Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo que los efectos más de 35 millones de personas en todo el mundo. ¹ Implicado fuertemente en la aparición y desarrollo de la enfermedad, es la agregación altamente propensa, péptido amiloide beta hidrófobo (Aß). ² Aß se extiende de 36 a 43 aminoácidos de longitud, sin embargo, se cree que la variante de ácido 42-amino, amiloide beta 42 (Aß42), es la forma más tóxica de la proteína. ³ Esto se debe en su mayor parte a la capacidad de Aß42 para formar fácilmente difusibles, especies oligoméricas que se cree que son entidades particularmente neurotóxicos. ⁴ Con el fin de mejorar nuestra comprensión del péptido Aß, es esencial para obtener de forma rutinaria material de alta pureza. La presencia de trazas de impurezas se ha demostrado que alterar dramáticamente las propiedades de agregación de propensión del péptido. ⁵

Tradicionalmente, la cromatografía (HPLC) de separación de líquidos de alto rendimiento de péptidos hidrófobos tales como Aß se ha realizado mediante el uso de una combinación de C ₄ o C ₈ fases estacionarias a base de sílice y una fase móvil ácida. ⁶ Sin embargo, tales condiciones pueden presentar un reto a la purificación del péptido. El punto isoeléctrico bajo del péptido Aß (pI de aproximadamente 5,5) ⁷ significa que bajo condiciones ácidas, la agregación de péptido se aumenta y como resultado picos anchos de HPLC, no resueltos que a menudo son difíciles de aislar se producen (Figura 2A). Además, tales picos anchos a menudo contienen impurezas que pueden afectar el perfil de agregación del péptido, y comúnmente requieren las siguientes rondas de purificación que pueden afectar dramáticamente la cantidad de péptido producido.

El poli (estireno / divinilbenceno) fase estacionaria, PLRP-S, representa un medio alternativo de tratamientpéptidos hidrofóbicos ying. La fase estacionaria se ha empleado en la purificación de un número de diferentes proteínas y ácidos ribonucleico mensajero (ARNm). ^{8, 9} La fase estacionaria PLRP-S no requiere ligando alquilo adicional para la separación de fase inversa, y más importante es químicamente estable a pH alto que conduce a la desagregación del péptido. ⁷ Aquí, se presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40).

1. La HPLC preparativa purificación del Aß40 o Aß42 Péptido

1. Preparar los siguientes tampones para la purificación por HPLC.
   1. Preparar el tampón A (20 mM NH ₄ OH) mediante la adición de 1,3 ml de _NH4OH (solución al 28%) a 1000 ml de agua ultrapura.
   2. Preparar el tampón B (80% de acetonitrilo con 20 mM NH ₄ OH) mediante la adición de 1,3 ml de NH ₄ OH (solución al 28%) a una solución de 800 ml de acetonitrilo de grado HPLC y 200 ml de agua ultrapura.
   3. Preparar tampón de disolución de la muestra (0,1% NH ₄ OH) mediante la adición de 100 l de NH ₄ OH (solución al 28%) a 100 ml de agua ultrapura.
2. Configuración del instrumento HPLC como se muestra en la Figura 1.
   1. Montar las botellas de disolvente que contienen tampón A y tampón B a las entradas de la bomba HPLC utilizando tubo de polímero. Una el tubo de polímero a la bomba de HPLC con una sola pieza de ajuste. Asegúrese de que el tubo de polímero decada memoria intermedia se ajusta a la válvula de entrada correcto del instrumento. Montar la bomba de HPLC con un desgasificador.
   2. Acoplamiento de la bomba de HPLC con la entrada de 300 Å 8 m 25 х 300 mm mm columna preparativa (Figura 1B, lejos columna izquierda, ver Lista de Materiales) usando un tubo de polímero.
      1. Una el tubo de polímero a la columna preparativa con una sola pieza ajustada dedo. Asegúrese de que la columna del polímero está orientada de la manera correcta.
         NOTA: La fase estacionaria de la columna de preparación se compone de poli (estireno-divinilbenceno) partículas. La orientación correcta de la columna del polímero está marcado en la carcasa exterior con una sola flecha direccional.
   3. Conectar la salida de la columna al detector de longitud de onda dual usando un tubo de polímero y ajustar el detector de longitud de onda a 214 nm y 280 nm.
      1. Alterar la longitud de onda al cambiar los parámetros de longitud de onda de detección en la opción del método de configuración del instrumentoel software incorporado de HPLC.
   4. Una el tubo de polímero a la entrada del detector de longitud de onda con una sola pieza ajustada dedo. Adjuntar tubo de polímero a la válvula de salida del detector de longitud de onda. Una el tubo de polímero a la válvula de salida del detector de HPLC con una sola pieza ajustada dedo. Este será el tubo de recogida de muestras.
      NOTA: La falta de una fuerte cromóforo en el péptido Aß dicta que 214 nm se utiliza como la longitud de onda ultravioleta primaria (UV) para la recogida de pico.

