זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות

פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.

ב electroporation ברחם היא גישה מהירה ורבת עוצמה ללמוד את תהליך ההגירה רדיאלי בקליפת המוח של פיתוח עוברי העכבר. זה עזר לתאר את השלבים השונים של הגירה רדיאלי ולאפיין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליך זה. כדי לנתח באופן דינמי באופן דינמי נוירונים נודדים הם צריכים להיות עקבות לאורך זמן. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשלבת electroporation ברחם עם תרבות פרוסות organotypic זמן הדמיה confocal confocal, המאפשר בדיקה ישירה וניתוח דינמי של נוירונים קליפתיים נודדים. יתר על כן, אפיון מפורט של נוירונים נודדים, כגון מהירות הגירה, פרופילים מהירות, כמו גם שינויים אוריינטציה רדיאלי, אפשרי. השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת לבצע ניתוחים פונקציונליים של גנים של עניין נוירונים קליפת המוח נודדים רדיאלי ידי הפסד ורווח של פונקציה, כמו גם ניסויים הצלה. זמן לשגותהדמיה של נוירונים נודדים היא טכניקה המדינה- of-the-art שפעם הוקמה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של קליפת המוח במודלים העכבר של הפרעות הגירה עצביים.

הניאוקורטקס הוא האתר המרכזי של תפקודים קוגניטיביים, רגשיים וסנסוריים-מוטוריים. הוא מורכב משש שכבות אופקיות המכוונות במקביל אל פני השטח של המוח. במהלך התפתחות תאים אב בקיר לרוחב של telencephalon הגבי לעורר נוירונים הקרנה כי נודדים באופן רדיאלי לעבר פני השטח pial ולרכוש שכבת סוג ספציפי נוירונים זהות. לאחר שנוצר באזורים חד חדרית / subventricular (VZ / SVZ) נוירונים אלה הופכים רב קוטביים transiently ו להאט את ההגירה שלהם. לאחר שהייה קצרה באזור הביניים (IZ) הם עוברים למורפולוגיה דו קוטבית, נצמדים לגרדום הגליה הרדיאלי, וממשיכים בהגירה מכוונת רדיאלית לצלחת הקליפתית (CP). כאשר מגיעים היעד הסופי שלהם נוירונים הקרנה לנתק מן התהליכים גליה רדיאלי לרכוש זהות ספציפית שכבת. מוטציות בגנים המשפיעות על שלבים שונים של הגירה נוירונים יכולים לגרום למום קליפת המוח חמורה, כגון lissencEphaly או חומר לבן heterotopia ^{1 , 2} .

ב electroporation ברחם היא טכניקה מהירה וחזקה transfect תאים עצביים עצביים במוח המתפתח של עוברי מכרסם ^{3 , 4} . בעזרת טכניקה זו ניתן מציאה ו / או overexpress גנים של עניין על מנת ללמוד את הפונקציות שלהם בפיתוח נוירונים. שיטה זו סייעה במיוחד לתאר את הפרטים המורפולוגיים ולאפיין את המנגנונים המולקולריים של תהליך ההגירה הרדיאלית ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} . נוירונים נודדים באופן קיצוני עוברים שינויים דינאמיים בצורת התא, מהירות ההגירה, וכן כיוון הנדידה, הדורשים תצפית ישירה ורציפה לאורך זמן. אורגנוטיפ פרוסה cultuמחדש זמן לשגות confocal הדמיה של המוח electroporated לאפשר לצפות ישירות נוירונים נודדים לאורך זמן. באמצעות גישה זו בשילוב, ניתן לנתח תכונות שונות של נוירונים נודדים כי לא ניתן לחקור בקטעי רקמה קבועה של המוח electroporated.

לאחרונה החלת הדמיה confocal זמן לשגות של נוירונים נודדים בתרבויות פרוסה של המוח electroporated ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק B תא CLL / לימפומה 11a (Bcl11a) במהלך פיתוח קליפת המוח ¹⁰ . Bcl11a מתבטאת נוירונים בקליפת המוח נודדים צעירים והשתמשנו אלל Bcl11a מוטציה מותנה ( Bcl11a ^flox ) ¹¹ ללמוד את תפקידיו. Electroporation של recombinase Cre יחד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך אבות קליפת המוח של המוח Bcl11a ^{flox / flox} מותר לנו ליצור מצב מוטציה פסיפס, שבו רק תאים מעטים הם מוטציה באחרת wild-type רקע. בדרך זו, ניתן היה ללמוד תאים אוטונומיים פונקציות של Bcl11a ברמת התא בודד. מצאנו כי Bcl11a נוירונים מוטציה להציג מהירות מופחתת, שינויים פרופילים מהירות שלהם, כמו גם שינויים בכיוון אקראי במהלך המעבר שלהם ¹⁰ . בפרוטוקול המתואר אנו מתארים זרימת עבודה עבור electroporation מוצלח פרוסה הכנה תרבות ¹² של המוח עכבר, כמו גם זמן לשגות הדמיה confocal של תרבויות פרוסה קליפת המוח.

