Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı

Bu protokol, radyal olarak göç eden kortikal nöronların doğrudan gözlenmesi için talimatlar sağlar. N utero elektroporasyonda, organotipik dilim kültürü ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme, göç eden nöronlardaki ilgi genlerinin aşırı ekspresyonunun veya downregülasyonunun etkilerini doğrudan ve dinamik olarak incelemek ve gelişme sırasındaki farklılaşmalarını analiz etmek için birleştirilir.

Uterus elektroporasyonu, gelişmekte olan fare embriyolarının serebral korteksindeki radyal göç sürecini incelemek için hızlı ve güçlü bir yaklaşımdır. Radyal göçün farklı adımlarını tarif etmede ve bu işlemi kontrol eden moleküler mekanizmaları karakterize etmede yardımcı oldu. Göç eden nöronları doğrudan ve dinamik olarak analiz etmek için zamanla izlenmesi gerekiyor. Bu protokol , utero elektroporasyon ile organotipik dilim kültürü ve radikal göç eden kortikal nöronların doğrudan muayene ve dinamik analizine imkan veren zaman atlamalı konfokal görüntüleme yöntemlerini bir araya getiren bir iş akışı tanımlamaktadır. Ayrıca, göç hızı, hız profili ve radyal yönlendirme değişiklikleri gibi göç eden nöronların ayrıntılı karakterizasyonu da mümkündür. Bu yöntem, kurtarma deneylerinin yanı sıra fonksiyon kaybı ve kazancı ile radyal olarak göç eden kortikal nöronlarda ilgi çekici genlerin işlevsel analizlerini gerçekleştirmek için kolayca adapte edilebilir. HızlandırılmışGöç eden nöronların görüntülenmesi, ortaya çıktıktan sonra, nöronal migrasyon bozukluklarının fare modellerinde serebral korteks gelişimini incelemek için etkili bir araç olan en gelişmiş tekniktir.

Neokorteks bilişsel, duygusal ve sensorimotor işlevlerin başlıca sitesidir. Beynin yüzeyine paralel altı yatay tabakadan oluşur. Gelişme sırasında, dorsal telencefalonun yan duvarındaki progenitör hücreler, radyal olarak pial yüzeyine doğru göç eden ve katmana spesifik bir nöronal kimlik edinen projeksiyon nöronlarına neden olur. Ventriküler / subventriküler bölgelerde (VZ / SVZ) üretildikten sonra, bu nöronlar geçici olarak çok kutuplu olurlar ve göçlerini yavaşlatırlar. Orta bölgede (IZ) kısa bir süre kaldıktan sonra, iki kutuplu morfolojiye geçerler, radyal glial iskele üzerine bağlanırlar ve radyal olarak göç ederek korteks plakasına (CP) geçerler. Nihai hedef yansıtmalarına ulaştıklarında nöronlar radyal glial süreçlerden ayrılır ve katmana özgü kimlik kazanır. Nöronal migrasyonun farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissen gibi şiddetli kortikal malformasyona neden olabilirEfali veya beyaz cevher heterotopisi ^{1 , 2} .

Enerjide elektroporasyon, kemirgen embriyolarının ^{3 , 4} gelişmekte olan beyinde sinir öncü hücreleri transfekte etmek için hızlı ve güçlü bir tekniktir. Bu teknikle, nöronların geliştirilmesindeki işlevlerini incelemek için ilgilenilen genleri knockdown ve / veya aşırı ifade etmek mümkündür. Bu yöntem özellikle morfolojik ayrıntıların tanımlanmasına ve radyal göç sürecinin moleküler mekanizmalarının karakterize edilmesine yardımcı olmuştur ( ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9)} . Radyal olarak göç eden nöronlar, hücre şekli, göç hızı ve göç yönü gibi zaman içerisinde doğrudan ve sürekli gözlem gerektiren dinamik değişiklikler yaparlar. Organotipik dilim kültürüElektroporasyona uğramış beyinlerin tekrar ve zaman atlamalı konfokal görüntülemesi zaman içinde göç eden nöronları doğrudan gözlemlemesine izin verir. Bu kombine yaklaşımı kullanarak, elektroporasyona uğramış beyinlerin sabit doku kesitlerinde araştırılamayan göç eden nöronların farklı özelliklerini analiz etmek mümkündür.

Geçenlerde kortikal gelişim ¹⁰ sırasında transkripsiyon faktörü B hücreli KLL / lenfoma 11a (Bcl11a) rolünü incelemek için Electroporated beyinlerinin dilim kültürlerde nöronları göç zaman atlamalı konfokal görüntüleme uyguladı. Bcl11a, genç göç eden kortikal nöronlarda eksprese edilir ve fonksiyonlarını incelemek için bir koşullu mutant Bcl11a aleli ( Bcl11a ^flox ) ^{11 kullanılır} . Bcl11a ^{flox / flox} beyinlerinin kortikal progenitörlerine Cre ^optik proteini (GFP) ile birlikte Cre rekombinazın elektroporasyonu, sadece birkaç hücrenin bir mutasyona uğramış olduğu bir mozaik mutant durum yaratmamızı sağladı.Aksi takdirde vahşi tipli arka plan. Bcl11a'nın hücre özerk işlevlerini tek hücre düzeyinde incelemek bu şekilde mümkündü. Bcl11a mutant nöronlarının, hız profillerinde düşük hız, kaymalar ve ayrıca göç sırasında rasgele benzeri oryantasyon değişiklikleri sergilediğini bulduk ¹⁰ . Anlatılan protokolde, fare beyinlerinin başarılı elektroporasyon ve dilim kültür hazırlığı ¹² için bir iş akışı ve kortikal dilim kültürlerinin zaman kazanım konfokal görüntülemesi açıklanmaktadır.

