Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

İnsan postmortem beyin leptomeninkslerde eksplant kültür protokolü 6-8 hafta içinde fibronektin pozitif meningeal fibroblastlar elde ve yaklaşık 20-30 mikrogram milyon hücre cryopreserve için teknik sağlam ve basit bir yoludur.

Büyük ilerleme Parkinson hastalığının klinik karakterizasyonu yapılmış olsa bile, bazı çalışmalar Parkinson hastalığı tanısı patolojik klinik olarak teşhis Parkinson hastalığı% 25 kadar teyit olmadığını bildirmektedir. Bu nedenle, doku yanlış tanı yüksek oranda olabilir idiyopatik Parkinson hastalığı olan klinik tanısı alan hastaların toplanan; Bir klinik öncesi bir model beyhude olabilir gibi dolayısıyla bu tür dokulardan in vitro çalışmalar Parkinson hastalığı incelemek için.

Parkinson hastalığının bir teyit nöropatolojik tanısı ile postmortem insan leptomeningial toplama ve nigrostriatal hücre kaybı ve Lewy cisimcikleri denilen hücre içi protein kapanım ile karakterize tarafından, bir klinik gözlenen parkinsonizm altta yatan başka bir hastalık süreci (örneğin tümör, damar sertliği) neden olmadığından emin olabilirsiniz.

Bu protokol, miyodiseksiyon ve meningeal fibroblast kültürü türetilmesi için postmortem insan leptomeninks hazırlanması ts. Bu prosedür sağlam ve yüksek bir başarı oranına sahiptir. Beyin tedarik genellikle steril koşullar altında yapılır değil gibi kültürün meydan kısırlık olduğunu. Nedenle, penisilin, streptomisin ve amfoterisin B bir kokteyli ile kültür ortamı tamamlanması önemlidir

Parkinson hastalığı olan otopsi doğrulanmış vakaların gelen Meningeal fibroblast türetme Parkinson hastalığı in vitro modelleme için temel sağlar. Meningeal fibroblastlar 3-9 gün numune hazırlandıktan sonra ortaya çıkar ve yaklaşık 20-30 milyon hücre 6-8 hafta içinde dondurularak saklanabilir. Meningeal fibroblast kültürü homojen ve hücreler fibronektin, meninksler tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir işaretleyici ifade eder.

dura mater, araknoid ve pia mater: zarları beyni korumak üç membranların oluşur. Daha yakın zamanlarda, meninksler da beyin gelişimi ve beyin homeostazında ¹ önemli bir rol oynadığı kabul edilmiştir. Zarları mezenşimal ve nöral tepe türetilmiş hücrelerden elde edilir ve ilginç bir şekilde, in vitro ve in ^{vivo, 2, 3, 4 ve} transplantasyon sonrası nöronlar ortaya çıkmasına neden olabilir meninks ikamet eden progenitör hücreler gösterilmiştir. Bunlar dopaminerjik nöronlar ⁵ embriyonik kök hücre farklılaşması için stromal hücre türevli indükleyici aktivite gösterirler zarları kültürleri de başarılı bir şekilde, besleyici tabakalar olarak kullanılmıştır. Ayrıca, leptomeninkslerde doğrudan iskemik koşullarda ⁶ altında nöronlar, astrositler ve oligodendrositlere içine ayırt etme potansiyeline sahiptir.

Bu protokol için, insan postmortem zarları örnekleri topluca, araknoid ve pia mater toplanan leptomeningial denilen ve araştırma amaçlı bir insan beyninin bağışı parçası olarak temin edilir edilir. beyin Diseksiyon ölüm 24 saat içinde gerçekleştirilir, bu protokolde burada gösterildiği gibi leptomeninkslerde Örnek daha sonra 6-8 saat içinde daha fazla işlem için soğuk büyüme ortamı içinde yerleştirilir.

