Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,

Bu yazıda oligomer oluşturabilen yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidler, veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk. Amiloid P Alzheimer hastalığında rol yüksek çekiş eğilimli hidrofobik peptittir. peptid amiloidojenik doğası onun saflaştırma bir meydan okuma yapar.

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Alzheimer hastalığı bir nörodejeneratif bir hastalıktır etkileri 35 milyondan fazla kişi dünya çapında. Hastalığın başlangıcı ve gelişiminde güçlü Belirtilmiş ^1, yüksek toplama eğilimli, hidrofobik peptid Amiloid beta (Aβ) 'dir. ² Aβ Ancak, beta amiloid 42 (Aβ42), proteinin en toksik bir şekilde 42-amino asit türevi olduğu düşünülmektedir, uzunluğu 36 ila 43 amino asit arasında değişir. ³ Bu hali hazırda, özellikle nörotoksik maddeler olduğu düşünülmektedir yayılabilir oligomerik türler oluşturma Aβ42 yeteneğini büyük bir kısmında kaynaklanmaktadır. ⁴ Aβ peptid anlayışımızı ilerletmek için, rutin yüksek saflıkta malzeme elde etmek esastır. saf olmayan artıklarının varlığı büyük ölçüde peptidin birikme eğilimi özelliklerini değiştirmek için gösterilmiştir. ⁵

Traditionally, örneğin Aβ hidrofobik peptitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ayırma C ₄ ya da Cı ₈ silis bazlı sabit fazlarda ve bir asidik mobil faz bir kombinasyonunun kullanımı ile yapılmıştır. ⁶ Ancak, bu tür koşullar peptid saflaştırılması için bir meydan okuma sunabilir. Aβ peptidi düşük izoelektrik noktası (pl yaklaşık 5.5) ^7, asidik koşullar altında, peptid agregasyon artar ve bunun bir sonucu olarak genellikle izole etmek zordur, geniş olmayan çözüldü HPLC tepe (Şekil 2A) üretilmeleri anlamına gelir. Ayrıca, bu tür geniş zirveler genellikle peptid toplama profilini etkileyebilecek ve yaygın dramatik üretilen peptid miktarını etkileyebilir arınma sonraki mermi gerektirebilir safsızlıklar içermezler.

poli (stiren / divinilbenzen) durağan faz, PLRP-S, saflaştırmadan bir alternatif araçları temsil ederYing hidrofobik peptitler. hareketsiz faz farklı protein ve haberci ribonükleik asitlerin (mRNA) 'in bir dizi saflaştırılmasında kullanılmıştır. ^{8, 9} PLRP-S sabit faz ters faz ayrılması için ek bir alkil ligandı gerektirir ve daha da önemlisi, peptidin agregadan arındırma çaresinin yol açan yüksek pH değerinde kimyasal olarak kararlıdır. ⁷ Burada, yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidleri veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk.

Aβ40 ya Aβ42 Peptid 1. Hazırlayıcı HPLC saflaştırma

1. HPLC saflaştırması için, aşağıdaki tamponlar hazırlamak.
   1. Ultra saf su 1000 ml _NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon A (20 mM _NH4OH) hazırlayın.
   2. HPLC-grade asetonitril 800 mL ve ultra saf su 200 mL çözeltisine _NH4OH (% 28 çözelti) 1.3 mL ilave edilerek tampon B (20 mM _NH4 OH ile% 80 asetonitril) hazırlayın.
   3. Ultra saf su ve 100 mL _NH4OH (% 28 çözelti), 100 uL eklenmesiyle Örnek erime tamponu (% 0.1 _NH4OH) hazırlayın.
2. Kurulum, Şekil 1 'de gösterildiği gibi, HPLC aleti.
   1. A tampon ve polimer tüp kullanarak HPLC pompası girişlerine B tampon içeren çözücü şişe yerleştirin. tek parça uydurma HPLC pompası polimer boru takın. polimer boru emin olunher bir tampon aygıtının doğru giriş valfı takılmıştır. Bir degazör ile HPLC pompası takın.
   2. Çift 300 Å 8 mikron 25 mm х 300 mm hazırlayıcı sütun girişi ile HPLC pompası polimer boru kullanılarak (Şekil 1B, aşırı sol sütun, Malzeme Listesi bakınız).
      1. tek parça parmak sıkı geçme ile hazırlayıcı sütun polimer boru takın. Polimer sütunu doğru bir şekilde yönlendirilmesini sağlamak.
         Not: Hazırlama sütunun durağan faz poli (stiren-divinilbenzen) parçacıklar oluşur. Polimer kolonun doğru yönelim tek yönlü ok ile dış gövde üzerinde işaretlenir.
   3. Polimer boru kullanarak ikili dalga boyu dedektörü sütunun çıkışını bağlayın ve 214 nm ve 280 nm dalga boyu dedektörü ayarlayın.
      1. kurulum enstrüman yöntemi seçeneği belirleme dalgaboyu parametrelerini değiştirerek dalga boyu AlterDahili HPLC yazılımı.
   4. tek parçalı bir parmak sıkı geçme ile bir dalga boyu detektörü girişine polimer boru takın. dalga boyu dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. tek parça parmak sıkı geçme ile HPLC dedektörü çıkış vanasına polimer boru takın. Bu örnek toplama tüp olacaktır.
      Not: Aβ peptidi üzerinde güçlü bir kromofor eksikliği 214 nm pik toplama primer ultraviyole (UV) bir dalga boyu olarak kullanılması zorunlu kılar.