Figura 1: Montaje experimental del instrumento de HPLC utilizado para la purificación de los péptidos de amiloide beta. (A) La bomba de HPLC cuaternaria equipada con un desgasificador y el detector de longitud de onda variable ajustado a 214 nm y 280 nm; Columnas (B) de HPLC utilizado para la purificación de los péptidos de amiloide beta, a partir dede izquierda a derecha, 25 x 300 mm columna de preparación ^2, 7,5 x 300 mm ² semi columna preparativa y 4,6 x 250 ^mm2 columna analítica; (C) del inyector manual con 20 l bucle de inyección de acero inoxidable utilizado para HPLC analítica; (D) de inyector manual con 10 ml bucle de inyección de acero inoxidable utilizado para la purificación preparativa y preparativa semi. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Programar el software HPLC para ejecutar el método de purificación como se muestra en la Tabla 1. Entre el método de purificación cambiando el parámetro calendario de disolvente (en la opción método instrumento de instalación integrada en el software HPLC). Encienda la bomba de HPLC haciendo clic en el botón de "on" en el software de HPLC.
   NOTA: La bomba comenzará a suministrar relación de arranque de tampón A y tampón B a través de la preparacióncolumna arative y el instrumento HPLC.
   1. Dejar el sistema durante 30 min se equilibren totalmente.

Cuadro 1: Calendario para la purificación de los péptidos Aß42 y Aß40 utilizando mm de columna de polímero del 25 × 300. ^un tampón A - _H2O con 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH; ^c Ran durante 15 min para lavar la columna antes de la siguiente inyección de muestra; ^d Con el fin de ejecutar una velocidad de flujo de 6 ml / min en la instrumentación de HPLC, el límite de presión necesita ser reducido a 200 bar.

4. La purificación de la muestra de péptidos Aß
   Nota: El péptido crudo se obtiene a través de la síntesis de péptidos en fase sólida automatizada. ¹⁰
   1. Disolver 3 mg de crudo péptido Aß en 4 ml de tampón de muestra de la disolución. Sonicar la muestra durante 30-60 s a temperatura ambiente y a una frecuencia de 40 kHz para ayudar a la disolución.
   2. Inyectar toda la muestra en la columna de HPLC utilizando una jeringa de plástico de 5 ml equipado con un calibre 16aguja de acero inoxidable. Ejecutar el método de purificación como se indica en la subetapa 1.3.
      NOTA: El sistema permite la inyección de muestra que se realiza mediante el uso de un inyector manual equipado con un acero inoxidable de bucle de inyección de 10 ml (Figura 1D). El péptido Aß deseado se eluye entre 72 y 74 minutos como un pico agudo resuelto (Figura 2C).
   3. Recoger la muestra en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Confirmar la identidad del pico Aß a través de inyección directa de espectrometría de masas del eluyente recogido. ¹¹ tienda eluyente para un máximo de 12 horas a -20 ° C.
      NOTA: El almacenamiento de la solución por períodos de más de 12 h no se recomienda debido al potencial de oxidación del péptido.
   4. Aislar el péptido purificado por el flash congelar la alícuota de recogida / alícuotas del péptido Aß en nitrógeno líquido y se liofiliza. Realizar liofilización liofilizando la muestra a una temperatura de -60 ° C y una presiónAsegúrese de 20 mTorr durante un periodo de 24 h.
   5. Ejecutar el protocolo de HPLC analítica tal como se describe a continuación para determinar la pureza del péptido Aß. péptidos almacenar en su forma liofilizada a -20 ° C durante un período de hasta 6 meses.

2. Analítica Análisis por HPLC de la proteína purificada Aß

1. Preparar los tampones de HPLC como se describe en la subsección 1.1. del protocolo anterior.
2. Configuración de la HPLC analítica como en la etapa 1.2.1 y como se representa en la figura 1 con 4,6 × 250 mm columna analítica (Figura 1B, la columna más a la derecha) y el inyector manual con 20 l bucle de inyección de acero inoxidable (Figura 1C) montada en el instrumento.
3. Programar el software HPLC para ejecutar el método de análisis tal como se muestra en la Tabla 2, siguiendo las instrucciones similares a los en el paso 1.3.

Tabla 2: Calendario para el análisis de HPLC la pureza del péptido Aß. ^un tampón A - _H2O con 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH.