כל הניסויים הניסויים אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי חיים (Regierungspräsidium Tübingen) ו בוצעו על פי חוק בעלי חיים הגרמני הרווחה ואת הדירקטיבה של האיחוד האירופי 2010/63 / האיחוד האירופי.

1. ב Electrooration Utero

1. מחטים microinjection
   1. משוך את נימי זכוכית בורוסיליקט (קוטר חיצוני: 1.0 מ"מ, קוטר פנימי: 0.58 מ"מ, אורך: 100 מ"מ) לתוך מחטים microinjection באמצעות משיכה micropipette עם נימה תיבת (2.5 מ"מ x 2.5 מ"מ) ואת התוכנית הבאה: HEAT: 540, PULL : 125, מהירות: 20, ו DELAY: 140. לקבוע את הערך HEAT עבור כל נימה בודדים על ידי ביצוע בדיקה RAMP (ערך HEAT: RAMP + 25).
   2. מחטים משופעים בזווית של 38 מעלות ומהירות בינונית למהירות גבוהה עם microgrinder להשיג גודל טיפ של 20 עד 30 מיקרומטר להזרקת ביום עובריים (E) 13.5 או צעיר 30-40 מיקרומטר להזרקת עובריים מבוגריםשלבים. לאחסון, לתקן מחטים בתיבה או צלחת פטרי עם חימר דוגמנות כדי למנוע נזק עצות.
2. פתרון דנ"א פלסמיד
   1. הכן מבנה DNA פלסמיד המכיל חלבון הכתב ניאון ( למשל GFP) באמצעות ערכת ההכנה מקסי ללא endotoxin על פי הוראות היצרן.
   2. לדלל את הפתרון DNA פלסמיד לריכוז סופי של 1 - 2 מיקרוגרם / μL במאגר טריס-EDTA ללא אנדוטוקסין המכיל חיץ מהיר בריכוז סופי של 0.01%. פתרון Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
3. תמיסת כלוריום נתרן כלורי
   1. הכן תמיסת נתרן bacteriostatic כלוריד על ידי הוספת אלכוהול בנזיל לריכוז סופי של 0.9% איזוטוני 0.9% נתרן כלורי פתרון. פתרון מסנן סטרילי מיד לפני השימוש.
4. Carprofen הזרקת פתרון
   1. הכן פתרון הזרקת carprofen על ידיהוספת carprofen לריכוז סופי של 0.5 מ"ג / מ"ל ​​כדי איזוטוני סטרילי 0.9% נתרן כלוריד פתרון. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 28 ימים.
5. הרדמה, הזרקת דנ"א, ו electroporation
   1. לשקול E14.5 העכבר מתוזמן בהריון ומניחים אותו לתוך חדר הרדמה שקוף מחובר מאדה רווי 5% isoflurane. כאשר בעל החיים הוא מחוסר הכרה, להעביר אותו מסכה הרדמה מחובר צלחת החימום 37 ° C ולשמור אותו הרדים עם 1.8 - 2.2% isoflurane.
      הערה: להעריך את הפיתוח של הרדמה כירורגית על ידי אובדן צביטה זנב רפלקסים פדלים (קמצוץ אצבע).
   2. עבור משכך כאבים, להזריק 100 μL של פתרון הזרקת carprofen לכל 10 מ"ג של bodyweight העכבר (5 מ"ג / ק"ג bodyweight) תת עורית. הפעל את העכבר עם הגב שלה למטה בזהירות לכסות את העיניים עם ג'לי נפט כדי למנוע מהם להתייבש.
   3. לפרוש בעדינות את הגפיים ולתקן אותםלצלחת ההתחממות עם קלטת כירורגית. לעקר את הבטן עם אתנול 70% ואחריו פתרון יוד (7.5 מ"ג / מ"ל) באמצעות צלחות תאית. חזור על הליך זה שלוש פעמים כדי להבטיח חיטוי נכון.
   4. מכסים את הבטן עם גזה סטרילית שבה חתך כבר לחתוך כדי לחסוך שדה (בקוטר: 2 - 2.5 ס"מ) על החתך בטן. לחלח את גזה עם תמיסת כלוריום נתרן כלורי.
      זהירות: להעריך מחדש את הפיתוח של הרדמה כירורגית על ידי אובדן רפלקס הדוושה.
   5. באמצעות Micro adson מלקחיים (משונן, אורך: 12 ס"מ) ומספריים יפים (זווית לצד, אורך: 9 ס"מ) לחתוך את העור כ 1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הבטן. חותכים את השריר הבסיסי לאורך alba linea.
   6. הסרת קרן רחם אחת עם מלקחיים טבעת (אורך: 9 ס"מ, קוטר חיצוני: 3 מ"מ, קוטר פנימי: 2.2 מ"מ) בעדינות למקם אותו על גזה לח.
      זהירות: החזק את קרן הרחם עם מלקחיים טבעת רק בין עוברים אד לא להפריע את השליות או כל ספינות האספקה. שמור את הרחם לחה בכל עת עם תמיסת כלוריום נתרן כלורי.
   7. בזהירות מיקום העובר עם מלקחיים טבעת לאתר את החדר לרוחב, אשר מציג כמו צל בצורת סהר במקביל הסינוס sagittal. אתר ההזרקה נמצא בערך באמצע קו בין העין הפיגמנטית לבין מפגש הסינוסים, שם ענפים הסינוטאלים לשני סינוסים רוחביים. לדחוף את המחט microinjection דרך קיר הרחם לתוך החדר לרוחב.
      הערה: אם יש צורך, את עומק הזרקת ניתן לתקן על ידי ביטול של המחט.
   8. להזריק 1 עד 2 μL של פתרון ה- DNA לתוך החדר לרוחב עם microinjector, אשר מופעל עם דוושת רגל, באמצעות ההגדרות הבאות: 25 psi, 10-20 ms לכל הדופק, ו 5 עד 10 פעימות. הזרקת מוצלח יכול להיות פיקוח על ידי פתרון ה- DNA צבעוניים, אשר צריך למלא את מערכת החדר.
   9. מקום אלקטרודות פינצטה סוג (3 מ"מ קוטר E13.5 או צעיר יותר ו 5 מ"מ קוטר E14.5 או יותר) בצורה כזו כי הטרמינל "חיובי" נמצא באותו צד כמו החדר מוזרק ואת "שלילי" הטרמינל נמצא בצד הנגדי של החדר המוזרק מתחת לאוזן ראש העובר.
   10. לחלחל את אתר electroporation עם כמה טיפות של תמיסת כלוריום נתרן כלורי ולהחיל 5 פולסים זרם חשמלי (35 V עבור E13.5 או צעיר יותר 40 V עבור E14.5 או יותר) של 50 ms משך עם 950 ms intervals.
       הערה: זרמים של 60 עד 90 mA הם בדרך כלל מספיק electroporation מוצלח. זרמים תחתונים לא יעברו ביעילות נוירונים, בעוד שזרמים גבוהים יותר עלולים להוביל למוות עוברי.
   11. חזור על ההליך (cf שלב 1.5.7 עד 1.5.10) עבור כל עובר של קרן הרחם בעדינות במקום חזרה לתוך חלל הבטן.
   12. הסר את קרן הרחם מהצד השני וחזור על procEdure המתואר בשלב 1.5.7. כדי 1.5.11.
   13. סגור את חלל הבטן על ידי suturing את שכבת השריר לפני תפירת העור באמצעות מלקחיים Micro Adson, מחט Mathieu מחזיק (טונגסטן קרביד, אורך: 14 ס"מ), תפר ניתוחים שאינם absorbable (3/8 מעגל, 13 מ"מ, נקודת להתחדד).
       זהירות: היזהר לא ללכוד את הרחם או כל איברים אחרים במהלך תפר.
   14. בזהירות לחטא את תפר העור עם תמיסת יוד (7.5 מ"ג / מ"ל) ו בעדינות להסיר עודף periocular של ג'לי נפט באמצעות ספוגית תאית. מניחים את העכבר מתחת מנורה אינפרא אדום עד שהוא מתעורר. בקפידה לעקוב אחר העכבר במהלך היומיים הבאים. חזור על טיפול כאבים כמתואר בשלב 1.5.2 לאחר 12 עד 24 שעות.

