בפריסה 'מקביל', בשני ערוצים עיקריים נפרדים לחבר כל אינלטס טוב או נים שסתומים רק⁴³. שניהם משמשים סידור בעבר כבר בשילוב עם ניסוח שליטה להרכב מסך, אשר הוא היבט שימושי בחלבון התגבשות^43,44. העיצוב טורי יש רק שתי יציאות נוזלים, כניסת אחד ו שקע אחד. פחות יציאות נוזלי בו בגלל זה, הוא פשוט ולתפעול. הפריסה מקבילים יש ארבע יציאות נוזלים, 2 עבור הערוץ הראשי מתחבר הבארות ו-2 להתחברות השסתומים נימי לתת אוויר או לברוח עודפי השמן. טעינת בהתקנה ומכאן משני הצדדים הערוץ העיקרי. פריסה זו יש בסך הכל להוריד את ההתנגדות זרימה עבור מספר שווה של בארות עקב מעקף שלה קצר יותר. זה ולכן מתאים יותר עבור התקנים קנה המידה למעלה עם מספר גבוה של וולס. בנוסף, הן הבארות מדגם מונחה קרוב יותר ביחד, אשר מציעה יתרונות אוטומטיות הדמיה.

דוגמה מלאה טוב טעינת נצפתה עבור פריסות שני, אם גם בנוי כמו שני-בגובה או עיצוב שלוש-גובה. בתכנון שני-גובה, המדגם טוב והן את הערוצים מעקפים הם זהים בגובהם. העיצוב שלוש-גובה דורש מסיכה שלישית, SU8 שכבה חדשה, צעד היישור כדי להבטיח כי הבארות המדגם להיות גבוה יותר מאשר הקודמת לעקוף את הערוצים. זה הגובה-אבחנה מבדלת מקדמת הזנת של דגימת נוזל לתוך הבאר דרך נימי באותו עיקרון זה מפסיק זרימה-constrictions valving. . הנה, בתקרה גבוהה יותר טוב מקביל נמוכה יותר לפלס הלחץ של מניסקוס, זרימה לאורך הכיוון מעקף לקידום הוא המועדף רק לאחר וולס יש מלא לחלוטין כך constrictions שסתום לחסום נוסף זרימת ולהטות אותו במורד הכביש העוקף. עם זאת, טעינת מוצלחת אינה דורשת בקפדנות הבארות יהיה גבוה יותר מאשר המעקף כפי valving נימי המתאים גם ניתן להשיג על-ידי התאמת רוחב הערוץ בהתאם. למרות זאת, מניסיוננו, הבארות גבוהה המבוצעת באופן משמעותי יותר חזקים, טעינה ללא פגם נצפתה בזמנים עד עשרה זרימה-שיעור גבוה ב כל העיצובים שלוש-גובה לעומת המקבילים שני-גובה. אפקט זה הוכרז יותר בפריסה מקבילים.

כדי לחקות את אדי דיפוזיה התגבשות קינטיקה, החדירות סופיים של מסכל פוליאימיד נוצלה כדי לשלוט אידוי מים לאורך זמן. אידוי ניסיוני המחירים היו לכמת על-ידי ניטור השינוי של אמצעי האחסון droplet לאורך זמן על-ידי השוואת טיפה פני השטח והגובה טוב (איור 4C). אידוי מבארות התגבשות בשבב רנטגן לא ממשיך באופן ליניארי, כמו פני שטח מתכווץ הירידה בד בבד עם הגדלת ריכוז ממס תוצאות בשער האידוי מופחת על הזמן⁴⁵. אידוי הראשונית עקב שיעור כ ליניארי של 0.5 nL h^-1 בבארות של הגיאומטריה פריסה טורית.

כדי להבין טוב יותר את התגבשות קינטיקה, בוצעו מדידות DLS בבארות התגבשות של שבב microfluidic. למדידות DLS הראשונית, שבב PDMS בונדד על משטח זכוכית שימש כדי לספק יותר אופטיות ספקטרליות עבור הניסוי פיזור אור. השבב הזה היה טוב באותן מידות כמו השבב רנטגן. PDMS יש של חדירות אדי מים גבוהה יותר מאשר פוליאימיד של החלונות פוליאימיד השבב רנטגן⁴⁵. מאז השטף קשקשים באופן ליניארי עם המרחק, המסלול אידוי של חלון פוליאימיד טוב ניתן להתאים עם חלון PDMS המקביל של עובי המתאים.