Şekil 1: beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılan HPLC aygıtının deney düzeneği. (A) bir gaz giderici ve 214 nm ve 280 nm ayarlı değişken dalga uzunluğu detektörü ile donatılmış kuaterner HPLC pompası; (B) olarak hazırlanmıştır HPLC sütunları arasında, beta amiloid peptidlerin saflaştırılması için kullanılansoldan sağa, 25 x 300 mm, ^2, hazırlayıcı kolon, 7.5 x 300 mm, ^2, yarı preparatif kolonu ve 4.6 x 250 mm ² Analitik kolon; (C) analitik HPLC için kullanılan 20 uL paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile Manuel enjektör; (D) hazırlayıcı ve yarı hazırlayıcı saflaştırma için kullanılan 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngü ile manuel enjektör. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3. (HPLC yazılımı yerleşik kurulum enstrüman yöntemi seçeneği) çözücü tarife parametresini değiştirerek arıtma yöntemi giriniz Tablo 1'de görüldüğü gibi arıtma yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı. HPLC yazılım üzerinde "açık" butonuna tıklayarak HPLC pompası açın.
   NOT: Pompa tampon A başlangıç ​​oranını temin başlar ve hazırlık yoluyla B tampon olacakarative kolon ve HPLC aleti.
   1. 30 dakika tamamen dengelenmesi için sistem bırakın.

Tablo 1: 25 × 300 mm polimer kolon kullanılarak Aβ42 ve Aβ40 peptidler saflaştırılması için zaman çizelgesi. ^Bir Tampon A - 20 mM _NH4 OH ile _H2O; 20 mM _NH4 OH ile ^B% 80 MeCN /% 20 _H2O; örnek aşağıdaki enjeksiyondan önce sütun yıkama 15 dakika ^Cı Ran; ^D HPLC enstrümantasyon 6 mL / dakika bir akış hızı çalıştırmak için, basınç sınırı 200 bar azaltılması gerekir.

4. Aβ peptidi numunenin saflaştırılması
   Not: Ham peptid bir otomasyonlu katı faz peptid sentezi ile elde edildi. ¹⁰
   1. Örnek erime 4 ml tampon ham Aβ peptidi 3 mg eritin. Oda sıcaklığında 30-60 sn ve çözünmeye yardımcı olması için 40 kHz frekansta örnek sonikasyon.
   2. 16-gauge ile donatılmış 5 mL'lik bir plastik bir şırınga kullanılarak HPLC kolonuna Numunenin tamamı enjektepaslanmaz çelik iğne. alt aşama 1.3 belirtildiği gibi arıtma yöntemi çalıştırın.
      NOT: Sistem numune enjeksiyon 10 ml paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü (Şekil 1D) ile donatılmış bir el enjektörün kullanımı ile yapılabilir sağlar. İstenen Aβ peptid keskin çözülmesi tepe (Şekil 2C) olarak 72 ila 74 dakika Zehir.
   3. 50 ml konik santrifüj tüpüne örnek toplamak. Toplanan eluent doğrudan enjeksiyon kütle spektrometresi ile Aβ zirve kimliğini onaylamak. ¹¹ -20 ° C'de en fazla 12 saat boyunca yıkama sıvısı.
      NOT: daha uzun 12 saat peptid oksidasyonu için potansiyeli nedeniyle tavsiye edilmez dönemler için çözümün depolama.
   4. Toplanan kısım dondurma flaş saflaştırılmış peptid Yalıtmak / sıvı azot ve Lyophilize içinde Aβ peptid alikotları. -60 ° C ve bir pres içinde bir sıcaklıkta dondurularak kurutulması örnek tarafından liyofilizasyon gerçekleştirmek24 saatlik bir süre için 20 mTor olun.
   5. Aβ peptidi saflığını belirlemek için aşağıda verilen analitik HPLC protokolü çalıştırın. 6 aya kadar bir süre için -20 ° C 'de bunların liyofilize formda saklayın peptidler.