2. תרבות פרוסה Organotypic

1. פתרון Laminin צילומים
   1. ממיסים 1 מ"ג laminin lyophilized במים סטריליים כדי להשיג 1 מ"ג / מ"ל ​​laminin פתרון המניות. הכן 50 aliquots μL אחנות nd ב -80 ° C.
2. פולי- L- ליזין פתרון המניות
   1. ממיסים 50 מ"ג poly-L- ליזין במים סטריליים כדי לקבל 1 מ"ג / מ"ל ​​פולי L- ליזין פתרון המניות. הכן 0.5 מ"ל aliquots ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
3. תמיסת מלח מאוזנת מאוזנת של האנק (HBSS מלא)
   1. הכן HBSS מלאה על ידי שילוב של 50 מ"ל של פתרון HBSS 10x, 1.25 מ"ל של חיץ 1 M HEPES (pH 7.4), 15 מ"ל של 1 M פתרון D גלוקוז, 5 מ"ל של פתרון 100 מ"מ סידן כלוריד, 5 מ"ל של 100 מ"מ מגנזיום גופרתי פתרון, ו 2 מ"ל של 1 M נתרן מימן קרבונט פתרון. הוסף מים סטריליים עד 0.5 L, מסנן סטרילי, ואת החנות על 4 מעלות צלזיוס.
4. בינוני תרבות פרוסה
   1. משלב 35 מ"ל של ביגל בינוני הנשר (BME), 12.9 מ"ל מלאה HBSS (CF סעיף 2.3.1.), 1.35 מ"ל של 1 M גלוקוז D, 0.25 מ"ל של 200 מ"מ L- גלוטמין, 0.5 מ"ל של פניצילין סטרפטומיצין כדי להשיג 50 מ"ל של תרבות פרוסתבינוני. מסנן סטרילי ולהוסיף סרום הסוס לריכוז סופי של 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות.
5. נקודת התכה נמוכה (LMP) Agarose פתרון
   1. הכן 3% LMP פתרון agarose ידי המסת 1.5 גרם של agarose LMP ב 50 מ"ל של HBSS מלאה על ידי חימום בתנור מיקרוגל עבור 1 עד 2 דקות כוח ביניים.
      הערה: עקוב אחר החום בזהירות כדי למנוע גלישה במהלך הרתיחה.
   2. מניחים פתרון באמבט מים ב 38 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. חנות ב 4 ° C ושימוש חוזר פעם אחת.
6. ציפוי של ממברנה מוסיף
   1. הוסף אחד aliquot של פתרון המניות laminin (CF שלב 2.1.1.) ו aliquot אחד של פתרון מלאי פולי L- ליזין (CF שלב 2.2.1). כדי 6 מ"ל של מים סטריליים כדי להשיג פתרון ציפוי (מספיק עבור 6 מוסיף) .
   2. המקום מוסיף קרום לתוך צלחת 6-היטב המכיל 2 מ"ל של מים סטריליים בתחתית של כל באר. הוסף 1 מ"ל של פתרון ציפוי(SF שלב 2.6). על גבי כל קרום ו דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני אווירה.
      הערה: רק להשתמש עם מוסיף קרום ברור אופטית, כגון הממברנה polytetrafluoroethylene (PTFE).
   3. לשטוף את הממברנות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של מים סטריליים יבש. השתמש קרום מצופה באותו יום או חנות בצלחת נקייה 6-באר ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות.
7. ניחוח המוח והטבעה
   1. יומיים לאחר electroporation מקום העכבר לתוך תא שקוף מחובר מאדה רווי 5% isoflurane. כאשר בעל החיים הוא מחוסר הכרה, להסיר אותו מן החדר להקריב אותו על ידי נקע צוואר הרחם.
   2. הסר את הרחם המכיל את העוברים ומניחים אותו לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ עם HBSS קר כקרח.
      הערה: מנקודה זו ואילך לשמור את כל הפתרונות, העוברים, ואת המוח על הקרח.
   3. השתמש stereomicroscope, בסדר מלקחיים מלקחיים (ישר,11 ס"מ) ו זוג ואנאס Tübingen מספריים האביב (בזווית כלפי מעלה, אורך: 9.5 ס"מ) להפריד כל העובר מן הרחם ולהעביר אותו צלחת פטרי אחר המכיל HBSS קר כקרח מלא.