תוצאות DLS מראות כי ההתפלגות רדיוס משתנה לאורך זמן (איור 4A-B), הוכחת כי המדידות DLS מאפשר לזהות את התגרענות הראשוני לפני חלקיקים הגבישי הראשון הם נצפו. מידע זה יכול לשמש nucleate ולגדול קריסטלים יחיד לכל טוב על-ידי התאמת מבחוץ את קצב אידוי, ומכאן רוויית יתר רמות בשלב מוקדם התגרענות⁴⁶.

השבב הרנטגן היה קבוע על מתאם מודפס 3D עבור מד זווית צלחת תואמת SBS-הפרעות לקרן החלקיקים EMBL של סינכרוטרון P14-פטרה III (איור 5A). לחלופין, מסגרת מודפס 3D קטן עשוי לשמש שבבי הר רנטגן ל רגיל הפרעות לקרן החלקיקים goniometers²¹. הקריסטלים Thaumatin להיות בגודל של 10-20 מיקרומטר (איור 5B), מכמותה עד רזולוציה של 2.0 Å (איור 5C). כצפוי, רנטגן רקע תרומתה של החלונות foils פוליאימיד דק שני מהשבב רנטגן הינה מוגבלת פוליאימיד פולימר פיזור טבעות 11 Å (2θ ~ 5°) 33 Å (2θ ~ 1.7°) עבור אורך הגל רנטגן של 0.97 Å. אלה שתי טבעות אל תפריעי עיבוד נתונים. Dataset הכולל עם קריסטלים thaumatin 83 נאסף, 10 תבניות עקיפה נרשמו מן כל קריסטל עם סיבוב 1° במהלך כל מסגרת. עיבוד נתונים, פרמטרים עידון, כמו גם הסטטיסטיקה של ערכת נתונים thaumatin רשום, לעומת שני אחרים datasets של גלוקוז איזומראז ו thioredoxin היו גם שנאספו בחיי עיר מפורטים בטבלה 3 , בטבלה 4.

הריקבון בעוצמה של הכוח עקיפה מנורמל לאורך זמן נחקר על ידי נפרדים את ערכת הנתונים thaumatin לתוך חמישה תת datasets (שתי תבניות עקיפה שימשו לכל תת-קבוצה לשמירה מלאה datasets). כפי שמוצג באיור 6B, הכוח עקיפה החלו להקטין לאחר ערכת הנתונים הצוללת הראשונה והיה מתחת ל 50% ב- dataset sub הרביעי. כתוצאה מכך, הערכים Rmeas של datasets הצוללת גם מתרבים לאורך זמן, המעידים על נזקים קרינת רנטגן במהלך איסוף הנתונים. אנחנו משערים רדיקלים חופשיים שנוצר במהלך החשיפה רנטגן במהירות לבזות קריסטלים שכנות בתא תגובה זהה. לדוגמה, כזה נזק רנטגן המשני היה שפחות מודגשת בגישה ניסויית קשורים, איפה קריסטלים הופצו על פני שטח גדול יותר באופן משמעותי כריך פוליאימיד²¹. כדי למזער את הנזק הכולל צילום רנטגן, צריך לאסוף רק מספר קטן של תבניות עקיפה של קריסטל מסויים בטמפרטורת החדר. בנוסף, קריסטל חלבון יחידה אחת בלבד צריך להיחשף לכל תא המטען של השבב microfluidic. ובכל זאת, כל הדגמים מבנה מעודן באמצעות קבצי הנתונים המעובדים מציגים סטריאוכימיה טוב מאוד ונתונים סטטיסטיים מתאימים (טבלה 4). בנוסף, כל מפות צפיפות האלקטרונים הסופי היו באיכות טובה מאוד.

