Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung

Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die Auswirkungen über 35 Millionen Menschen weltweit. ¹ stark bei der Entstehung und Entwicklung der Krankheit in Verbindung gebracht, ist die hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid Amyloid beta (Aß). ² Aß im Bereich von 36 bis 43 Aminosäuren in der Länge, aber es wird angenommen , daß die 42-Aminosäurevariante Amyloid beta 42 (Aß42), ist die toxische Form des Proteins. ³ Dies ist zum größten Teil auf die Fähigkeit von Aß42 zu leicht diffusionsfähig, oligomere Spezies bilden , die vermutlich besonders neurotoxischen Einheiten sein. ⁴ Um unser Verständnis des Aß - Peptid zu fördern, ist es wichtig , regelmäßig zu hochreinem Material zu erhalten. Das Vorhandensein von Spurenverunreinigungen hat sich gezeigt, dramatisch die Aggregationsneigung Eigenschaften des Peptids zu verändern. ⁵

Trüher, wurde durch die Verwendung einer Kombination von C ₄ oder C ₈ Siliciumdioxid basierenden stationären Phasen und einer sauren mobilen Phase die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) -Trennung von hydrophoben Peptiden , wie beispielsweise Aß getan. ⁶ Jedoch können solche Bedingungen eine Herausforderung für die Reinigung des Peptids darstellen. Der niedrige isoelektrische Punkt des Aß - Peptid (pI ungefähr 5,5) , ⁷ bedeutet , daß unter sauren Bedingungen, Peptidaggregation erhöht wird und als Ergebnis breite, nicht aufgelöste HPLC - Peaks , die oft schwierig zu isolieren sind (2A) hergestellt. Ferner können solche breite Peaks enthalten oft Verunreinigungen, die die Aggregationsprofil des Peptids beeinflussen können, und erfordern häufig nachfolgenden Runden der Reinigung, die die Menge an Peptid dramatisch beeinflussen können hergestellt werden.

Die Poly (Styrol / Divinylbenzol) stationäre Phase, PLRP-S stellt ein alternatives Mittel zur purifying hydrophobe Peptide. Die stationäre Phase wurde bei der Reinigung von einer Reihe von verschiedenen Proteinen und messenger-Ribonukleinsäuren (mRNA) eingesetzt werden. ^{8, 9} Die PLRP-S stationäre Phase erfordert keine zusätzliche Alkylliganden für Umkehrphasentrennung, und was noch wichtiger ist , bei hohen pH chemisch stabil, die Desaggregation des Peptids führt. ⁷ Hier berichten wir über eine maßgeschneiderte HPLC - Reinigung - Protokoll , das hochreine Beta - Amyloid-42 (Aß42) und Beta - Amyloid-40 (Aβ40) Peptide ergibt.