   4. לעשות חתך ברמה של גזע המוח לחתוך לאורך קו האמצע sagittal. לקלף את העור ואת הסחוס מכסה את המוח. לאחר מכן, לחתוך את גזע המוח ממש מאחורי ההמיספרות ולהסיר את המוח מן הגולגולת. מעבירים את המוח עם spatula כף מיקרו (185 מ"מ x 5 מ"מ) לצלחת 12 גם המכיל HBSS קר כקרח. לאסוף את כל המוח מן המלטה בצלחת 12 גם.
   5. השתמש stereomicroscope פלואורסצנטי למסך את המוח בצלחת 12 גם עבור בהירות הקרינה, כמו גם את גודל האזור electroporated. בחר 2 עד 4 מוחות עם אותות ניאון בהירים בקורטקס סומטו-סנסורי משוער לעיבוד נוסף.
   6. יוצקים 3% LMP פתרון agarose שמרו על 38 מעלות צלזיוס לתוך קילוף משם עובש חד פעמי ההטבעה. מסירE מהצלחת 12-היטב עם spatula כף זעיר בזהירות לנקז HBSS עודף המוח סביב המוח באמצעות נייר רקמות דק.
   7. מניחים את המוח בעדינות לתוך הפתרון agarose, לדחוף אותו לתחתית של התבנית, בזהירות להתאים את מיקומו באמצעות מחט 20-מד. עבור קטעים העטרה, לכוון את המוח עם נורות חוש הריח הצבעה כלפי מעלה. שמור על עובש על הקרח עד הפתרון agarose הוא solidified ולהמשיך עם חתך את המוח.
8. Vibratome חתך תרבות פרוסה
   1. הסר את בלוק agarose מן התבנית ומניחים אותו על המכסה של צלחת פטרי סטרילי. חתוך משם agarose עודף עם להב גילוח נקי משאיר כ 2 עד 3 מ"מ מתחת נורות חוש הריח ו 1 מ"מ של agarose על הצדדים האחרים. תקן את בלוק agarose חתוך עם נורות חוש הריח הצבעה כלפי מטה לשלב הדגימה באמצעות דבק cyanoacrylate.
      הערה: לעקר מכשירים וציוד עם אתנו 70%לפני החתך.
   2. מעבירים את הבמה הדגימה לתא חיתוך של מיקרואטום הלהב רוטט המכיל HBSS קר כקרח מלא למקם את המוח עם הצד הגבי שלה לעבר הלהב. חותכים 250 פרוסות מוח עבה מיקרומטר המכיל את האזור electroporated עם משרעת נמוכה עד בינונית של 0.9 מ"מ מהירות חתך איטית מאוד של 0.09-0.12 מ"מ / ש. בדרך כלל 4 עד 6 פרוסות עם אות ניאון בהיר מתקבלים מכל מוח electroporated בהצלחה.
   3. עם כפית כפית מיקרו כפוף ואת מלקחיים בסדר טים, בזהירות להעביר את פרוסות המוח עם agarose שמסביב על צלחת 6-היטב המכיל HBSS קר כקרח.
      זהירות: היזהר לא לפגוע ברקמת המוח על ידי רק נוגע שפת agarose סביב הקטעים עם מלקחיים במהלך ההעברה.
   4. לעבד את כל המוח כפי שתואר בצעדים 2.8.1. 2.8.3.
   5. לחות מוסיף את הממברנה עם μL 100 של HBSS מלאה לפני הצבת sl את המוחעל הקרום כדי להקל על המיקום של הפרוסות. עד 5 פרוסות ניתן להציב על 1 להוסיף קרום.
   6. בזהירות להעביר את הפרוסות על הממברנות באמצעות כפית כפית מיקרו כפוף ואת מלקחיים בסדר טים. משוך בעדינות פרוסה על המרית על ידי נגיעה רק בשפת agarose עם מלקחיים בעדינות לדחוף את הפרוסה מן המרית על הממברנה. מקמו את הפרוסה באמצעות מלקחיים ולהמשיך להעביר את הפרוסות הנותרות. הסר HBSS מלא עודף עם פיפטה.
      הערה: אין לחפוף את הפרוסות זו לזו.
   7. בעזרת מלקחיים במקום בזהירות מוסיף את הממברנה עם פרוסות לתוך צלחת 6-היטב המכיל 1.8 מ"ל של המדיום תרבות פרוסה (SF שלב 2.4.1) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס ו 5% דו תחמוצת הפחמן האווירה עד לשגות זמן הַדמָיָה.