Tüm deneysel prosedürler Hayvan Refahı Komitesi (Regierungspräsidium Tübingen) tarafından onaylanmış ve Alman Hayvan Refahı Yasası ve 2010/63 / AB AB Direktifi uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Utero Elektroporasyonunda

1. Mikroenjeksiyon iğneleri
   1. Kutu filamentli (2.5 mm x 2.5 mm) bir mikropipet çekici ve aşağıdaki program ile borosilikat cam kapillerleri (dış çap: 1.0 mm, iç çap: 0.58 mm, uzunluk: 100 mm) çekerek mikroenjeksiyon iğnelerine yerleştirin. HEAT: 540, PULL : 125, YÜKSEKLİK: 20 ve GECİKMELER: 140. Bir RAMP testi (HEAT değeri: RAMP + 25) uygulayarak her bir filaman için HEAT değerini belirleyin.
   2. Böcek iğneleri, embriyonik güne (E) 13.5 veya daha genç ve 30 ila 40 μm arasında enjekte etmek için 20 ila 30 μm'lik bir uç boyutu elde etmek için mikro gözle 38 ° 'lik bir açıda ve orta devir hızına orta eğri doğum yaparken enjekte etmek içinevreleri. Depolama için ipuçlarına zarar vermemek için iğneleri modelleme kili bulunan bir kutuya veya petri kabında düzeltin.
2. Plazmid DNA Çözeltisi
   1. Üreticinin talimatlarına göre bir endotoksin içermeyen maxi hazırlama kiti kullanarak flüoresan raportör proteini ( örn., GFP) içeren plasmid DNA yapısını hazırlayın.
   2. % 0.01'lik bir nihai konsantrasyonda Hızlı Yeşil içeren endotoksin içermeyen Tris-EDTA tamponu içinde plazmid DNA solüsyonunu 1 - 2 μg / μL son konsantrasyona kadar inceltin. Çözelti çözeltisi ve -20 ° C'de saklayın.
3. Bakteriostatik Sodyum Klorid Çözeltisi
   1. Bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisini, izotonik% 0.9 sodyum klorür çözeltisine% 0.9'luk bir nihai konsantrasyona kadar benzil alkol ilave ederek hazırlayın. Kullanımdan hemen önce steril filtre çözeltisi.
4. Carprofen Enjeksiyon Çözümü
   1. Karprofen enjeksiyon solüsyonunu,Steril izotonik% 0.9 sodyum klorür çözeltisine 0.5 mg / mL'lik nihai konsantrasyona karprofen eklenir. 28 güne kadar 4 ° C'de saklayın.
5. Anestezi, DNA Enjeksiyonu ve Elektroporasyon
   1. Bir E14.5 zamanlanmış gebe farenin ağırlığına koyun ve bir buharlaştırıcıya bağlı şeffaf bir anestezi bölmesine yerleştirin ve% 5 izofluran ile doyurun. Hayvan bilinçsiz olduğunda, 37 ° C'lik bir ısıtma plakasına bağlı bir anestezi maskesine aktarın ve onu% 1.8 - 2.2 izofluran ile anestezi altında tutmaya devam edin.
      Not: Cerrahi anestezinin gelişimini kuyruk tutam ve pedal refleksleri kaybı ile değerlendirin (ayak parmağı çimdikleme).
   2. Analjezik için fare vücut ağırlığının her birine (5 mg / kg vücut ağırlığı) subkütan olarak 100 μL carprofen enjeksiyon solüsyonu enjekte edin. Fareyi aşağıya bakacak şekilde çevirin ve kurutmalarını önlemek için gözleri petrol jölesi ile dikkatle örtün.
   3. Kolları yavaşça yayıp düzeltinCerrahi bant ile ısıtma plakasına. Karnı% 70 etanol ile sterilize ettikten sonra selüloz svapları kullanarak iyot solüsyonu (7.5 mg / mL) sterilize edin. Bu işlemi uygun dezenfeksiyon için üç kez tekrarlayın.
   4. Karını karın kesisi için bir alan (çap: 2 - 2.5 cm) dışarı atmak için kesilmiş steril gazlı bezle kapatın. Gazlı bezleri bakteriostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin.
      Dikkat: Pedal refleksi kaybıyla cerrahi anestezinin gelişimini tekrar gözden geçirin.
   5. Mikro Adson Forseps (tırtıklı, uzunluk: 12 cm) ve ince makas (yana eğik, 9 cm uzunluğunda), karın orta hat boyunca cildi yaklaşık 1.5 cm keser. Linea alba boyunca alttaki kasları kesin.
   6. Ring forsepsiyle (uzunluk: 9 cm, dış çap: 3 mm, iç çap: 2,2 mm) bir rahim boynuzunu çıkarın ve hafifçe nemlendirilmiş gazlı bezin üzerine yerleştirin.
      Dikkat: Uterus boynuzunu halka forsepsiyle sadece embriyoların arasında vePlasentaları veya herhangi bir besleme gemisini rahatsız etmeyin. Uterusu bakteriostatik sodyum klorür çözeltisi ile her zaman nemli tutun.
   7. Yüzük forsepsiyle dikkatli bir şekilde bir embriyo yerleştirin ve sagital sinüse paralel hilal şeklinde bir gölge oluşturan yanal ventrikülün yerini tespit edin. Enjeksiyon bölgesi, pigmentli göz ile sinüslerin birleştiği nokta arasındaki hattın ortasında bulunur ve burada sagital sinüs iki transvers sinüse dallar. Mikroenjeksiyon iğnesini uterus duvarından ve lateral ventriküle itin.
      Not: Gerekirse, iğnenin geri çekilmesi ile enjeksiyon derinliği düzeltilebilir.
   8. Aşağıdaki ayarlar kullanılarak, bir ayak pedalıyla çalıştırılan bir mikroenjektör ile lateral ventriküle 1 ila 2 μL DNA solüsyonu enjekte edin: 25 psi, puls başına 10 ila 20 ms ve 5 ila 10 darbe. Başarılı enjeksiyon, ventriküler sistemi doldurması gereken renkli DNA çözeltisi ile izlenebilir.
   9. 'Pozitif' terminalin enjekte edilen ventrikül ile aynı tarafta olacağı şekilde cımbız tipi elektrotları (E13.5 veya daha küçük ve 3 mm çaplı, E14.5 veya daha eski için 5 mm çaplı) yerleştirin ve 'negatif' Terminal embriyonun başının altındaki enjekte edilen ventrikülün karşı tarafındadır.
   10. Elektroporasyon yerini bir kaç damla bakteriyostatik sodyum klorür çözeltisi ile nemlendirin ve 950 ms aralıklarla 50 ms zaman aralığında 5 elektrik akımı darbesi uygulayın (E13.5 veya daha genç için 35 V, E14.5 veya daha eski için 40 V).
       Not: 60 ila 90 mA akımları, başarılı elektroporasyon için genellikle yeterlidir. Daha düşük akımlar, nöronları etkili bir şekilde transekte etmezken, daha yüksek akımlar embriyonik ölümü sağlayabilir.
   11. Uterus boynuzunun her embriyo prosedürünü tekrarlayın (Adım 1.5.7. Ila 1.5.10 arası.) Ve hafifçe karın boşluğuna yerleştirin.
   12. Uterus boynunu diğer taraftan çıkarın ve işlemi tekrarlayınAdım 1.5.7'de anlatılan derinlik. 1.5.11'e.
   13. Mikro Adson Forceps, Mathieu İğne Tutucu (tungsten karpit, uzunluk: 14 cm) ve emilebilir olmayan cerrahi sütür (3/8 daire, 13 mm, koniklik noktası) kullanarak deriyi sütüre etmeden önce kas tabakasını sütüre ederek karın boşluğunu kapatın.
       Dikkat: Dikiş sırasında uterus veya başka organları tutmamaya özen gösterin.
   14. İyot çözeltisi (7.5 mg / mL) ile dikkatli bir şekilde cilt dikişini dezenfekte edin ve selüloz svapları kullanarak perioküler fazlalık petrol jölesini hafifçe çıkarın. Uyanana kadar fare kızılötesi bir lambanın altına koyun. Önümüzdeki iki gün boyunca fareyi yakından izleyin. 12 ila 24 saat sonra Adım 1.5.2'de açıklandığı gibi analjezi tedavisini tekrarlayın.