4. Análisis de pureza del péptido Aß
   1. Preparar una solución de 1 mg / ml de péptido purificado a través de la disolución del péptido en la solución de tampón de muestra.
      NOTA: La receta de amortiguación se puede encontrar en la subsección 1.1. La concentración de proteína se determina midiendo la absorción de proteína a 280 nm (A _{280 nm).} El ¹² m coeficiente de extinción mu molar (ε) que se utiliza para determinar la concentración es ε = 1.490 dm ³ mol ^-1 cm ^{-1. 13}
   2. Inyectar 20 l de la solución de 1 mg / ml (222 mM) en la columna de HPLC y ejecutar el método de análisis que fue instalado en el paso 2.3.
      NOTA: La solución restante no utilizada para el análisis puede ser de flash congelado en nitrógeno líquido y se liofilizó para recuperar el péptido Aß. liofilización detalles se pueden encontrar en la subsección 1.4.4. El péptido Aß se eluye de la columna analítica entre 16 y 18 min (Figura 2D). Utilice el software de análisis de integración integrado que acompaña al instrumento de HPLC para determinar la pureza del péptido Aß. La pureza se determinó mediante la integración de cada uno de los picos individuales en el espectro y el cálculo de péptido-pico de porcentaje de área. Por lo general, una purificación de> 95% debe ser comprobada.

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Figura 2: trazas de HPLC representativos de? 42. (A) tradicional C ₄ purificación de sílice, condiciones: Tampón A: H ₂ O con 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), tampón B: MeCN (acetonitrilo) con 0,1% de TFA, gradiente: 20 a 27% de tampón B durante 40 min seguido por isocrático 27% de tampón B; (B) la purificación preparativa usando columna de 25 x 300 mm ² de polímero, condiciones: Tampón A: H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, tampón B: 80% MeCN / 20% H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, gradiente : de 20 a 27% de tampón B durante 70 min seguido de isocrático 27% de tampón B; (C) Optimizado purificación preparativa utilizando una columna de polímero del 25 x 300 mm ^2, se describen las condiciones en la Tabla 1 se encuentra en la subsección 1.3 del texto de la descripción de protocolo; (D) La HPLC analítica usando la columna de 250 x 4,6 mm polímero ^2, conditions: Tampón A: H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, tampón B: 80% MeCN / 20% H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, gradiente de 5 a 50% de tampón B durante 30 min. Para las partes A, B y C del pico correspondiente al Aß42 está marcado por un asterisco. Se utilizó la colección del pico Aß42 marcada en la parte C revela una pureza de> 95% como se muestra en parte la espectrometría de D. masa para determinar la identidad del pico Aß42. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La purificación del péptido Aß42 usando una combinación de la fase estacionaria PLRP-S y un pH alto resultados de fase móvil en la formación de un pico agudo, resuelto para el péptido Aß en un tiempo de retención entre 72 y 74 min (Figura 2C). La confirmación de la identidad del pico se realiza a través de inyección directa de espectrometría de masas del eluyente recogido. El eluyente se puede almacenar a -20 ° C en solución para un máximo de 12 h. Períodos más largos de almacenamiento puede resultar en la oxidación de la proteína. Para aislar el péptido purificado, el eluyente es de flash congelado en nitrógeno líquido y se liofilizó. HPLC analítica del péptido purificado revela una pureza de> 95% (Figura 2D). El mismo procedimiento puede utilizarse para purificar el péptido Aß40 (Figura 3A), sin modificación del método. La HPLC analítica indica una pureza de Aß40 sea mayor que 95% (Figura 3B).

Figura 3: trazas de HPLC representativos de Aß40. (A) Optimizado purificación preparativa utilizando una columna de polímero del 25 x 300 mm ^2, se describen las condiciones en la Tabla 1 se encuentra en la subsección 1.3 del texto de la descripción del protocolo. El pico correspondiente a Aß40 está marcado con un asterisco. (B) La HPLC analítica usando las 4,6 de columna de polímero x 250 mm ^2, condiciones: Tampón A: H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, tampón B: 80% MeCN / 20% H ₂ O con 20 mM NH ₄ OH, gradiente : 5 a 50% de tampón B durante 30 min. Se utilizó la colección del pico Aß40 marcada en la parte A revela una pureza de> 95% como se muestra en parte la espectrometría de B. masa para determinar la identidad del pico Aß40. Por favor, haga clic en ellae para ver una versión más grande de esta figura.

Con el fin de confirmar que el péptido purificado puede formar mezclas oligoméricas, se realizó la reticulación fotoinducida de las proteínas no modificadas (picup) como se ha descrito previamente ^{14, 15} y pudieron observar con firmeza la formación de oligómeros. ¹⁰

La purificación por HPLC del péptido Aß es altamente dependiente de la elección tanto de la fase estacionaria empleada en la purificación y la fase móvil elegido para eluir el péptido. El punto isoeléctrico bajo del péptido y la alta propensión a la agregación render condiciones cromatográficas tradicionales para la separación de proteínas hidrófobas (C4 o fase estacionaria C8 junto con un eluyente móvil ácida) un reto, con el péptido Aß eluyendo como un prolongado amplio, no resuelta pico (Figura 2A).