ב הקודמת קריסטלוגרפיה גישות על שבבי שקוף רנטגן, הכיוון ואת סידור הקריסטלים היה להיות מתומרן בכוונה להשיג התפלגות אקראית של קריסטל אוריינטציות⁴⁰ או הושג על-ידי תנועות קריסטל בתוך הנוזל שכבה²¹. כדי להעריך את כיוון קריסטל ב האסימונים שקוף microfluidic רנטגן שמתואר פרוטוקול זה, נקבע את הכיוון תא יחידה של כל חשופות קריסטלים ביחס מערכת הקואורדינטות מעבדה. עבור הקריסטלים thaumatin bipyramidal, העדפה קלה נצפתה (איור 7 א), בעוד השגנו הפצה רחבה עבור גבישים איזומראז גלוקוז (איור 7 ב). אנחנו הסיק כי בסולם ננומטר, רוב חומרי התערוכה חספוס משמעותית. לפיכך, גבישים יכול באופן ספונטני nucleate על פני השטח באופן משמעותי פחות הכיוונים מוטה באופן ספונטני. כזה גרעין קריסטל קטנים יכולים להיות נעולים לתוך אוריינטציה, תוך לגדול לגודל המתאים מבלי לצידוד ביחס הרגיל של פני השטח. למעשה, השטח קריסטל בתיווך התגרענות כבר זמן רב מטרד עבור crystallographers מנסה לולאה של קריסטל צמוד מעל פני השטח ללא פגיעה הקריסטל בתהליך. כאן, אנו יכולים ישירות לנצל גבישים כאלה עבור אוסף נתוני דיפרקציה. עם זאת, מגבלות מסוימות של מערכת קיימת, כפי thioredoxin העדפה חזקה כיוונים מסוימים ב xy-, xz - ו yz ימאהה-מטוסים (איור 7C). הדוגמאות הראה מדגימות כי ההתפלגות התמצאות אינה רק תלויה על הסביבה צמיחה אלא גם על צורת גביש. הקריסטלים thioredoxin יש מוארך צורות אשר נוטים לגדול כיוון מועדף, ואילו את גבישי הטטרגונלית bipyramidal thaumatin או הקריסטלים איזומראז האורתורומבית גלוקוז לא מראים התנהגות זו. עם זאת, בכל המקרים, אפילו עם אוריינטציות המועדפת שנגיש מגוון סבבים קריסטל, גרמו כיסוי מספיק טוב של שטח הדדיים, ומכאן סטים נתונים עבור כל חקר חלבונים. לפיכך, אין אמצעים נוספים נאלצו לקחת בעת בחירת הקריסטלים לחשיפה נ.