1. Präparative HPLC-Reinigung des Aβ40 oder Aß42-Peptid

1. Bereiten Sie die folgenden Puffer für die HPLC - Reinigung.
   1. Bereiten Puffer A (20 mM NH ₄ OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH ₄ OH (28% ige Lösung) auf 1000 ml Reinstwasser.
   2. Bereiten Puffer B (80% Acetonitril mit 20 mM NH ₄ OH) durch Zugabe von 1,3 ml NH ₄ OH (28% ige Lösung) zu einer Lösung von 800 ml HPLC-reines Acetonitril und 200 ml Reinstwasser.
   3. Präparieren Probenlösungspuffer (0,1% NH ₄ OH) durch Zugabe von 100 & mgr; l NH ₄ OH (28% ige Lösung) zu 100 ml Reinstwasser.
2. Setup das HPLC - Gerät wie in Abbildung 1 dargestellt.
   1. Bringen Sie die Lösungsmittelflaschen, die A enthalten Puffer und Puffer B zu den Einlässen der HPLC-Pumpe mit Polymerschlauch. Bringen Sie den Polymerschlauch an die HPLC-Pumpe mit einem einteiligen Armatur. Stellen Sie sicher, dass der Polymerschlauch ausjeder Puffer an den richtigen Einlaßventil des Instruments angebracht. Den HPLC-Pumpe mit einem Entgaser.
   2. Koppeln der HPLC - Pumpe mit dem Einlass der 300 Å 8 um 25 mm х 300 mm präparativen Säule (1B, Spalte ganz links, siehe Materialliste) polymer Schlauch verwendet wird .
      1. Bringen Sie den Polymerschlauch zur präparativen Säule mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Sicherzustellen, dass die Polymersäule in der richtigen Weise ausgerichtet ist.
         HINWEIS: Die stationäre Phase der präparativen Säule aus Poly (styrol-divinylbenzol) -Teilchen umfassen. Die korrekte Orientierung der Polymer Säule wird mit einem einzigen Richtungspfeil auf dem äußeren Gehäuse markiert.
   3. Verbinden Sie den Ausgang der Säule mit dem Dual-Wellenlängen-Detektor Polymerschlauch mit und stellen Sie den Wellenlängen-Detektor auf 214 nm und 280 nm.
      1. Ändern Sie die Wellenlänge, die durch die Detektionswellenlängenparameter im Setup-Instrument Methode Option der VeränderungEinbau-HPLC-Software.
   4. Bringen Sie den Polymerschlauch mit dem Einlass des Wellenlängendetektor mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Befestigen Polymerschlauch mit dem Ausgangsventil des Wellenlängendetektors. Bringen Sie den Polymerschlauch mit dem Auslassventil des HPLC-Detektor mit einem einteiligen Finger eng anliegende. Dies wird die Probensammelschlauch sein.
      HINWEIS: Das Fehlen eines starken Chromophor auf das Aß-Peptid diktiert, dass 214 nm für die Peaksammlung als primäre ultravioletter (UV) Wellenlängen verwendet werden.

Abbildung 1: Experimenteller Aufbau des HPLC Instrument zur Reinigung der amyloiden beta - Peptiden verwendet. (A) Die Pumpe quartären HPLC , ausgestattet mit einem Entgaser und Detektor mit variabler Wellenlänge auf 214 nm und 280 nm eingestellt; (B) HPLC - Säulen zur Reinigung der Amyloid - beta - Peptide verwendet, vonvon links nach rechts, 25 x 300 mm ² präparativen Säule, 7,5 x 300 mm ² semi präparativen Säule und 4,6 x 250 mm ² analytische Säule; (C) Hand Injektor mit 20 & mgr; l Edelstahl - Injektionsschleife für analytische HPLC verwendet wird ; (D) Manueller Injektor mit 10 ml Edelstahl - Injektionsschleife für die präparative und semi präparative Reinigung verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Programmieren der HPLC - Software die Reinigungsverfahren , wie gezeigt in Tabelle 1. Geben Sie den Reinigungsverfahren durch Ändern des Lösungsmittelfahrplanparameter (im Setup - Instrument Verfahren Option eingebaut in die HPLC - Software) ausgeführt werden . Schalten Sie die HPLC - Pumpe durch die "on" Taste auf der HPLC - Software klicken.
   HINWEIS: Die Pumpe Ausgangsverhältnis von Puffer A Versorgung beginnt und Puffer B durch die preparative Säule und die HPLC-Instrument.
   1. Verlassen das System für 30 min vollständig äquilibrieren.

Tabelle 1: Zeitplan für die Reinigung der Aß42 und Aβ40 Peptide, die die Säule 25 × 300 mm Polymer verwendet wird. ^einen Puffer A - H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH; ^c lief für 15 min , um die Säule vor der nächsten Injektion von Probe zu waschen; ^d Um eine Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml / min auf die HPLC - Instrumentierung zu laufen, muss die Druckgrenze auf 200 bar reduziert werden.