2. Organotipik Dilim Kültürü

1. Laminin Stok Çözümü
   1. 1 mg / mL laminin stok solüsyonu elde etmek için 1 mg liyofilize laminin steril suda eritilir. 50 mcL alikotları a hazırlayın-80 ° C'de saklayın.
2. Poli-L-Lizin Stok Çözeltisi
   1. 1 mg / mL poli-L-lisin stok solüsyonu elde etmek için 50 mg poli-L-lisin steril suda eritilir. 0.5 mL alikotları hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.
3. Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisini Tamamlayın (Komple HBSS)
   1. 50 mL 10x HBSS solüsyonu, 1.25 mL 1 M HEPES tamponu (pH 7.4), 15 mL 1 M D-glikoz solüsyonu, 5 mL 100 mM kalsiyum klorür solüsyonu, 5 mL 100 mM magnezyum sülfat Çözeltisi ve 2 mL 1 M sodyum hidrojen karbonat çözeltisi ilave edildi. 0,5 L steril su ekleyin, steril filtre ve 4 ° C'de saklayın.
4. Dilim Kültür Ortamı
   1. 35 mL Bazal Orta Kartal (BME), 12.9 mL tamamlanmış HBSS (bölüm 2.3.1'e bakın), 1.35 mL 1 M D-glikoz, 0.25 mL 200 mM L-glutamin ve 0.5 mL penisilin-streptomisin'i birleştirin. 50 mL dilim kültürü elde edinorta. Steril filtre ve son konsantrasyonu% 5 olan at serumu ekleyin. 4 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
5. Düşük Erime Noktası (LMP) Agaroz Çözeltisi
   1. 1,5 g LMP agarozun 50 mL tamamlanmış HBSS'ye bir mikrodalga fırında 1 ila 2 dakika boyunca orta güçte ısıtılarak eritilerek% 3 LMP agaroz solüsyonu hazırlayın.
      Not: Kaynatmada taşmayı önlemek için ısıyı dikkatle izleyin.
   2. Çözelti, kullanıma hazır olana kadar 38 ° C'de bir su banyosuna yerleştirin. 4 ° C'de saklayın ve bir kez tekrar kullanın.
6. Membran Ek Parçalarının Kaplanması
   1. Kaplama çözeltisi elde etmek için (6 ekleme için yeterli) 6 mL steril suya bir kısım laminin stok solüsyonu (Adım 2.1.1 cf) ve bir kısım poli-L-lizin stok solüsyonu (c adım 2.2.1.) Ilave edin. .
   2. Her bir kuyunun tabanında 2 mL steril su ihtiva eden bir 6 oyuklu plaka içine zar insertleri yerleştirin. 1 mL kaplama solüsyonu ilave edin(Basamak 2.6.1), gece boyunca 37 ° C'de ve% 5 karbondioksit atmosferi altında inkübe edin.
      Not: Sadece polietilen-flüoroetilen (PTFE) membran gibi optik olarak temiz membranlara sahip ara parçaları kullanın.
   3. Membranları üç kez 1 mL steril su ile yıkayın ve kurutun. Aynı gün kaplamalı zarları kullanın ya da 4 haftada 4 ° C'de temiz 6 gözlü bir plakta saklayın.
7. Beyin Diseksiyonu ve Gömme
   1. Elektroporasyondan iki gün sonra fareyi, bir buharlaştırıcıya bağlı şeffaf bir odaya yerleştirin ve% 5 izofluranla doyurun. Hayvan bilinçsiz olduğunda odadan çıkarın ve servikal dislokasyon ile kurban edin.
   2. Embriyoları içeren uterus çıkarın ve buz soğukluğu tam HBSS ile 10 cm Petri kabına yerleştirin.
      Not: Bundan sonra tüm çözümleri, embriyoları ve beyinleri buzda tutun.
   3. Bir stereomikroskop, ince uçlu forseps kullanın (düz,11 cm) ve bir çift Vannas Tübingen Bahar Makası (açılı, uzunluk: 9.5 cm) her bir embriyonu rahimden ayırmak ve onu buz gibi soğuk HBSS içeren bir başka petri kabına aktarmak için kullanınız.
   4. Beyin sapı seviyesinde bir kesi yapın ve sagital orta hat boyunca kesim yapın. Beyni kapsayan deriyi ve kıkırdakı soyun. Daha sonra, hemisferlerin hemen arkasındaki beyin sapını kesin ve beyin kafatasından çıkarın. Beyni bir mikro-kaşık spatula (185 mm x 5 mm) ile buz gibi soğuk HBSS içeren 12 plaka ile aktarın. 12 gözlü plakadaki çöplerden tüm beyinleri toplayın.