איור 1 : ערכה של microfluidic ייצור השבב רנטגן. (1) סו-8 הוא ויתרו על רפידת סיליקון עם ספין מצופה להשיג את עובי השכבה הרצויה. (2) Photoresist חשופים קרינת UV דרך מסיכה. (3) photoresist שלא נחשפו ואז מפותח משם על ידי שטיפת ברצף עם PGMEA ועם אלכוהול איזופרופיל, וכתוצאה מכך (4) מדרגות מאסטר סו-8 ליציקת עוד יותר. (5) PDMS ויוצקים על גבי, ו אשפרה אחרי (6) כייר PDMS, הוא קלופים מהמאסטר SU-8. דבק אפוקסי (7 א) הוא ויתרו על העובש PDMS (7 ב) רדיד פוליאימיד מופעל הוא כימית בונדד שרף אפוקסי. (8) לאחר ריפוי, מסכל פוליאימיד עם הסרט בדוגמת אפוקסי דק הוא קלופים מן העיפוש PDMS. (9) בשלב הסופי, המכשיר הוא מכסה ברדיד פוליאימיד השני להניב תשואה של תחום נמוך רנטגן רקע microfluidic שבב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : תמונה (משמאל) ותמונות מיקרוסקופיה של חתכי רוחב של chips הסופי. קטע מייצג ערוץ (באמצע) לבאר התגבשות (מימין) של שני שבבים נפרדים מוצגים. חיצים מציינים נמדדו המרחקים. כל הממדים נמצאים מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : שרטוט של התגבשות מעצב טוב עם [א] מקבילית או פריסת טורי [B], כפי מהחלק העליון, מן הצד, עם ממדים המצוין מיקרומטר. ערוץ טיפוסי הגולן היו: 50 מיקרומטר לעקוף, 50-60 מיקרומטר התגבשות טוב, 5-10 מיקרומטר נימי שסתום, המתייחס טוב אמצעי אחסון של 2.5 nL (מקביל פריסה) ו-8 nL (פריסה טורית). נציג גם טוען התנהגות מוצג באמצעות צבעי מזון. השבב היה להתקפת wt 12% H 1, 1 H. 2H, 2H-perfluoro-1-octanol ב FC-43, לפני המאכל היה מוזרק הבארות אחסון. החצים הלבנים לציין את כיוון הזרימה. תמונות סקירה של הצג התקנים טעונים כל בארות טעון לערוק מדגם חזקים חינם, ולהמחיש טעינה. הפריסה מקבילים מודגם כמו בעיצוב שלוש-גובה, עם התגבשות וולס גבוה יותר מאשר המעקף, ואילו הפריסה טורי מתואר בעיצוב שני-גובה עם בארות ולעקוף שיש גובה שווה. זרימה טיפוסי המחירים היו µL כ 150/h במהלך טעינה, אבל טעינה ללא פגם נצפתה עבור flowrates של עד 1 מ"ל/h בעיצוב-גובה שלושה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : בחיי עיר דינמית אור פיזור התגבשות טוב לאורך זמן. [A] התמונה המיקרוסקופית סדרת התגבשויות היטב. ה-droplet מאוחסנות רציפה מתכווץ כמו אדי המים מתאדה לאורך זמן. Microcrystals thaumatin הראשון יכול להיות שנצפו לאחר 4 h [B] המתאימה hydrodynamic רדיוס ההפצה של החלקיקים thaumatin נמדדת DLS במהלך תהליך התגבשות צולם ב [A]. היווצרות של שבריר שנייה רדיוס, המציינת אירועים התגרענות הראשונית ניתן לראות לאחר כ ה 1-2 [C] נפח נציג ירידה של שני כרכים droplet הפניה בשל אובדן מים אויר לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : בחיי עיר איסוף נתונים עקיפה. [A] שבבי microfluidic בודדים הם רכוב על ידי תלת-ממד המודפס מתאם (כחול) על מד זווית צלחת. [B] Thaumatin גבישים microfluidic צ'יפ במהלך החשיפה רנטגן כפי עם תמונה על-ידי המיקרוסקופ בשורה-הפרעות לקרן החלקיקים P14 [C] עקיפה של גבישים thaumatin הוקלט לרזולוציה של 2.0, עם רקע החזרה נמוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : הערכת נתונים של נתונים עקיפה thaumatin גבישי בשבב microfluidic, להקליט טמפרטורת החדר. [א] אלקטרון צפיפות של המודל thaumatin מעודן באמצעות המסגרת dataset 1-2 בלבד (קווי המתאר הכחול-1.5 σ). [B] עוצמת דעיכה של גבישים thaumatin כפונקציה של רנטגן במינון. [C] האבולוציה של הערך Rmeas מעל המינון רנטגן. תיבת מגרשים ב [B] ו- [ג] עם רביעונים (ערכים עליון 75%, ערכים 50%, נמוך יותר ערכים 25% ו רשע) וקצת עם 95% מרווחי הביטחון מייצגים את הדעיכה של עוצמת עקיפה, Rmeas של כל חשופות קריסטלים (n = 83). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7 : חלוקת יחידה אוריינטציות תא בנייר שבב microfluidic לגבי מערכת הקואורדינטות מעבדה. [א] הקריסטלים thaumatin bipyramidal הראה הפצה רחבה של אוריינטציות מכסה כמעט 180° xy-(כחול), מטוס ה-xz (ירוק), yz-(red) המטוס. [B] גלוקוז איזומראז מציג גם הפצה נרחבת, בעוד thioredoxin [C] הפגינו העדפה חזקה מסוימים אוריינטציות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה 1: SU8 דוגמה תהליך לעיצוב השבב רנטגן תלת שכבתי מקבילים. שכבה זו מצווה יאפשר יציקה תבנית PDMS רנטגן שבב פבריקציה נוספת. כדי עובש ישירות של PDMS במהלך שטנץ, להפוך את השכבה הזמנת במהלך ייצור הבסיס כדי להפעיל 3^rd לסיים עם השכבה^st 1 במקום.

טבלה 2: התגבשות התנאים וקבוצות שטח של חלבון גבישים מוכן, כולל הקוד מקדם והן pdb הכחדה.

טבלה 3: קרני רנטגן נתונים אוסף פרמטר.