4. Reinigung des Aß - Peptidprobe
   Anmerkung: Das Rohpeptid durch automatisierte Festphasen-Peptidsynthese erhalten wurde. ¹⁰
   1. Man löst 3 mg rohes Aß Peptid in 4 ml der Probenlösungspuffer. Beschallen die Probe für 30-60 s bei Raumtemperatur und bei einer Frequenz von 40 kHz Auflösung zu unterstützen.
   2. Injizieren Sie die gesamte Probe auf die HPLC-Säule eine 5 ml Plastikspritze mit einer 16-Gauge ausgestattet mitNadel aus rostfreiem Stahl. Führen Sie das Reinigungsverfahren wie in Teilschritt 1.3 skizziert.
      HINWEIS: Das System ermöglicht eine Probeninjektion durch den Einsatz einer manuellen Injektor mit einer 10 ml Edelstahl - Injektionsschleife (1D) angebracht erfolgen. Die gewünschte Aß - Peptid eluieren zwischen 72 und 74 min als scharfe gelöst Peak (2C).
   3. Sammeln der Probe in einem 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Bestätigen Sie die Identität des Aß-Spitze durch direkte Injektion Massenspektrometrie des gesammelten Eluenten. ¹¹ Bewahren Sie das Eluens für bis zu 12 Stunden bei -20 ° C.
      HINWEIS: Die Lagerung der Lösung für einen Zeitraum länger als 12 h nicht aufgrund zur Oxidation des Peptids auf das Potential empfohlen.
   4. Isolieren Sie das gereinigte Peptid durch Flash Einfrieren des gesammelten aliquoten / Aliquots des Aß-Peptid in flüssigem Stickstoff und lyophilisieren. Führen Lyophilisation durch Gefriertrocknung der Probe bei einer Temperatur von -60 ° C und einem pressicher von 20 mTorr für einen Zeitraum von 24 h.
   5. Führen Sie die analytische HPLC-Protokolls, wie unten beschrieben, die Reinheit des Aß-Peptids zu bestimmen. Store-Peptide in ihrer lyophilisierten Form bei -20 ° C für einen Zeitraum von bis zu 6 Monaten.

2. Analytische HPLC-Analyse des gereinigten Aß-Protein

1. Bereiten Sie die HPLC-Puffer, wie in Unterabschnitt 1.1 beschrieben. des obigen Protokolls.
2. Setup die analytische HPLC gemäß Schritt 1.2.1 und wie in Figur 1 mit dem 4,6 × 250 mm analytische Säule (1B, Spalte ganz rechts) und dem manuellen Injektor mit 20 & mgr; l Edelstahl - Injektionsschleife dargestellt (Abbildung 1C) ausgerüstet der Instrument.
3. Programmieren der HPLC - Software die analytischen Verfahren , wie in Tabelle 2 gezeigt folgenden Anweisungen ähnlich zu denen in Schritt 1.3 ausgeführt werden .

Tabelle 2: Zeitplan für die HPLC - Reinheitsanalyse des Aß - Peptid. ^einen Puffer A - H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH; ^b 80% MeCN / 20% H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH.

4. Reinheitsanalyse des Aß - Peptids
   1. Bereiten einer 1 mg / ml-Lösung des gereinigten Peptids durch Auflösen des Peptides in der Probenpufferlösung.
      HINWEIS: Die Puffer Rezept kann in Unterabschnitt 1.1. Proteinkonzentration wird durch Messung der Protein - Absorption bei 280 nm (A _{280 nm)} bestimmt. ¹² Die m olar Extinktionskoeffizienten (ε) verwendet Konzentration zu bestimmen ist ε = 1.490 dm ³ mol ^-1 cm ^{-1. 13}
   2. Injizieren Sie 20 ul der 1 mg / ml (222 & mgr; M) Lösung auf die HPLC-Säule und führen Sie die analytische Methode, die Einrichtung in 2,3 Schritt war.
      HINWEIS: Die verbleibende Lösung nicht für die Analyse verwendet werden, können in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert, um das Aß-Peptid zu gewinnen. Die Gefriertrocknung Details können in Unterabschnitt 1.4.4 zu finden. Die Aß - Peptid werden aus der analytischen Säule zwischen 16 und 18 min (2D) eluieren. Verwenden Sie die integrierte Integrationsanalyse-Software, die die HPLC-Instrument begleitet die Reinheit des Aß-Peptids zu bestimmen. Die Reinheit wird durch die Integration von jedem der einzelnen Peaks im Spektrum bestimmt und Berechnen Peptid-peak Prozentbereich. Typischerweise sollte eine Reinigung von> 95% festgestellt werden.