3. זמן לשגות הדמיה

1. הגדרת מיקרוסקופ
   1. הגדר תא האקלים להציב על הבמה שלמיקרוסקופ confocal הפוך ל 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני אווירה. השתמש גלאי היברידי כדי להפחית את עוצמת הלייזר ולשפר את הכדאיות התא. לניתוח מפורט, השתמש מרחק עבודה ארוך עוד 40X אובייקט יבש עם הצמצם המספרי של 0.6 או גבוה יותר.
      הערה: כל הרכיבים של המיקרוסקופ צריך להיות מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 3 שעות לפני הדמיה כדי לספק מוקד יציב במהלך תהליך ההדמיה.
2. פרוסה הדמיה
   1. בחר פרוסת המוח עבור הדמיה מהצלחת 6-היטב המכיל את הממברנה מוסיף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוכה.
      זהירות: הימנע זמן חשיפה ממושך לאור אולטרה סגול כמו זה עלול לגרום photodamage הסלולר.
      הערה: בחר פרוסה עם נוירונים בודדים בהירים SVZ העליון נודדים רדיאלית לעבר פני השטח pial של הפרוסה. תהליכי פלואורסצנט עדינים של תאי גלייה רדיאליים המקיפים את המחסום כולו מציינים פיגום גליה רדיאלי שלם,ד על ידי נוירונים בקליפת המוח נודדים.
   2. מעבירים את הכנס קרום עם פרוסה, אשר נבחרה עבור הדמיה זמן לשגות, לתוך קוטר 50 מ"מ תחתית זכוכית המכיל 2 מ"ל של המדיום תרבות פרוסה בעזרת מלקחיים. מניחים את הצלחת לתוך תא האקלים של המיקרוסקופ confocal.
   3. הגדר את הרזולוציה 512 על ידי 512 פיקסלים ולהגדיל את מהירות הסריקה מ 400 הרץ ל 700 הרץ כדי להגדיל את שיעור המסגרת מ כ 1.4 על כ 2.5 מסגרות לשנייה, בהתאמה. השתמש לא יותר משתי פעמים בממוצע. הגדרת z- מחסנית דרך באזור electroporated (בדרך כלל 400-100 מיקרומטר) עם צעד צעד של 1.5 מיקרומטר. קולקטיבית, הגדרות אלה מאפשרים רזולוציה בהירות מספיק של התמונה תוך שמירה על photodamage נמוך במהלך הרכישה. הפעל את זמן לשגות בסדרה על ידי לקיחת z- מחסנית כל 30 דקות.
      הערה: חשיפה ממושכת של הפרוסה לאור לייזר יגרמו photodamage הפחתת הכדאיות של התאים. התאם את expOSure זמן לאור לייזר בהתאם.
   4. ניתוח זמן לשגות בסדרה באמצעות ImageJ תוכנה (https://imagej.nih.gov/iij/) או שווה ערך.

בעבר, הראינו כי מחיקת גנטית של Bcl11a על ידי electroporation ברחם פוגעת הגירה רדיאלי של נוירונים הקרנה העליונה שכבת הישרדות ¹⁰ . Electroporation של דנ"א פלסמיד וקטור המכיל Cre-IRES-GFP נמחק ביעילות Bcl11a מותנה Bcl11a פלוקס ^/ המוח פלוקס ¹¹ . כאשר ניתחנו את המוח E14.5 electroporated שלושה ימים לאחר electroporation, נוירונים שליטה ביותר היגרו לתוך CP, בעוד רבים Bcl11a נוירונים מוטציה היו תקועים לאורך נתיב הנדידה ב IZ ו VZ / SVZ. יתר על כן, מצאנו עלייה במספר תאים רב קוטביים על חשבון תאים דו קוטביים במיוחד ב- IZ על מחיקת Bcl11a המציע פגמים בקיטוב ¹⁰ .