   5. Floresan parlaklık ve elektroporasyon yapılan bölgenin büyüklüğü için 12-yuvalı plakadaki beyinleri taramak için bir flüoresan stereomikroskop kullanın. Daha ileri işlem için varsayımsal somatosensoryal kortekste parlak flüoresan sinyalleriyle 2 ila 4 beyin seçin.
   6. 38 ° C'de tutulan% 3 LMP agaroz çözeltisini soyulmuş tek kullanımlık gömme kalıbına dökün. removE beyin 12 kuyucuklu bir plaka ile bir mikro kaşık spatula ile dikkatle ve ince doku kağıdı kullanarak beynin etrafında aşırı HBSS eksiksiz tahliye.
   7. Beyni agaroz çözeltisine yavaşça yerleştirin, kalıbın altına itin ve 20 derecelik bir iğne kullanarak pozisyonunu dikkatle ayarlayın. Koronal kesitler için, beyindeki koku alma ampulleri yukarı doğru bakacak şekilde yönlendirin. Agaroz çözeltisi katılaşıncaya kadar kalıp buzda tutun ve beynin kesilmesi ile devam edin.
8. Vibrasyonlu Kesit ve Dilim Kültürü
   1. Agaroz bloğu kalıptan çıkarın ve steril bir petri kapının kapağının üzerine yerleştirin. Fazla agarozu, temiz bir tıraş bıçağı ile ayırın ve diğer taraftan olfaktor ampullerin yaklaşık 2 ila 3 mm altına ve 1 mm agaroz bırakın. Kıvrımlı agaroz bloğunu, koku alma ampulleri, siyanoakrilat tutkalı kullanarak bir örnek aşamasına doğru aşağı bakacak şekilde düzeltin.
      Not: Aletleri ve ekipmanları% 70 etano ile sterilize edinL bölümlemeden önce.
   2. Örnek aşamasını, buz gibi soğuk HBSS içeren titreşimli bıçak mikroskobu dilimleme odasına aktarın ve dorsal yüzü bıçağa doğru konumlandırın. Elektroporasyonlu bölgeyi içeren 250 μm kalınlığında beyin dilimlerini 0,9 mm'den düşük orta şiddette ve 0,09-0,12 mm / s'lik çok yavaş kesit hızı ile kesin. Genellikle başarılı bir şekilde elektroporasyona tabi tutulan beyinden parlak floresan sinyali olan 4-6 dilim elde edilir.
   3. Bükülmüş bir mikro-kaşık spatula ve ince uçlu forseps ile, beyin dilimlerini çevreleyen agaroz ile dikkatli bir şekilde buz gibi soğuk HBSS içeren 6 plakalı bir plakaya aktarın.
      Dikkat: Aktarım sırasında forsepsle sadece bölümlerin çevresindeki agaroz jantlara dokunarak beyin dokusuna zarar vermemek için dikkatli olun.
   4. Seçilen tüm beyinleri Adım 2.8.1'de açıklandığı gibi işleyin. 2.8.3'e.
   5. Beyin yerleştirmeden önce 100 μL komple HBSS ile membran eklentilerini nemlendirin.Dilimleri konumlandırmayı kolaylaştırmak için membranlara yapıştırın. 1 membranlı parçaya en fazla 5 dilim yerleştirilebilir.
   6. Dilimleri, eğilmiş bir mikro-kaşık spatula ve ince uçlu forseps kullanarak membranlara dikkatlice aktarın. Agaroz jantına forseps ile hafifçe dokunarak spatula üzerine bir dilim yavaşça çekin ve dilimi spatula'dan zar üzerine hafifçe itin. Dilimi forseps kullanarak yerleştirin ve kalan dilimleri aktarmaya devam edin. Fazla komple HBSS'yi bir pipetle çıkarın.
      Not: Dilimleri birbiriyle örtüşmeyin.
   7. Forsepps yardımıyla dikkatlice dilim kültür ortamı (cf Adım 2.4.1.) 1.8 mL içeren bir 6-kuyucuklu plaka içine dilimler ile membran insert yerleştirin ve 37 ° C'de ve% 5 karbon dioksit atmosferi zaman geçene kadar inkübe edin. görüntüleme.