Bu protokol, hastaya primer leptomeninkslerde hücre kültürü gelişimi için diseksiyon ve insan beyin zarı numunelerin hazırlanmasını tarif etmektedir. Doku, yaklaşık 3 mm x 3 mm kare 25-30 parçalar halinde kesilir. Üç adet her biri 6-kuyu yerleştirilir jelatin kaplı iyi ve yuvarlak cam lamelleri aşağı düzenledi. zarları diseksiyon yaklaşık 25-35 dakika sürer. Bu kültürün ana zorluk beyin tedarik, taşıma ve diseksiyon olarak sterilite genellikle steril koşullar altında yapılır edilmemektedir. Therefore, penisilin, streptomisin, ve amfoterisin B'nin bir kokteyl ile kültür ortamını desteklemek ve ayrı ayrı kültür doku parçaları çok iyi yemekler kullanmak önemlidir.

Meningeal fibroblast akıbet genellikle ilk hafta içinde ortaya çıkar. Hücreler birleştiklerinde kadar Ortam, her iki ya da üç günde bir değiştirilir ve hücreler, enzimatik olarak geçirilir. Meningeal fibroblastlar dondurulması medyada ml / şişe başına 1 Milyon hücre Kriyoprezerve bulunmaktadır. Bu protokol ile, 20-30.000.000 meningeal fibroblastlar dondurulması için 6-8 hafta içinde elde edilebilir. Bu Meningeal fibroblastların Mansap uygulamaları hastalık araştırması, doğrudan nöronal farklılaşma ya da hastalık mekanizmalarının anlaşılması için ve ilaç geliştirme leptomeninks gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin derivasyon için birincil kültürleri vardır.

Beyin bağış kaydı bağışlamak için kendi niyet tescil ile belgeleri içerir. yasaların izin verdiği şekilde doku alımı için otopsi izni yakın akraba tarafından sağlanmaktadır. Toplanan otopsi örnekleri kullanarak araştırma çalışmaları Sağlık Sigortası Taşınabilirlik ve Sorumluluk Yasası (HIPAA) düzenlemelerine uyum sağlamak için kurumsal inceleme kurulu (KİK) tarafından gözden geçirilmektedir.

NOT: leptomeninkslerde örnekleri beyin diseksiyonu sırasında beyin dissektör veya nöropatolog ile toplanır ve 25-30 ml Meninksler büyüme ortamı içeren 50 ml konik tüpler saklanır. Numune, numune hazırlama kadar 4 ° C'de saklanır. hücre yaşamı sürdürme kabiliyeti zaman otopsi azalır gibi işlem mümkün olan en kısa sürede yapılmalıdır.

1. Ayar leptomeninkslerde Diseksiyon başlayarak önce

NOT: - 1.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 1.1 adımlar.

1. 375 mL Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde birleştirerek zarları büyüme ortamının hazırlanması, fetal sığır serumu, 100 mL, 5 mL 10 mM esansiyel olmayan amino asitler, 5 ml 200 mM L-alanil-L-glutamin, 5 ml 100 mM sodyum piruvat, 5 ml 10,000 U / ml penisilin / streptomisin ve 5 mL, 250 ug / ml Amfoterisin B 500 mL filtre ünitesinin. Filtre ve karıştırın. kadar dört hafta ortam kullanın.
2. diseksiyon başlamadan önce biyogüvenlik kabini tüm malzemeleri koyun: 4x Petri kapları, 2x 6-kuyu plakaları, 2x neşter, 15-20 sterilize 15 mm kapak fişleri, pipetler aspire fosfat tampon salin (PBS), serolojik pipetler.
3. 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna steril otoklava% 0.1 jelatin çözeltisi 1 ml. 30-60 dakika boyunca bir kenara plaka ayarlayın. 2x 6-kuyu tabak hazırlayın.

Leptomeninkslerde Numune 2. Hazırlık

NOT: - 2.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 2.1 adımlar.

1. PBS yaklaşık 10 ml ekleyinsteril 10-cm doku kültürü çanak ve çanak meninks numuneyi yerleştirin. forseps kullanarak, yavaşça kan kaldırmak için PBS ile leptomeningial yıkayın.
2. Taze 10 ml PBS ihtiva eden yeni bir 10 cm'lik bir doku kültürü kabı içine meninksleri aktarın ve yıkama devam edin. mümkün olduğunca çok kan çıkarmak için gerektiği kadar tekrarlayın.
3. yaklaşık 6 cm x 6 cm büyük parça halinde dokuya leptomeninkslerde kesilmiş iki neşter, kullanma.
4. yatay laminer akış kaputu bir mikroskop bir kültür çanak ve transfer yerleştirin kapağı.