כדי לנתח באופן דינמי באופן דינמי Migraהתנהגות טורי של Bcl11a נוירונים מוטציה השתמשנו זמן לשגות הדמיה confocal של נוירונים נודדים בתרבות פרוסה organotypic מוכן מ המוח electroporated. סקירה סדרת זמן לשגות באמצעות מטרה 10X עם הצמצם המספרי של 0.4 אישרו את התוצאות שלנו, כי Bcl11a נוירונים הקרנה מוטציה יש פגמים במעבר רדיאלי. בתוך 36 שעות נוירונים שליטה רבים היגרו לתוך CP, ואילו רק כמה נוירונים BCL11a מוטציה עזב את IZ והיגרו לתוך המחסום. מעניין, נראה כי Bcl11a נוירונים מוטציה רבים לא נודדים ישירות לכיוון השטח pial של המוח, אבל האט את ההגירה והפך משיק או אפילו בחזרה לכיוון החדר (סרט 1). כדי לנתח עוד ממצאים אלה יצרנו זמן לשגות סדרה בהגדלה גבוהה יותר באמצעות מטרה 40x עם צמצם המספרי של 0.6. הנתונים שלנו מראים כי Bcl11a נוירונים מוטציה נכשל לקטב ביעילות להמשיך migrat בכיוון רדיקלייון לתוך המחסום. בתוך 12 שעות, נוירונים רבים של Bcl11a מוטנטים לא הצליחו לעבור ממולקולה דו-קוטבית למורפולוגיה דו-קוטבית, ובמקום זאת הוקרבו ותהפכו תהליכים רבים לסביבה (סרט 2, איור 1 א ' ).

יתר על כן, אנו עקבות נתיבי הגירה של נוירונים בודדים בסדרה זמן לשגות שונים השתמשו אלה לחשב פרמטרים ספציפיים של נוירונים נודדים. מצאנו כי Bcl11a נוירונים מוטציה שוב ושוב עוברים שלבים של משך זמן כמה עם ירידה מהירות הגירה אקראית כמו שינויים בכיוון (סרט 3, איור 1B , ראשי חץ אדום). בפרט, פרופיל המהירות של Bcl11a נוירונים מוטציה הועבר מ במהירות גבוהה יותר (25 מיקרומטר / שעה) לעבר מהירות נמוכה יותר (5 מיקרומטר / שעה) בהשוואה נוירונים שליטה ( איור 1 ג ). בקנה אחד עם זה, המהירות הכוללת הגירה של Bcl11נוירונים מוטציה הופחת באופן משמעותי מ 10.34 ± 0.34 מיקרומטר / שעה בשליטה ל 6 ± 0.54 מיקרומטר / שעה (p = 2.4889E-05) ( איור 1D ). לבסוף, החריגה מהגירה מכוונת אל פני השטח החיוורים של המוח עלתה באופן משמעותי מ -17.15 ± 2.13 ° בשליטה ל -40.16 ± 4.42 מעלות בתאי נוזל Bcl11a (p = 0.0002) ( איור 1E ). יחד התוצאות הללו מראים כי הדמיה confocal זמן לשגות של נוירונים electroporated GFP בתרבות פרוסת organotypic היא שיטה חשובה ללמוד מנגנונים מולקולריים השולטים בתהליך של הגירה נוירונים.

סרט 1: הגירה של GFP תווית בקרה בהשוואה Bcl11a נוירונים מוטציה פרוסות קליפת המוח. Bcl11a ^{flox /} המוח ^flox היו electroporated בE14.5 עם וקטור פלסמיד המכיל IRES-GFP (א) או Cre-IRES-GFP (ב) ותרבויות פרוסה הוכנו ב E16.5. VZ / SVZ; אזורי חדר / תת-שטחיים; IZ, אזור ביניים; CP, צלחת קליפת המוח. סולם בר = 100 מיקרומטר. הסרט מורכב של 108 מסגרות בקצב של 5 מסגרות / s. נדפס מויגרפה ואח '. ¹⁰ ברשותו של אלסבייר. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

סרט 2: קיטוב של GFP תווית בקרה בהשוואה Bcl11a נוירונים מוטציה פרוסות קליפת המוח. Bcl11a ^{flox / flox} המוח היו electroporated ב E14.5 עם וקטור פלסמיד המכיל IRES-GFP (א) או Cre-IRES-GFP (ב) ותרבויות פרוסת היו מוכנים ב E16.5. סולם בר = 10 מיקרומטר. הסרט מורכב מ 25 מסגרות בקצב של 5 מסגרות / ים. נדפס מויגרפה ואח '. ¹⁰ ברשותו של אלסבייר. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

סרט 3: עקבות אנימציה עם שעה 1 החלטה מרווח של שליטה נציג Bcl11a נוירונים מוטציה. עקבות נוירונים נודדים התקבלו מסדרת זמן לשגות של תרבויות E16.5 פרוסה של Box11 פלוקס ^{/ flox} המוח שהיו electroporated ב E14.5 עם וקטור פלסמיד המכיל IRES-GFP ( A ) או Cre-IRES-GFP ( ב ) . סולם בר = 20 מיקרומטר. נדפס מויגרפה ואח '.> 10 ברשותו של Elsevier. לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד).