3. Zamanaşımı Görüntüleme

1. Mikroskop Kurulumu
   1. Sahne alanına yerleştirilen bir iklim odası ayarlayın.Ters çevrilmiş konfokal mikroskop ile 37 ° C ve% 5 karbondioksit atmosferi. Lazer yoğunluğunu azaltmak ve hücre yaşayabilirliğini artırmak için hibrid bir dedektör kullanın. Ayrıntılı analiz için, 0,6 veya daha yüksek bir sayısal diyafram ile 40X ekstra uzun çalışma mesafesi kullanın.
      Not: Görüntüleme işlemi sırasında kararlı bir odak sağlamak için, mikroskopun tüm bileşenleri görüntülemeden önce 2-3 saat önceden 37 ° C'ye ısıtılmalıdır.
2. Dilim Görüntüleme
   1. Ters çevrilmiş flüoresan mikroskop kullanılarak membran içeren 6 oyuklu plakadan görüntüleme için bir beyin dilimi seçin.
      Dikkat: Ultraviyole ışığa uzun süre maruz bırakılmamalıdır, çünkü bu durum hücresel fotodamerjere neden olabilir.
      Not: Üst SVZ'de parlak tek nöronlu, dilimin pial yüzeyine radyal olarak göç eden bir dilim seçin. Tüm CP'ye yayılmış radyal glial hücrelerin ince flüoresan işlemleri, sağlam bir radyal glial iskele gösteriyor ki bu daD radyal olarak göç eden kortikal nöronlarla.
   2. Forsep yardımı ile 2 ml dilim kültür ortamı içeren 50 mm çaplı bir cam tabağa çalkalamak için zaman atlamalı görüntüleme için seçilen dilim ile zar insertini aktarın. Konfokal mikroskopun iklim odasına tabak yerleştirin.
   3. Çözünürlüğü 512 piksel olarak 512 olarak ayarlayın ve tarama hızını 400 Hz'den 700 Hz'e yükseltin ve böylece kare hızını saniyede yaklaşık 1.4 ile 2.5 kare arasında artırın. En fazla iki kere ortalamayı kullanmayın. Elektroporasyonlu bölge boyunca (genellikle 400-100 μm) bir z-yığınını 1.5 μm'lik adım boyutuyla tanımlayın. Toplu olarak bu ayarlar, fotoğraf alımı sırasında fotodameri düşük tutarken görüntünün yeterli çözünürlüğünü ve parlaklığını sağlar. Her 30 dakikada bir z-yığını alarak zaman atlamalı seriyi başlatın.
      Not: Dilimin lazer ışığına uzun süre maruz kalması, fotodamarjı indükleyerek hücrelerin yaşayabilirliğini azaltacaktır. Exp ayarlayınBuna göre lazer ışığına vakit ayırın.
   4. ImageJ yazılımı (https://imagej.nih.gov/iij/) veya eşdeğeri kullanarak zaman atım serisini analiz edin.