Leptomeninkslerde Doku 3. Diseksiyon

NOT: - 3.3 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 3,1 adımlar.

1. en az 20-25 3 mm x 3 mm parçaları oluşturmak için yeterince büyük leptomeninkslerde parça (adım 2.3) bir bölgeden kan damarlarını çıkarın. bir neşter ile yerde leptomeningial tutun ve diğer, nazik ve sığ kazıma mo kullanıntion damarları ayırmak.
2. Hazırlanan bölgeden doku küçük kareler kesin. İlk büyük parçaları yapma ve daha küçük bölümlere olanlar dilimleme kademeli süreçte kesin.
3. Sallanan hareketi ile doku kesmek için yerinde doku ve başka neşter tutmak için bir neşter kullanabilirsiniz. doku kıvamına bağlı, birbirine karşı neşter slayt zordur. Bu sadece ayrı doku gözyaşı ve düzensiz kenarları sonuçlanır olacaktır.
4. 20-25 3 mm x 3 mm parçalar vardır kadar yarısında parçaları kesme devam edin.

Doku kültürü plakaları üzerine Dissected zarları Adet 4. Transferi

Not: Aşama 4, bir biyo-güvenlik kabini içinde yapılacak olan.

1. 6-çukurlu plaka (adım 1.3) aspire jelatin. Her bir oyuğa zarları büyüme ortamı 1 ml. Steril forseps kullanarak, her kuyuya 3-4 biyopsi parçaları yerleştirin.

M üzerinde Kapak Slips 5. YerleştirmeEninges adet

NOT: - 5.2 diseksiyon mikroskobu kullanılarak yatay laminer akış kaputu içinde yapılmalıdır 5.1 adımlar.

1. kuyu başına 1-2 steril 15 mm yuvarlak lamelleri ile parçaları örtün.
2. adet plakanın alt dokunmadan emin olmak için forseps ile sıkıca bastırın. Bu iyi altına, doku parçalarının bağlanmasına izin vermektedir.
3. 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör içine 6-plaka.

6. Hücre kültürü Bakım

NOT: - 6.3 biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır olan 6.1 adımlar. lamelleri taşımak ve meninks parçaları çıkarmak değil gerektiği gibi özenle kültür kaplarına anlaştım.

1. kültür içinde 2 gün sonra, her bir oyuğa taze zarları büyüme ortamı ilave 1 ml.
2. 7. Günde dikkatle medya aspire ve her iyi taze medya 2 mL ekleyin.
3. Gün 9 sonra büyüme ortamı her değişmeye devamkültür kadar geçen gün birleşen.

7. Pasajlanması

NOT: Tüm adımlar biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır vardır. Meningeal fibroblastlar Meningeal doku parçaları dışarı göç ve büyük kültür kabına menengial fibroblastlar, kültür geminin kenarlarına doğru büyümeye genişletmek başlar sonra.

1. 15-30 dakika süreyle% 1 jelatin ile Pasajlanması, ceket kültür çanak başlamadan önce.
2. Aspire 6-iyi çanak medya ve 2 ml PBS ile yıkayın hücreleri.
3. Her kuyucuğa tripsin / EDTA 1 ml ilave edilir ve 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Kapak slipi veya bu aşama için zarı doku kaldırmak için gerekli değildir.
4. Hücreler yuvarlak ve, ayırmak kültür ortamı 2 mL ekleyin başladığınızda.
5. Pipet hücreleri yukarı ve tamamen tüm kümeleri bozmak ve büyük kültür çanak hücre çözümü transfer aşağı.
6. 1 ila 3: 1 bir oran için 4 üç 6 oyuklu tabaklar hücreleri birleştirmekbir T75 kültür çanak.
7. Meningeal fibroblastlar hücreleri T75 kültür şişelerinde birleştirilebilmeli sonra, hücreleri trypsinize ve 1x10 ⁶ hücre / ml şişe başına en kriyoprezervasyon medya cryopreserve. konfluan meningeal fibroblastlar Tek T75 kültürü şişesi yaklaşık 5-7 milyon hücre içeriyor.