נתונים אוסף סטטיסטיקה	thaumatin (מסגרת 1-20)	איזומראז גלוקוז (מסגרת 1-100)	thioredoxin (מסגרת 1-10)
הפרעות לקרן החלקיקים		P14
גל [Å]		0.96863
חבורת סימטריות מרחבית	P41212	I222	P42212
יחידת התא בפרמטרים: = b, c []	58.62, 151.48	93.91, 99.60, 103.04	58.45, 151.59
מספר גבישים	101	41	34
סה כ תנודה [°]	10	10	10
רזולוציה [Å]	30.1.1989 (1.95-1.89)	30.1.1975 (1.80 – 1.75)	30.3.2000 (3.20-3.00)
הטמפרטורה [K]	296	296	296
R p.i.m.b	7.5 (25.5)	8.8 (28.0)	9.1 (33.2)
השתקפויות נמדד	1553200	690000	1111196
השתקפויות ייחודי	21850	48942	44449
I/σ(I) הממוצע	6.07 (1.78)	5.85 (1.66)	4.08 (1.47)
Mn(I) חצי-set המתאם CC(1/2)	96.2 (72.2)	95.8 (68.2)	97.9 (75.3)
השלמות [%]	99.8 (100.0)	100.0 (99.9)	99.9 (100.0)
יתירות	71.1	14.1	25
הסטטיסטיקה עידון
רזולוציה בטווח [Å]	1/30/1989	1/30/1975	30/3/2000
R / Rחינם [%]	18.8/23.9	18.1/20.5	18.9/23.1
אטומים החלבון	1550	3045	1129
מולקולות המים	51	111	164
מולקולות ליגנד	20	0	0
סטיית rms
אורך-בונד [Å]	0.02	0.026	0.01
בונד זווית [°]	2.04	2.22	1.43
B גורם [Å2]
חלבון	22.6	20	50
מים	25.1	27.1	29.7
ליגנד	20.4
ניתוח עלילת Ramachandran
אזורים המועדפות ביותר [%]	97.67	95.32	96.13
אזורים מותרים [%]	2.44	4.16	3.64
בנדיבות מותר אזורים [%]	0.49	0.52	0.23
ת: ערכים בסוגריים הם הפגז ברזולוציה הגבוהה ביותר.
ב': () איפה אני (hkl) עוצמת hkl השתקפויות רשע, Σhkl הוא הסכום מעל כולנו השתקפות, Σi נגמר לי הסכום מדידות של השתקפות hkl.

טבלה 4: נתונים אוסף סטטיסטיקה datasets מ thaumatin, גלוקוז איזומראז ו thioredoxin.

Supplementry-קובץ 1: chip_geometry.dwg. קובץ CAD של גיאומטריות שבב פעם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

2 Supplementry-קובץ: goniometer_adapter.stl. STL-קובץ ציון המתאם מד זווית צילום רנטגן שבב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

3 Supplementry-קובץ: xds.sh. Bash script עבור יצירת קבצי קלט כדי לעבד הפרוסות של עקיפה נתונים על-ידי XDS. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

4 Supplementry-קובץ: xscale.sh. Bash script כדי למזג נתוני דיפרקציה קבוצות משנה וליצור קובץ HKL. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Supplementry-קובץ 5: ISigma.sh. Bash script כדי לחלץ את הערכים ISigma של כל קבוצות משנה בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Supplementry-קובץ 6: Rmeas.sh. Bash script כדי לחלץ ערכים Rmeas של כל קבוצות משנה בודדים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Supplementry-קובץ 7: rotation_matrix.sh. Bash script כדי להכין קובץ הקלט עבור Matlab לחשב את זוויות אוילר מתוך מטריצת הסיבוב. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

אנחנו לפברק microfluidic מכשירי בחיי עיר רנטגן עקיפה על ידי תכנים השרף אפוקסי פוליאימיד וחומרי לסכל כחומר חלון מילוי. את הנהלים שלנו אופטימיזציה השלבים השונים של תהליך ייצור מעל הקודם רנטגן שבב עיצובים^16,21. הורדנו את עובי חלון, ובכך הרקע פיזור תוך כדי גם הקלות פבריקציה נוספת פחות כמו תהליך צעדים נדרשים. בחיי עיר התגבשות באמצעות פרוטוקול המתואר יש יתרונות משמעותיים. הוא מאפשר איסוף נתונים עקיפה בטמפרטורת החדר, ובכך אינה כוללת את הצורך של הקפאה הגנה, אשר במקרים מסוימים מכיל את הסיכון של החדרת חפצים במבנה חלבון. יתר על כן, הקריסטלים אינם כפופים מתח פיזי, כי ניתן למנוע את ההעברה של הקריסטלים מהסביבה הטבעית שלהם. באמצעות הליך זה, הקריסטלים לשמור על האיכות הגבוהה ביותר שלהם, אינם סובלים כל טיפול.