Daha önce, utero elektroporasyon ile Bcl11a'nın genetik silinmesinin, geç doğan üst katman projeksiyon nöronlarının radyal göçünü ¹⁰ engellediğini göstermiştik. Kre-IRES-GFP ihtiva eden bir DNA plazmid vektörü Elektroporasyon verimli ^{flox / flox} beyinleri ¹¹ koşullu Bcl11a içinde Bcl11a silindi. Elektroporasyondan üç gün sonra E14.5 elektroporasyona uğramış beyinleri analiz ettiğimizde, çoğu kontrol nöronu CP'ye göç ederken, birçok Bcl11a mutant nöronu IZ ve VZ / SVZ'deki göç yolu boyunca durdu. Ayrıca, özellikle polarizasyon ¹⁰ kusurları gösteren Bcl11a silinmesi üzerine İZ bipolar hücre zararına kutuplu hücre sayısında bir artış bulundu.

Migrayı doğrudan ve dinamik olarak analiz etmekBcl11a mutant nöronlarının davranışsal davranışları, elektroporasyona uğramış beyinlerden hazırlanan organotipik dilim kültüründe nöronların göç etme zaman-lapse konfokal görüntüleme yöntemini kullandık. Genel bakış 0.4 sayısal diyafram açıklığı ile 10X objektif kullanarak zaman atlamalı serisi, sonuçlarımızı doğruladı, Bcl11a mutant projeksiyon nöronları radyal göç kusurları var. 36 saat içinde birçok kontrol nöronu CP'ye göç ederken, sadece birkaç Bcl11a mutant nöronu IZ'den ayrılmış ve CP'ye göç etmişti. İlginçtir, birçok Bcl11a mutant nöronunun beynin pial yüzeyine doğru doğrudan göç etmediği, ancak göçü yavaşlattığı ve teğetsel olarak veya hatta ventriküle doğru döndüğü görülmektedir (Film 1). Bu bulguları daha ayrıntılı bir şekilde analiz etmek için sayısal açıklık 0.6 olan 40x'lik bir objektif kullanarak daha yüksek bir büyütme ile zamanaşımı serisi ürettik. Verilerimiz, Bcl11a mutant nöronlarının polarize olmadıklarını ve radyal olarak yönlendirilmiş migrasyona devam etmediklerini göstermektedirIyonu CP'ye sokun. 12 saat içinde bir çok Bcl11a mutant nöronu çok kutupludan iki kutuplu bir morfolojiye geçemedi ve bunun yerine pek çok işlemi öngörülen çevreye attı ve geri çekti (Film 2, Şekil 1A ).