Immün Meningial Fibroblast 8. Karakterizasyonu

Not: prosedürü başlamadan önce, PBS (bloke tamponu) içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi,% 5 normal keçi serumu hazırlamak% 0.3 Triton X-100, PBS (permeabilizasyon tamponu), primer ve sekonder antikor çözeltileri ve 1 ug / mL Hoechst 33342, 10 mg / ml stok PBS içinde seyreltilmiştir.

1. 8-iyi odasının slayt Tohum 15.000 30.000 meningeal fibroblastlar% 0,1 jelatin ile kaplı.
2. Hücreler eklendiğinde 24 saat sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca oyuk başına 100 uL% 4 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.3 Triton X-100, 150 uL hücreler geçirgenliği. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
4. Oda sıcaklığında 1 st için bloke etme çözeltisi 200 uL (PBS +% 5 normal keçi serumu) ekleyin.
5. Engelleme çözüm aspire ve çözümü engelleme seyreltilmiş istenen birincil antikor 150 mcL ekleyin. çift ​​boyama için, aşağıdaki gibi, buz üzerinde ayrı bir santrifüj tüplerine birincil antikor çalışma dilüsyonları hazırlayın:
   1. Anti-Fibronektin + 1 300 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Nestin 200 seyreltme 1 hazırlayın. Anti-SERPINH1 + 1 250 seyreltme: çözümü engelleme, anti-Tuj1 1000 seyreltme 1 hazırlayın. 1 hazırlayın: Anti-SERPINH1 250 seyreltme + 1: çözümü engelleme, anti-Sox2 100 seyreltme
6. gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
7. 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
8. Bir çalışan 1 hazırlayın: ikincil antikorlar anti-tavşan keçi floresan etiketli 400 seyreltme (yeşil; Ex / Em ² 495/519 nm) ve keçi anti-fare (kırmızı Ex / Em ² 590/617 nm) bloke çözeltisi içinde ve her bir kuyucuğa 100 uL ekleyin. Oda sıcaklığında, karanlıkta, 1 saat boyunca inkübe edilir. Daha sonra 1 x PBS ile bir kez kuyu yıkayın.
9. Her bir çözüm de ve 3 dakika süreyle karanlıkta inkübe edilir; / ml Hoechst 1 ug ile 100 uL 33342 (Örnek / Em ² 358/461 nm mavi) ekleyin. iyi son 1x PBS yıkama bırakarak, 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve alüminyum folyo ile slayt kapsamaktadır.
10. floresan mikroskop altında hücrelerin analiz.

leptomeninkslerde işleme protokolü başarılı olmuştur bu beyin otopsi aralığının uzunluğuna bağlıdır rağmen, meningeal fibroblast akıbet, üç ile dokuz gün diseksiyonu sonrası gözlenen ilk edilir. Şekil 1, dört farklı donörlerin meningeal fibroblast kültürleri göstermektedir. Şekil 1A 10 saat 20 dk otopsi aralığına sahip 88 yaşındaki bir donörden işlendikten sonra doku dört gün etrafında bir cam kapak slip (koyu çapraz çizgi) ve fibroblast akıbet aşağı tutulan bir leptomeninkslerde parçasını göstermektedir. Şekil 1B 70 yaşındaki donör ve 11 saat 45 dakika otopsi aralıktan seyrek fibroblast akıbet yedi gün sonrası işleme gösterir. Şekil 1C fibroblast akıbet 88 yaşındaki donör ve 24 saat postmortem aralığından diseksiyonu sonrası 13 gün gösterir. Şekil 1D T75 Vess içine geçişli bir Birleşik kültür göstermektedirEl ve hücreler, bu aşamada olarak dondurularak saklanabilir.

Meningeal fibroblastlar bipolar ya da çok kutuplu ve uzamış veya düzensiz şekiller (Şekil 2). Bunlar endoplazmik retikulum (Şekil 2A-2C) lokalize glikoprotein fibronektin ve fibroblast markör SERPINH ekspresyonu ile karakterize edilir. Meningeal fibroblastlar farklılaşmamış kök hücreleri (Şekil 2A) için bir gösterge transkripsiyon faktörü SRY (Cinsiyet Bölge Y belirleme) -Box 2 (Sox2) için immuno-reaktif değildir. Bununla birlikte, Leptomeningeal fibroblastlarının bir alt tip VI ara filaman Nestin bir nöral kök hücre işaretleyici (Şekil 2B) ve nöron spesifik sınıf III beta-tubulin (Tuj1) (Şekil 2C) için pozitiftir.