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Abbildung 2: Repräsentative HPLC Spuren von Aß42. (A) Traditionelle C ₄ Silika Reinigung Bedingungen: Puffer A: H ₂ O mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA), Puffer B: MeCN (Acetonitril) mit 0,1% TFA, Gradient: 20 bis 27% Puffer B über 40 min , gefolgt durch isokratische 27% Puffer B; (B) Die präparative Reinigung der 25 x 300 mm ² Polymer Spalte, Bedingungen: Puffer A: H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Gradient : 20 bis 27% Puffer B über 70 min durch isokratische 27% Puffer B; (C) Optimierte präparative Reinigung der 25 x 300 mm ² Polymer Spalte werden die Bedingungen in Tabelle 1 beschrieben , befindet sich in Unterabschnitt 1.3 des Protokolls Beschreibungstext; (D) unter Verwendung Analytische HPLC die 4,6 x 250 mm ² Polymer - Säule, Ltgitions: Puffer A: H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Gradienten-5 bis 50% Puffer B über 30 min. Für Teile A, B und C der Spitze-Aß42 entspricht, wird durch ein Sternchen gekennzeichnet. Sammlung des markierten Aß42 peak in Teil C mit einer Reinheit von> 95% ergibt, wie in Teil D. Massenspektrometrie gezeigt wurde verwendet, um die Identität des Aß42 Peak zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die Reinigung des Aß42 Peptid , das eine Kombination aus der PLRP-S stationäre Phase und ein hoher pH - Wert der mobilen Phase führt zur Bildung eines scharfen, aufgelöst Peak für das Aß - Peptid bei einer Retentionszeit zwischen 72 und 74 min (2C) verwendet wird . Bestätigung der Identität der Peaks wird durch direkte Injektion Massenspektrometrie des gesammelten Eluenten erfolgen. Der Eluent kann für bis zu 12 h bei -20 ° C in Lösung gelagert werden. Längere Lagerzeiten können bei der Oxidation des Proteins führen. Um das gereinigte Peptid zu isolieren, ist der Eluent in flüssigem Stickstoff eingefroren und lyophilisiert. Analytische HPLC des gereinigten Peptids zeigt eine Reinheit von> 95% (Figur 2D). Das gleiche Verfahren kann verwendet werden , um die Aβ40 - Peptid (3A) ohne Modifikation des Verfahrens zu reinigen. Analytische HPLC zeigt eine Reinheit von Aβ40 zu mehr als 95% (3B).

Abbildung 3: Repräsentative HPLC Spuren von Aβ40. (A) Optimierte präparative Reinigung der 25 x 300 mm ² Polymer Spalte, Bedingungen sind in Tabelle 1 beschrieben , befindet sich in Unterabschnitt 1.3 des Protokolls Beschreibungstext. Die Peak-zu Aβ40 entspricht, mit einem Sternchen gekennzeichnet. (B) Analytische HPLC unter Verwendung der 4,6 x 250 mm ² Polymer Spalte Bedingungen: Puffer A: H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Puffer B: 80% MeCN / 20% H ₂ O mit 20 mM NH ₄ OH, Gradient : 5 bis 50% Puffer B über 30 min. Sammlung des markierten Aβ40 peak in Teil A mit einer Reinheit von> 95% ergibt , wie in Teil B. Massenspektrometrie gezeigt wurde verwendet , um die Identität des Aβ40 Peak zu bestimmen. Bitte klicken siee eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Um zu bestätigen , daß das gereinigte Peptid oligomeren Mischungen bilden können, führten wir photoinduzierten Vernetzung des unmodifizierten Proteine (PICUP) , wie zuvor beschrieben , ^{14, 15} und konnten Oligomerbildung robust zu beobachten. ¹⁰

The HPLC purification of the Aβ peptide is highly dependent upon the choice of both the stationary phase employed in the purification and the mobile phase chosen to elute the peptide. The low isoelectric point of the peptide and high propensity for aggregation render traditional chromatographic conditions for the separation of hydrophobic proteins (C4 or C8 stationary phase coupled with an acidic mobile eluent) challenging, with the Aβ peptide eluting as a prolonged broad, non-resolved peak (Figure 2A).