מניסיוננו, השלבים הקריטיים ביותר בתוך הפרוטוקול סובבים סביב השליטה תהליך התגבשות. הפרמטרים כדי להשיג קריסטלים מתאימים רנטגן בממדים המתאימים צריך להיות מזוהה מדעית, לא יכול להילקח ישירות מאדי דיפוזיה ניסויים. באמצעות ריכוז זהה של חלבונים, precipitant לא תמיד לגרום קריסטלים שבבי שונים, או לעתים בבארות שונים בתוך השבב אותו. אפשרות זו מציינת כי כל הגורמים המשפיעים על קריסטל התגרענות וצמיחה להתייחס בזהירות, כמו אמא המשקאות קינטיקה הרכב או התגבשות (דרך המסלול אידוי). כמו גבישים גדולים מכמותה לרזולוציה גבוהה יותר, גדלים באופן אידיאלי גבישים גדולים כראוי. התהליך של קריסטל התגרענות וצמיחה עשוי להיות מלווה עם DLS מדידות. התאמת המוקד לייזר בפנים מיקרומטר ~ 50 דק התגבשות תאים של השבב יכול להיות מאתגר ועשויה כיוון ידני עדין. באמצעות בארות עמוקות יותר מ- 100 מיקרומטר, יישור אוטומטי לייזר היה ריאלי ואמין, כזה יכול להיות במעקב בארות מרובים באמצעות ערכות רכישה אוטומטית.

האסימונים רנטגן פוליאימיד מבוסס מייצרים רק רקע נמוך, נדגים את ההתאמה של התקנים אלה עבור השגרה קרני רנטגן איסוף נתונים על ידי פתרון מבנים חלבונים מודל שלוש. הפתרון הטוב ביותר שהושג בשבב שונה, לעומת רזולוציות מושגת בעבר, קריסטלים חלבון גדול יותר באופן משמעותי, אוסף נתונים רנטגן קונבנציונלי. זה יכול להיות בגלל מספר גורמים, בהמשך התגבשות תנאי אופטימיזציה עשויים לשפר עקיפה. ניתן לאסוף בחיי עיר עקיפה נתוני רזולוציה Å 1.8 קריסטל החלה עם מידות קטנות יותר 30 מיקרומטר עד היה. ניתוח מפורט של נתוני דיפרקציה thaumatin מספק תובנות על ניזקי קרינה. כדי להגביל את הרחבה של נזק הקרינה, קריסטל יחידה אחת בלבד צריך להיות חשופים לכל תא את ההתקן microfluidic, כפי פעפוע של רדיקלים, בגבישים שכנות יכול להתרחש. כדי לשפר את המהירות של איסוף נתונים, זה אמור להיות אוטומטי בעתיד.

בגלל מורפולוגיה קריסטל, במקרים מסוימים כיוון מועדף יכול להתרחש. זה היה לדוגמה במקרה של thioredoxin את ערכת הנתונים, איפה הקריסטלים כיוון מועדף בחריפות יחסית החלונות שבב. גם כאן אנו יכולים לאסוף dataset עקיפה מוחלטת. אם קריסטלים התערוכה כיוון מועדף בשבב, בפרט אם הקבוצה שטח המתאים גם של סימטריה נמוכה, ואז שלמות התרגום של ערכת הנתונים צריך לפקח במהלך איסוף כזה להיות מספיק קנים תבניות עקיפה אסף.

מחקרים זמן לפתור באמצעות אסימונים אלה אפשריות ישירות באמצעות אור המושרה תגובות בגישה רב-משאבה-בדיקה. פוליאימיד לסכל שידור אור הלייזר המשאבה צריכה להיות הובהר ונקה. לחלופין, שטיחות פוליאימיד או קוק יכול לשמש. גיאומטריות microfluidic הנוכחי אינם מאפשרים את המצע ערבוב ניסויים לאחר הקריסטלים גדלים. עם זאת, אנו מצפים פרוטוקול ייצור השבב רנטגן תיאר גם להיות מתאים כל כך ערבוב עיצובים עבור שניהם עקיפה של קרני רנטגן זמן לפתור כמו גם פיזור גישות¹⁹.

המחברים אין לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי קרן זרע מזח PIF-2015-46, מעניק BMBF 05K16GUA 05K12GU3, ואת האשכול מצוינות "המבורג מרכז הדמיה מרביים – מבנה, דינמיקה, שליטה של החומר את המשקל האטומי" של דויטשה פתוח (DFG). העבודה של מחברים המזוהים עם המרכז למדעי לייזר אלקטרונים חופשיים מומן על ידי האגודה הלמהולץ דרך תוכנית אוריינטציה קרנות. הנתונים MX סינכרוטרון נאסף על הפרעות לקרן החלקיקים P14 המופעל ע י EMBL המבורג-הטבעת אחסון פטרה השלישי (דזי, המבורג, גרמניה).