Saflaştırılmış Aβ Proteininin 2. Analitik HPLC Analizi

1. alt bölümde 1.1 belirtildiği gibi HPLC tamponlar hazırlayın. Yukarıdaki protokol.
2. Kurulum aşama 1.2.1 uyarınca ve 4.6 x 250 mm analitik sütun (Şekil 1B, en sağ sütun) ve 20 uL, paslanmaz çelik enjeksiyon döngüsü ile el enjektör ile, Şekil 1 'de gösterildiği gibi (Şekil 1C) monte analitik HPLC Enstrüman.
3. Adım 1.3 ile benzer talimatları izleyerek Tablo 2'de görüldüğü gibi analitik yöntemini çalıştırmak için HPLC yazılım programı.

Tablo 2: Aβ peptidi HPLC saflığı analizi için takvim. ^Bir Tampon A - 20 mM _NH4 OH ile _H2O; 20 mM NH ₄ OH ^b% 80 MeCN /% 20 H ₂ O.

4. Aβ peptidi saflığı analizi
   1. Örnek tampon çözeltisi içinde peptidin çözülmesi yoluyla saflaştırılmış peptidin 1 mg / ml çözelti hazırlayın.
      NOT: Tampon tarifi alt bölümde 1.1 bulunabilir. Protein konsantrasyonu, 280 nm'de (A _280nm) protein emiliminin ölçülmesi ile belirlenir. ¹² m konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır olar yok olma katsayısı (ε) ε = 1.490 ^{dm3 mol-1 cm-1} olan. ¹³
   2. HPLC kolonuna 1 mg / ml (222 uM) çözeltisinin 20 ul enjekte edilir ve adım 2.3 kurulum oldu analitik yöntem çalıştırın.
      Not: analiz için kullanılmaz kalan çözelti, sıvı nitrojen içinde dondurulur ve Aβ peptidi kurtarmak için liyofilize edilebilir. Liyofilizasyon ayrıntıları alt bölümde 1.4.4 bulunabilir. Aβ peptidi 16 ve 18 dakika boyunca (Şekil 2B) arasındaki analitik sütundan elute olur. Aβ peptidi saflığını belirlemek için HPLC aleti birlikte yerleşik entegre analiz yazılımı kullanarak. Saflık spektrumunun bireysel zirveleri her entegre ve peptit tepe yüzdesi alanını hesaplanarak belirlenir. Tipik olarak,>% 95 bir saflaştırma saptanmalıdır.

"Şekil 2" src = "/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Şekil 2: Aβ42 Temsilcisi HPLC izleri. (A) Geleneksel _C4 silika saflaştırma koşulları: Tampon A: _H2O,% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA), B tampon maddesi ile:% 0.1 TFA, gradyan ile MeCN (asetonitril): 20 tampon B 40 dakika boyunca,% 27 ve ardından izokratik% 27 B tamponu ile; (B) 25 x 300 mm, ² Polimer kolonu, koşullar kullanılarak hazırlayıcı saflaştırma: 20 mM _NH4OH, tampon B ile _H2O: Tampon A% 80 MeCN /% 20, H, 20 mM _NH4 OH ile _2, O, gradyan : izokratik% 27 tampon B, ardından 70 dakika boyunca% 20 ila 27 tampon B; 25 x 300 mm, ² Polimer kolonu kullanılarak hazırlayıcı saflaştırmaya Optimize (C) koşulları alt bölüm protokolü açıklama metni 1.3 bulunan Tablo 1 'de tarif edilir; (D) Analitik HPLC 4.6 x 250 mm ² Polimer kolonu, kon kullanılarakitions: Tampon A: _H2O, 20 mM _NH4OH, tampon B ile: 30 dakika boyunca 20 mM _NH4OH, gradyan% 5 ila 50 tampon B% 80 MeCN /% 20 _H2O. Bölüm A, B ve C Aβ42 tekabül zirve bir yıldızla işaretlenir. Bölüm D. Kütle spektrometrisi gösterildiği gibi C>% 95 bir saflığa ortaya kısmen işaretlenmiş Aβ42 tepe toplama Aβ42 zirvesinin ne olduğu belirlemek için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