איור 1: התנהגות הגירה של Bcl11a מוטציה עליון שכבתית נוירונים קליפתיים.
( א ) תמונות נציג של נוירונים נודדים נודדים חיובי בתרבויות E16.5 פרוסה מ Bcl11a ^{flox /} המוח פלוקס electroporated ב E14.5 עם Cre-IRES-GFP או וקטור שליטה על פני תקופת הדמיה כוללת של 12 שעות. ( ב ) נציג עקבות עם רזולוציה 1 שעה מרווח של נוירונים נודדים נודדים חיובית בתרבויות E16.5 פרוסה מ Bcl11a ^{flox /} המוח פלוקס electroporated ב E14.5 עם Cre-IRES-GFP או וקטור שליטה על פני תקופות הדמיה כוללת שלעד 22 שעות. Bcl11a נוירונים מוטציה לעתים קרובות לעבור שלבים חוזרים של מהירות הגירה מופחתת שינוי באוריינטציה אקראית (מסומן על ידי ראשי חצים אדומים). ( ג ) מהירות פרופילים מחושב על ידי עקבות של נוירונים נודדים כפי שמוצג ב B. ( DE ) כימות המהירות ( D ) ו זווית זווית מן הכיוון רדיאלי ( E ) של נוירונים נודדים נודדים חיובית בתרבויות E16.5 פרוסה מ Bcl11a ^{flox / flox} המוח electroporated ב E14.5 עם Cre-IRES-GFP או וקטור שליטה (n = 15). ממוצע ממוצע; סטודנט של מבחן; *** p <0.001. סולם בר = 10 מיקרומטר. נדפס מויגרפה ואח '. ¹⁰ ברשותו של אלסבייר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

הגירה רדיאלית היא תהליך מפתח בפיתוח הניאוקורטקס. מוטציות בגנים המשפיעים על שלבים שונים של תהליך זה יכולים לגרום מומים קשים בקליפת המוח, כולל lissencephaly ו heterotopia חומר לבן ^{1 , 2} . לאחרונה הראינו כי Bcl11a, אשר באה לידי ביטוי צעירים נודד נוירונים קליפת המוח, משחק תפקיד הגירה רדיאלי. השתמשנו זמן לשגות הדמיה confocal של נוירונים נודדים פרוסות קליפת המוח חריפה של המוח electroporated כדי להוכיח ישירות כי המחיקה הגנטית של Bcl11a נוירונים נודדות גורמת קיטוב פגמים הגירה. זמן לשגות בסדרה שימשו כדי לעקוב אחר נתיבי הגירה של נוירונים בודדים ולחשב פרמטרים ספציפיים של נוירונים נודדים, כולל פרופילים מהירות, מהירות הגירה ממוצעת, ואת הכיוון נודדות ¹⁰ .

פרוטוקול זה מתאר גישה חשובה כאשר לומדים מולקולהR מנגנוני הגירה רדיאלי. באמצעות RNA סיכות קצרות או ביטוי DNA פלסמידים, כמעט כל גן של עניין יכול להיות דפק או overexpressed, בהתאמה. זוהי גישה רבת עוצמה לשלב electroporation עם Cre-LoxP המערכת. Transfection של המוח של מוטציה מותנה ("floxed") עכברים עם recombinase Cre יוצר מצב מוטציה פסיפס ומאפשר ניתוח סלקטיבי של נוירונים מוטציה אחת מוקפים תאים מסוג wild. בדרך זו, תאים אוטונומיים מנגנונים מולקולריים נוירונים נודדים ניתן לחקור. כמו כן, ניסויים הצלה תפקודית מבוצעות בקלות. הכנת זמן לשגות סדרה של פרוסות המוח electroporated מאפשר דינמי ניתוח התנהגות נודדת של נוירונים נודדות יחיד, המספק מידע רב יותר מאשר ניתן להשיג מקטעי המוח קבוע. ב electroporation ברחם ^{3 , 4} דורש אימון ראשוני אבל - פעם שולט - הואטכניקה מהירה ופשוטה כדי transfectibly transfect נוירונים של קליפת המוח ב vivo . בפרוטוקול המתואר כאן השתמשנו electroporation ברחם ב E14.5, כאשר נולדים מאוחר השכבה העליונה נוירונים נוירונים נימיים נולדים. לצורך מחקר של נוירונים הישרדות שכבתית עמוקה ב electroporation ברחם יש לבצע בשלב התפתחותי מוקדם יותר ( כלומר E12.5) ¹³ . באופן עקרוני, הפרוטוקול עשוי לשמש גם כדי ללמוד הגירה של subpopulations עצביים אחרים במוח זה יכול להיות transfected עם electroporation, כולל הגירה של interneurons ¹⁴ ותאי גרגר cerebellar ¹⁵ .