Dahası, bireysel nöronların göç yollarını farklı zaman aralıklı serilerde izledik ve bunları göç eden nöronların spesifik parametrelerini hesaplamak için kullandık. Bcl11a mutant nöronlannın, birkaç saat süren, yavaşlayan migrasyon hızı ve rasgele benzeri oryantasyon değişiklikleri ile tekrarlayan fazlar geçirdiğini bulduk (Film 3; Şekil 1B , kırmızı ok uçları). Özellikle, Bcl11a mutant nöronlarının hız profili, kontrol nöronlarına kıyasla daha yüksek hızda (25 μm / saat) düşük hıza (5 μm / saat) doğru kaydırılmıştır ( Şekil 1C ). Buna paralel olarak, Bcl11'in genel göç hızıBir mutant nöronlar kontrollerde 10.34 ± 0.34 um / saat'den 6 ± 0.54 um / saate (p = 2.4889E-05) ( Şekil 1D ) önemli ölçüde düşmüştür. Son olarak, beynin pial yüzeyine yönlendirilmiş göçten sapma, Bcl11a mutant nöronlarında kontrol sırasında 17.15 ± 2.13 ° 'den 40.16 ± 4.42 °' ye anlamlı olarak artmıştır (p = 0.0002) ( Şekil 1E ). Bu sonuçlar birlikte, organotipik dilim kültüründe GFP elektroporasyona uğramış nöronların zaman kazanım konfokal görüntülemesinin, nöronal migrasyon sürecini denetleyen moleküler mekanizmaları incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Film 1: Kortikal Dilimlerde Bcl11a Mutant Nöronları ile Karşılaştırıldığında GFP Etiketli Kontrolün Geçişi. Bcl11a ^{flox / flox} beyinleri elektroporasyon yapıldıE14.5, IRES-GFP (A) ya da Cre-IRES-GFP'yi (B) içeren bir plasmid vektörü ile ve E16.5'de dilim kültürleri hazırlandı. VZ / SVZ; Ventriküler / subventriküler bölgeler; IZ, ara bölge; CP, korteks plakası. Ölçek çubuğu = 100 μm. Film, 5 çerçeve / s hızında 108 kareden oluşuyor. Wiegreffe ve diğerlerinden kopyalanmış . ¹⁰ Elsevier'den izin alınarak. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Film 2: Kortikal Dilimlerde Bcl11a Mutant Nöronlarına Karşı Bir GFP Etiketli Kontrolün Polarizasyonu. Bcl11a ^{flox / flox} beyinleri ^E14.5'te IRES-GFP (A) veya Cre-IRES-GFP (B) içeren bir plasmid vektörü ile elektroporasyona tabi ^tutuldu ve dilim kültürleri E16.5'te hazırlandı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Film, 5 çerçeve / s hızında 25 kareden oluşuyor. Wiegreffe ve diğerlerinden kopyalanmış . ¹⁰ Elsevier'den izin alınarak. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Film 3: Temsilci Kontrolün ve Bcl11a Mutant Nöronlarının 1 Saat Aralığında Çözünürlü Hareketli İzler. Göç eden nöron izleri, E14.5'te IRES-GFP ( A ) veya Cre-IRES-GFP ( B ) içeren bir plazmid vektörü ile elektroporasyona tabi ^tutulmuş Bcl11a ^{flox / flox} beyin E16.5 dilim kültürlerinin zaman geçme serisinden elde edildi. . Ölçek çubuğu = 20 μm. Wiegreffe ve diğerlerinden kopyalanmış .Elsevier'den izin alınarak 10'dan fazla. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Şekil 1: Bcl11a Mutant Üst Katmanlı Kortikal Nöronların Geçiş Davranışı.
( A ) 12 saat toplam görüntüleme süresi boyunca Cre-IRES-GFP veya bir kontrol vektörü ile ^E14.5'te elektroporasyona tabi ^tutulan Bcl11a ^{flox / flox} beyinlerinden E16.5 dilim kültürlerinde GFP pozitif nöronlarının göç eden temsilcisi görüntüleri. ( B ) Cre-IRES-GFP ile ^E14.5'te elektroporasyona tabi ^tutulan Bcl11a ^{flox / flox} beyinlerinden E16.5 dilim kültürlerinde GFP pozitif nöronlarını göç eden 1 saat arayla izleyen temsilci izleri veya toplam görüntüleme süresi boyunca bir kontrol vektörü22 saate kadar. Bcl11a mutant nöronları, sık sık, azaltılmış migrasyon hızındaki tekrarlayan fazlara ve rastgele değişen oryantasyona (kırmızı ok kıvrımları ile işaretlenmiştir) uğrar. ( C ) B'de gösterildiği gibi göç eden nöron izlerinden hesaplanan hız profilleri ( DE ) Bcl11a ^{flox / flox'ten} E16.5 dilim kültürlerinde göç eden GFP pozitif nöronlarının radyal yönünden ( E ) hızın ( D ) ve sapma açısının ^{nicelendirilmesi} E14.5'te Cre-IRES-GFP veya bir kontrol vektörü (n = 15) ile elektroporasyona tabi tutulan beyinler. Ortalama ± sem; Öğrencinin t testi; *** p <0.001. Ölçek çubuğu = 10 μm. Wiegreffe ve diğerlerinden kopyalanmış . ¹⁰ Elsevier'den izin alınarak. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Radyal göç, neokorteks gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu sürecin farklı adımlarını etkileyen genlerdeki mutasyonlar, lissensefali ve beyaz cevher heterotopisi gibi ağır kortikal malformasyonlara neden olabilir ^{1 , 2} . Geçtiğimiz günlerde genç göç eden kortikal projeksiyon nöronlarında ifade edilen Bcl11a'nın radyal göçte rol oynadığını gösterdik. Aktif nöronlarda Bcl11a'nın genetik olarak silinmesinin kutuplaşma ve migrasyon kusurlarına neden olduğunu doğrudan göstermek için akut kortikal elektroporasyonlu beyin dilimlerindeki nöronların zaman-lapse konfokal görüntülemesini kullandık. Zaman atlamalı dizi bireysel nöronların geçiş yollarını takip ve nöronlar göç hız profilleri, ortalama geçiş hızı ve göç yönü ¹⁰ de dahil olmak üzere belirli parametrelerini hesaplamak için kullanıldı.

Bu protokol, molekülün incelenmesinde önemli bir yaklaşımı tanımlamaktadır.Radyal göç mekanizmaları. Kısa saç tokası RNA veya DNA ekspresyon plazmidlerini kullanarak, sırasıyla ilgili herhangi bir gen knocked down veya aşırı ifade edilebilir. Elektroporasyonu Cre-LoxP sistemi ile birleştirmek için güçlü bir yaklaşımdır. Koşullu mutant ("floxed") farelerin beyinlerinin Cre recombinase ile transfekte edilmesi, bir mozaik mutant durum oluşturur ve vahşi tipli hücrelerle çevrili tek mutant nöronların seçici analizine izin verir. Bu şekilde, göç eden nöronlardaki hücre özerk moleküler mekanizmaları araştırılabilir. Ayrıca, fonksiyonel kurtarma deneyleri kolayca yapılır. Elektroporasyona tabi tutulmuş beyin dilimlerinin zaman aşımı dizisini hazırlamak, sabit beyin bölümlerinden elde edilenden çok daha fazla bilgi sağlayan tek göç eden nöronların göç davranışlarını dinamik olarak analiz etmeyi sağlar. Utero elektroporasyonunda ^{3 , 4} ilk eğitim gerektirir ^, ancak - bir kez hakim olunca -In vivo olarak serebral korteksin nöronlarını tekrarlanabilir bir şekilde transkripsiyon yapmak için hızlı ve basit bir teknik. Burada açıklanan protokolde, doğuştan gelen üst katmanlı neokortikal projeksiyon nöronları doğduğunda, E14.5'te utero elektroporasyonda kullanılmıştır. Utero elektroporasyon erken doğmuş derin katmanlı projeksiyon nöronlarının çalışma için erken gelişim aşamasında (yani E12.5) ¹³ üzerinde gerçekleştirilen alınması şarttır. Prensipte, protokol, interneononlar ¹⁴ ve serebellar granül hücreler ^15'in göçü de dahil olmak üzere, elektroporasyon ile transfekte edilebilen beyindeki diğer nöronal alt popülasyonların göçünü incelemek için kullanılabilir.