To circumvent this issue, the PLRP-S stationary phase, chemically stable at high pH was found to be effective for the purification of the Aβ peptide (Figure 2B and 2C). The use of a high pH mobile phase minimized the degree of aggregation, and when optimized, gave rise to a sharp, well-resolved peak. In the optimized protocol, the percentage of buffer B was rapidly switched from 20% to 27% at the 52-minute time point and as a result, gave rise to a well-defined Aβ peak (Figure 2C). This optimized protocol relies on all of the hydrophobic impurities being eluted from the column during the initial 20 to 24.5% increase in buffer B concentration. If impurities are found which are of a similar hydrophobicity as the Aβ peptide, then further optimization of the HPLC protocol may be warranted. The optimized method was highly reproducible amongst individual batches of synthesized Aβ and was capable of purifying both 40 and 42 variants of the peptide without any changes to the optimized procedure (Figure 3). For both peptides, the purity as determined by analytical HPLC was found to be greater than 95%.

Given the reports of trace impurities altering the aggregation propensity of the Aβ peptide, it is advisable that an orthogonal biophysical characterization be employed to confirm that the purified peptide is able to undergo oligomerization. Using previously reported protocols we chose to perform PICUP.^14,15 PICUP analysis of the purified proteins demonstrates the characteristic monomer through hexamer population distribution for the Aβ40 peptide and the monomer through heptamer distribution associated with the Aβ42 peptide.¹⁰ These results confirm that purification of the Aβ peptides using the PLRP-S stationary phase and a high pH mobile eluent results in Aβ proteins that are capable of aggregation.

The purification procedure reported is designed to be able to purify up to 3 mg of the Aβ peptide in a single chromatographic run. For this procedure, it is critical to set the flow rate of the HPLC instrument at 6 mL/min. If lower flow rates of the HPLC pump are used, the HPLC run time should be extended to accommodate this. Conversely, the use of higher flow rates may warrant a reduction in the HPLC run time. However, reduction of the run time can result in the co-elution of the Aβ peak with other peaks and therefore lower the purity of the Aβ peptide collected. Furthermore, the HPLC instrumentation and size of the chromatographic column used for purification can greatly affect the amount of material that can be purified in a single run. If no peak is produced at the expected eluent time of the Aβ peptide, and a large peak is produced at the eluent time corresponding to the solvent front, then too much material was initially loaded onto the column. Reducing the amount of material injected onto the HPLC column for each run will circumvent this problem. Once the Aβ peptide has been purified, it is highly recommended that the solution be lyophilized as quickly as possible. Prolonged storage of the peptide in solution can lead to oxidation of Aβ and therefore formation of impurities. The purity of the Aβ peptide should always be determined by analytical HPLC. Trace amounts of impurities can alter the aggregation propensity of the peptide dramatically. If the analytical HPLC trace shows the presence of impurities, then the sample should be re-subjected to the HPLC purification protocol and its purity re-determined by analytical HPLC.

It is hoped that this tailored procedure for the purification of the Aβ42 and Aβ40 peptides will be of benefit for the scientific community and allow users to obtain high purity Aβ capable of oligomer formation. It would be expected that this procedure could be adapted to other amyloidogenic peptides that are difficult to isolate and purify.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

The authors would like to thank Agilent for their technical assistance. Kate Markham and Rafael Palomino are credited for their initial help in the synthesis and purification of the Aβ peptide and Dr Hsiau-Wei Lee is thanked for his help in preparing Figure 1 of the manuscript.