פרוסה תרבות פרוסה שאנחנו מתארים היה מותאם פולו וגוש ¹² בעבר, השתמשנו בו עבור electroporation לשעבר utero ^{16 , 17} כדי stuהתפתחות ההיפוקמפוס dy. והכי חשוב, פרוסות המוח צריך להיות מטופל עם הטיפול לאורך כל התהליך כדי לשמור על הכדאיות שלהם. אנו משתמשים במיקרוסקופ הפוכה ו אופטיות איכות זכוכית התחתונה מנות לדמיין את התרבות פרוסת מנוחה על הוספת תרבית תאים. תצורה זו היא קלה מאוד להגדיר ומאפשר תנאים סטריליים, שכן המטרה מעולם לא מקבל על קשר עם תרבות פרוסה או בינוני. עם זאת, נדרשים זמן עבודה ארוך המרחק (2 מ"מ) עם צמצם מספריים גבוהה מספיק (0.6 ומעלה) נדרשים. מחקרים אחרים הניחו את פרוסת המוח ישירות על משטח הזכוכית והשתמשו במטריצת קולגן ^{18 , 19} כדי לתקן את הפרוסה במקום, מה שהופך את השימוש ביעדים עם מרחק עבודה קצר יותר. עם זאת, באמצעות הוספת תרבית תאים מספק טיפול קל, תוצאות לשחזור, ומאפשרת החוקר את התמונה פרוסות אפילו 1 עד 2 ימים לאחר הכנתם ללא שיתוףMproromising הכדאיות של פרוסת המוח (נתונים לא מוצג). בעיה קריטית נוספת נוגעת נזק לפרוסות על ידי אור לייזר. השתמשנו גלאי היברידית רגיש מאוד, אשר אפשרה לנו להפחית את כוח הלייזר למינימום תוך קבלת אותות ניאון מספיק עבור הדמיה לשגות זמן. באמצעות הדמיה multiphoton היה לצמצם עוד photodamage ויאפשר חדירה רקמות עמוק יותר, כמו גם גילוי אור יעיל יותר לעומת מיקרוסקופיה confocal קונבנציונלית.

למרות התועלת שלה ללמוד הגירה נוירונים, הפרוטוקול יש מגבלות ולא יכול לשמר לחלוטין את המצב של נוירונים נודדים במוח שלם. מטריקס תאיים, הקשר בין תאיים דבק, ואת כלי הדם בתוך אזור נודד יכול להשפיע באופן דינמי נוירונים נודדים רדיאלי ^{20 , 21} . באופן ספציפי, נוירונים השכבה העליונה תלויים תהליכי גלייה רדיאלי מוארךההגירה שלהם ²² . עבור הדמיה מוצלחת, ולכן חשוב לבחור פרוסות המוח עם GFP electroporated תאים גליה רדיאליים להרחיב את התהליכים שלהם באמצעות רוחב קליפת המוח כולו. "פרוסות אלכסוניות", שבהן פיגום גליה רדיאלי נחתך לפני שהגיע אל פני השטח של המוח, צריך להימחק מניתוח נוסף. לפעמים, מוות של תאים עשוי להתרחש על פני האוויר של פרוסת המוח, אשר מגביל רכישת התמונה לאזור עמוק בתוך המדגם. נוירונים electroporated פרוסות המוח התרבותי עשוי לנוע פחות יעיל לעומת נוירונים electroporated in vivo , אשר יכול להיגרם על ידי התאוששות מספקת מן ההכנה. זה דורש ניתוח של תרבויות פרוסה מרובים עבור שני מצבים ניסיוניים ובקרה, ופרשנות קריטית של ערכות נתונים נציג. במקרים מסוימים עלבונות הקשורים electroporation ברחם עלול לגרום למוות עובריים או שינוי מבנייונים של המוח, כולל חדרים מוגדלים, קליפת המוח דליל באסימטריה, או היווצרות צלקת גלייה כתוצאה מהזרקה של דנ"א. במקרים אלה, המדגם צריך להיות מושלך מניתוח נוסף.

בעוד פרוסות המוח מתורמים עובריים לשרוד היטב על מוסיף קרום ²³ , ניתוחים מוגבלים לאירועים התפתחותיים מוקדם, כולל הגירה העצבית, ואנחנו לא השתמשו בו ללימוד אירועים מאוחר יותר, כגון פיתוח דנדריט או synaptogenesis. לסיכום, אנו מספקים פרוטוקול מפורט ישירות באופן דינמי ללמוד הגירה נוירונים של נוירונים electroporated בתרבויות פרוסה, אשר ניתן להתאים בקלות לנתח פונקציות של גנים המעורבים הפרעות נוירו-התפתחותיות.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים לז 'אקלין Andratschke, אלנה Werle, Sachi Takenaka, ו Matthias Tober עבור סיוע טכני מעולה, כמו גם ויקטור Tarabykin לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של דויטשה Forschungsgemeinschaft כדי SB (BR-2215).