PLRP-S durağan faz bir kombinasyonunu 72 ve 74 dakika boyunca (Şekil 2C) arasında bir alıkonma zamanında Aβ peptidi için keskin çözüldü tepe oluşumunda yüksek bir pH mobil faz sonuçları kullanılarak Aβ42 peptidinin arıtılması. tepe kimliğinin teyidi toplanan elüsyon direkt enjeksiyonu kütle spektrometrisi yoluyla yapılır. yıkama sıvısı kadar 12 saat boyunca çözelti içinde -20 ° C'de muhafaza edilebilir. depolamanın daha uzun süreli protein oksidasyonu ile sonuçlanabilir. Saflaştırılmış peptit izole edilmesi için, yıkama sıvısı, sıvı azot ve liyofilize dondurulmuş flaş. Saf hale getirilmiş peptidin analitik HPLC>% 95 (Şekil 2B) bir saflık göstermektedir. Aynı prosedür, yöntem değişiklik olmadan Aβ40 peptidi (Şekil 3A) saflaştırmak için kullanılabilir. Analitik HPLC Aβ40 saflık% 95'ten (Şekil 3B) olarak gösterir.

Şekil 3: Aβ40 Temsilcisi HPLC izleri. 25 x 300 mm, ² Polimer kolonu kullanılarak hazırlayıcı saflaştırmaya Optimize (A) koşulları protokolü açıklama metni alt bölüm 1.3'de bulunan Tablo 1 'de tarif edilmiştir. Aβ40 tekabül zirve bir yıldız ile işaretlenmiştir. (B), Analitik HPLC 4.6 x 250 mm ² Polimer kolonu, koşulları kullanılarak: Tampon A: _H2O, 20 mM _NH4OH, tampon B ile:% 80 MeCN /% 20 _H2O, 20 mM _NH4 OH ile, gradyan : 30 dakika boyunca% 5 ila 50 tampon B. B bölümündeki Kütle spektrometrisi gösterildiği gibi bir>% 95 bir saflığa ortaya kısmen işaretlenmiş Aβ40 tepe toplama Aβ40 zirvesinin ne olduğu belirlemek için kullanılmıştır. Onu tıklayınızE bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Saflaştırılmış peptid oligomerik karışımlar oluşturabilir onaylamak için, daha önce ^{14, 15} tarif ve sağlam oligomer oluşumunu gözlemlemek mümkün olduğu gibi değiştirilmemiş proteinleri (PICUP) fotoğraf kaynaklı çapraz bağlanmasını gerçekleştirdi. ¹⁰

Aβ peptidi HPLC saflaştırma arıtılmadan kullanılan durağan faz peptid elüt edilmesi için seçilen mobil faz iki seçimi oldukça bağlıdır. toplama peptidin yüksek eğilimi düşük izoelektrik noktası Aβ peptidi uzun bir geniş olmayan çözüldü olarak elüsyon ile hidrofobik proteinlerin ayrılması (C4 veya asidik bir mobil elüsyon ile birleştirilmiş C8 faz) zor geleneksel kromatografik koşullan sağlamaya pik (Şekil 2A).

Yüksek pH değerinde kimyasal olarak stabil, bu sorunu, PLRP-S durağan faz, aşmak için Aβ peptidi (Şekil 2B ve 2C) saflaştırılması için etkili olduğu tespit edilmiştir. yüksek bir pH mobil faz kullanımı agregasyon derecesini en aza ve optimize edilmiş olduğunda, keskin ve iyi çözülmesi zirveye neden oldu. Optimize edilmiş protokolde, tampon B yüzdesi hızlı SWITC oldu52 dakikalık bir zaman noktasında ve bunun sonucu olarak,% 27 ila 20% arasında hed, iyi tanımlanmış bir Aβ tepe (Şekil 2C) yol açtı. Hidrofobik bütün safsızlıkları tampon B konsantrasyonu ilk 20 24.5% artışa sırasında kolondan taşınan görerek Bu optimize edilmiş protokolü kullanır. yabancı maddeler Aβ peptidi benzer bir hidrofobik olan bulunursa, HPLC protokolü daha sonra optimizasyonu gerekli olabilir. Optimize edilmiş bir yöntem sentezlenen Aβ bireysel gruplar arasında yüksek tekrarlanabilir ve optimize prosedür (Şekil 3) herhangi bir değişiklik yapmadan peptidin hem 40 ve 42 varyantları saflaştırılması yeteneğine sahip oldu. her iki peptit için, analitik HPLC ile tespit edildiği üzere saflık% 95 dan daha büyük olduğu tespit edilmiştir.