Para evitar este problema, la fase estacionaria PLRP-S, químicamente estable a un pH alto se encontró que era eficaz para la purificación del péptido beta (Figura 2B y 2C). El uso de una fase móvil de pH alto reduce al mínimo el grado de agregación, y cuando optimizado, dio lugar a un pico agudo, bien resuelta. En el protocolo optimizado, el porcentaje de tampón B fue rápidamente switched de 20% a 27% en el punto de tiempo de 52 minutos y, como resultado, dio lugar a un pico de Aß bien definido (Figura 2C). Este protocolo optimizado se basa en todas las impurezas hidrófobas que se eluyó de la columna durante el aumento inicial de 20 a 24,5% en la concentración de tampón B. Si se encuentran impurezas, que son de una hidrofobicidad similar a la del péptido Aß, a continuación, una optimización adicional del protocolo de HPLC puede estar justificada. El método optimizado fue altamente reproducible entre lotes individuales de Aß sintetizado y era capaz de purificar ambos 40 y 42 variantes del péptido sin ningún cambio en el procedimiento optimizado (Figura 3). Para ambos péptidos, se encontró que la pureza determinada por HPLC analítica a ser mayor que 95%.

Teniendo en cuenta los informes de trazas de impurezas que alteran la propensión de agregación del péptido Aß, es conveniente que se emplee una caracterización biofísica ortogonal a confirmarque el péptido purificada es capaz de someterse a la oligomerización. El uso de protocolos que elegimos para llevar a cabo picup se informó anteriormente. ^{14, 15} análisis picup de las proteínas purificadas demuestra el monómero característica a través de distribución de la población hexámero para el péptido Aß40 y el monómero a través de la distribución heptámero asociada con el péptido Aß42. ¹⁰ Estos resultados confirman que la purificación de los péptidos Aß utilizando la fase estacionaria PLRP-S y un pH alto resultados eluyente móvil en las proteínas Aß que son capaces de agregación.

El procedimiento de purificación informado está diseñado para ser capaz de purificar hasta 3 mg del péptido Aß en una sola serie cromatográfica. Para este procedimiento, es crítico para establecer la velocidad de flujo del instrumento HPLC a 6 mL / min. Si se utilizan caudales inferiores de la bomba de HPLC, el tiempo de ejecución de HPLC debería ampliarse para dar cabida a este. Conversely, el uso de velocidades de flujo más altas puede justificar una reducción en el tiempo de ejecución de HPLC. Sin embargo, la reducción del tiempo de ejecución puede resultar en la co-elución del pico de Aß con otros picos y por lo tanto disminuir la pureza del péptido Aß recogido. Además, la instrumentación de HPLC y el tamaño de la columna cromatográfica usado para la purificación pueden afectar en gran medida la cantidad de material que puede ser purificado en una sola carrera. Si ningún pico se produce en el momento eluyente esperado del péptido Aß, y un pico grande se produce en el momento eluyente correspondiente al frente de disolvente, a continuación, demasiado material se cargó inicialmente en la columna. Reducir la cantidad de material inyectado en la columna de HPLC para cada ejecución se eludir este problema. Una vez que el péptido Aß se ha purificado, es muy recomendable que la solución se liofiliza lo más rápido posible. El almacenamiento prolongado del péptido en solución puede dar lugar a la oxidación de Aß y por lo tanto la formación de impurezas. La PUdad del péptido Aß siempre debe ser determinada por HPLC analítica. cantidades traza de impurezas pueden alterar la propensión de agregación del péptido dramáticamente. Si el registro de HPLC analítica indica la presencia de impurezas, a continuación, la muestra debe ser re-sometió al protocolo de purificación de HPLC y su pureza re-determinado por HPLC analítica.

Se espera que este procedimiento a medida para la purificación de los péptidos Aß42 y Aß40 será de beneficio para la comunidad científica y permitir a los usuarios obtener alta pureza Aß apto para la formación de oligómeros. Sería de esperar que este procedimiento podría ser adaptado a otros péptidos amiloidogénicos que son difíciles de aislar y purificar.

Los autores no tienen nada que revelar.

Los autores desean agradecer a Agilent para su asistencia técnica. Kate Markham y Rafael Palomino se acreditan por su ayuda inicial para la síntesis y purificación del péptido Aß y el Dr. Hsiau-Wei Lee se dio las gracias por su ayuda en la preparación de la Figura 1 del manuscrito.