Açıklamış olduğumuz dilim kültürü protokolü Polleux ve Gosh ^12'den uyarlanmıştı ve daha önce, bunu ex utero elektroporasyon ^{16 , 17} için kullanmıştıkDy hipokampal gelişim. En önemlisi, beyin dilimleri, uygulanabilirliklerini korumak için prosedür boyunca dikkatle ele alınmalıdır. Bir hücre kültürü parçasına dayanan dilim kültürünü imgelemek için ters çevrilmiş mikroskop ve optik kalite cam alt tabaklar kullanıyoruz. Bu konfigürasyon kurulumu çok kolaydır ve steril koşullara izin verir, çünkü objektif dilim kültürü veya ortamıyla hiçbir zaman bağlantı kurmaz. Bununla birlikte, yeterince yüksek sayısal açıklık (0.6 veya daha yüksek) ile uzun çalışma mesafesi hedefleri (> 2 mm) gereklidir. Diğer çalışmalar beyin dilimini doğrudan cam altına yerleştirdi ve dilimi yerinde sabitlemek için ^{18 , 19} kollajen matrisi kullandı, bu da mümkün olan daha kısa bir serbest çalışma mesafesine sahip hedeflerin kullanılmasını sağladı. Bununla birlikte, hücre kültürü insertleri kullanımı kolay kullanım, tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve araştırmacının dilimleri,Beyin diliminin yaşayabilirliğini tehlikeye sokma (veriler gösterilmemiştir). Bir başka kritik konu, dilimlerin lazer ışığıyla hasar görmesi ile ilgilidir. Hassas hibrid dedektörü kullandık ve bu da zaman atlamalı görüntüleme için yeterli floresan sinyalleri elde ederken lazer gücünü minimuma indirmemizi sağladı. Çok ışıklı görüntüleme kullanılması, fotodarmayı daha da düşürebilir ve konvansiyonel konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında daha derin bir doku penetrasyonunun yanı sıra daha etkili ışık algılamasına izin verecektir.

Nöronal göçü incelemek için kullanışlı olmasına rağmen, protokolün sınırları vardır ve bozulmamış beyindeki göç eden nöronların durumunu tamamen koruyamaz. Ekstrasellüler matriks, yapışkan hücreler arası kontaklar ve göç bölgesi içerisindeki damar sistemi, radyal olarak göç eden nöronları ^{20 , 21} dinamik olarak etkileyebilir. Spesifik olarak, üst katman nöronları, uzunlamasına radyal glial süreçlereGöçleri ²² . Başarılı görüntüleme için süreçlerini tüm korteks genişliği boyunca genişleten GFP elektroporasyona uğramış radyal glial hücrelerle beyin dilimlerini seçmek önemlidir. Radial glial iskeletinin beynin pial yüzeyine ulaşmadan kesildiği "Oblik kesitleri" daha ileri analizlerden yoksun bırakılmalıdır. Bazen, hücre ölümü, görüntü alımını numunedeki daha derin bölgeye sınırlayan beyin diliminin hava yüzeyinde meydana gelebilir. Kültürlenmiş beyin dilimlerindeki elektroporasyonlu nöronlar , in vivo olarak elektroporasyona uğramış nöronlara kıyasla daha az verimli şekilde göç edebilir; bu durum, preparasyondan yeteri kadar iyileşmeyebilir. Bu, hem deneysel hem de kontrol durumları için birden çok dilim kültürünün analizini ve temsili veri kümelerini eleştirel bir biçimde yorumlamayı gerektirir. Bazı durumlarda, utero elektroporasyon ile ilişkili hakaretler, embriyonik ölüm veya yapısal değişikliklere neden olabilirBeyin iyonları, genişlemiş ventriküller, asimetrik olarak inceltilmiş korteks veya DNA enjeksiyonundan kaynaklanan bir glial skar oluşumu dahil. Bu gibi durumlarda, numune daha ileri analizlerden çıkarılmalıdır.

Embriyonik donörlerdeki beyin dilimleri membran ekleri ²³ üzerinde iyi bir şekilde ayakta kalırken, analizler nöronal migrasyon da dahil olmak üzere erken gelişme olaylarıyla sınırlıdır ve daha sonraki olayları, örneğin dendrit gelişimi veya sinaptojenez gibi incelemek için kullanmadık. Özetle, sinir gelişimi bozukluklarında yer alan genlerin fonksiyonlarını analiz etmek üzere kolayca adapte edilebilen, dilim kültürlerindeki elektroporasyonlu nöronların nöronal göçünü doğrudan ve dinamik olarak incelemek için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Yararlı tartışmalar için Jacqueline Andratschke, Elena Werle, Sachi Takenaka ve Matthias Toberer'a mükemmel teknik yardım ve Victor Tarabykin'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgamesinschaft'ın SB'ye (BR-2215) verilmesi ile desteklendi.