Aβ peptid toplama eğilimi değiştiren iz kirlilikler raporları göz önüne alındığında, bir dik biyofizik karakterizasyonu onaylamak için istihdam edilmesi tavsiye edilirsaflaştırılmış peptid oligomerizasyon maruz kalabilir. Kullanımı daha önce biz picup gerçekleştirmek için seçtim protokolleri bildirdi. ^14, saflaştırılmış proteinlerin ¹⁵ PICUP analizi Aβ40 peptit ve Aβ42 peptidi ile bağlantılı heptamer dağıtımı yoluyla monomer için heksamer popülasyon dağılımı ile karakteristik bir monomer göstermektedir. ¹⁰ Bu sonuçlar, PLRP-S durağan fazı ve toplama kapasitesine sahip Aβ proteinleri yüksek bir pH değeri mobil elüan sonuçlarını kullanarak Aβ peptidlerin saflaştırma teyit etmektedir.

rapor saflaştırma işlemi, tek bir kromatografik vadede Aβ peptidi 3 mg a kadar saflaştırılması mümkün olacak şekilde tasarlanmıştır. Bu işlem için, 6 mL / dakika, HPLC aygıtının akış hızını ayarlamak için çok önemlidir. HPLC pompası alt akış oranları kullanıldığında, HPLC çalışma süresi, bu uyum sağlamak için genişletilmelidir. Yakınsamayapt klar, daha yüksek akış oranlarının kullanılması HPLC çalışma süresinde azalma garanti edebilir. Bununla birlikte, çalışma süresi azaltılması için diğer zirveleri ile Aβ tepe birlikte elüsyon neden olabilir ve bu nedenle elde Aβ peptidi saflıkta alt. Bundan başka, temizleme için kullanılan kromatografik kolon HPLC cihazı ve boyutu büyük ölçüde tek bir vadede saflaştırılabilir malzeme miktarını etkileyebilir. hiçbir doruğun Aβ peptidi beklenen yıkama sıvısı zaman üretilir, ve büyük bir pik çözücü önünde karşılık gelen yıkama sıvısı zaman üretilir, daha sonra çok fazla madde ilk kolona yüklenmiştir. Her geçiş için HPLC kolonuna enjekte malzemenin miktarının azalması demek, bu sorunu aşmak. Aβ peptidi saflaştırılmıştır sonra, son derece çözeltisi olabildiğince çabuk liyofilize edilmesi tavsiye edilir. çözelti içinde peptidin uzun süreli depolama Aβ oksidasyonu ve kirliliklerin nedenle oluşumuna yol açabilir. puAβ peptidi lik zaman analitik HPLC ile tespit edilmelidir. kirliliklerin eser miktarda dramatik peptit toplama eğilimini değiştirebilir. analitik HPLC izi saflığını bozan maddelerin mevcut olduğunu gösterirse, numune HPLC saflaştırma protokolüne yeniden tabi tutulması gerekmektedir ve temizliğinin analitik HPLC ile tekrar belirlenir.

Aβ42 ve Aβ40 peptidler arıtılması için bu özel prosedür bilimsel topluluk için fayda ve kullanıcıların oligomer oluşumu yüksek saflıkta Aβ yetenekli elde etmesine olanak umulmaktadır. Prosedür, izole edilmesi ve saflaştırılması zor olan diğer amiloidojenik peptidlere adapte edilebileceğini beklenir.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar teknik yardım için Agilent teşekkür etmek istiyorum. Kate Markham ve Rafael Palomino Dr Hsiau-Wei Lee yazının Şekil 1 hazırlanmasında yaptığı yardım için teşekkür edilmektedir Aβ peptid ve onların ilk sentezinde yardım ve arıtma için yatırılır.