Şekil 1.Dört farklı vericiden alınan meningeal fibroblast gelişimlerine örnekler. A) leptomeninkslerde doku parçası doku etrafında bir cam kapak slip (koyu çapraz çizgi) ve fibroblast akıbet tarafından basılı tutulduğunda 10 saat 20 dk otopsi aralığına sahip 88 yaşındaki vericiden alınan dört gün işleme sonra gözlenmiştir. 70 yaşındaki donör ve 11 saat 45 dakika otopsi aralık B) Seyrek fibroblast akıbet yedi gün sonrası işleme. C) 13 gün 88 yaşındaki bir donörden ve 24 saat postmortem aralığından diseksiyonu sonra Meningial fibroblast sonucudur. D) Konfluent meningeal fibroblast kültürü T75 kabına geçirilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2. immuno menenjlerin için Aining, hücre, nöral kök hücre ve nöron işaretlerini kaynaklanıyor. A) İmmünofloresan fibroblast belirteçleri SERPINH1 (yeşil için boyama) ve kök hücre işaretleyici Sox2 (kırmızı). SERPINH1 Tüm sayılan hücre çekirdeğinde cinsinden ifade edildi. Kök hücre işaretleyici Sox2 bu leptomeninkslerde kültüründe tespit edilmemiştir. Meninksler özel işaretleyici fibronektin (yeşil) ve nöral kök hücre belirteci Nestin (kırmızı) B) İmmünfloresan boyama. sayılan hücre çekirdeğinin% 52,1 Nestin ve Fibronektin hem pozitif idi. C) SERPINH1 (yeşil için İmmünfloresan boyama) ve nöronal belirteç Tuj1 (kırmızı). sayılan çekirdeklerin% 6.9 SERPINH1 ve Tuj1 için pozitif idi. Hücre sayımı verileri ImageJ manuel Hücre Sayım Cihazı Multi-Select aracını kullanarak belirlenmiştir. Tek bir boyanmış resim yüzde olarak her bir belirteç için pozitif hücrelerin sayısı ile karşılaştırıldığında DAPI-pozitif hücrelerinin sayılmasıyla değerlendirilmiştir.sıska "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

çıkıntıle 1: Hücresel akıbet Timeline.

Bu protokol, beyin bağışı ile birlikte toplanan insan postmortem leptomeninks bir meningeal fibroblast kültürü elde etmek için basit ve sağlam bir protokol tanımlamaktadır. postmortem insan malzemeden hücre kültürleri elde etmek için protokoller çok az açıklamaları vardır. İki çalışma, Cilt türevli, fibroblast kültürler ^{7, 8, 9,} bir çalışma dura numuneler ¹⁰ tarif eder ve bir başka olmayan dondurulan dondurulmuş dura örnekleri ¹¹ tarif etmektedir.

Biz dondurulması öncesinde yeterli akıbet ve genişleme sağlamak için her bir kuyu 2-3 doku parçaları (yaklaşık 3 mm x 3 mm) iki adet 6-kuyu plakaları hazırlamak. Meninksler parçaları nazik bir yerde tutmak için doku parçaları üzerine steril bir cam kapak kayma basarak kültür çanak bağlı olduğu önemlidir. Bir lamel olmadan, beyin zarları adet hayır olacakt kültür çanak alt takmak. doku parçaları, plastik alt ile doğrudan temas halinde olduğu zaman başarılı sonucudur ancak görülmektedir. doku parçaları kültür ortamı float varsa, doku hiçbir hücre akıbet görülmektedir. Bu örnekleri kurumasına ve ardından gemiye büyüme ortamının 1 ml kadar eklememek için yaklaşık 500 mcL büyüme medya ile yapılmalıdır. Bundan başka, yer kapak slipi üzerinde tutmak için silikon kullanmak gerekli değildir.

Parçalar daha küçük 3 mm x 3 mm ise, aşırı büyüme yavaştır ve bazı durumlarda hiçbir konfluen kültürlerin kurulabilir. Çok seyrek hücreleri büyümek değil önemlidir ve biz 1 bir bölme oranı tavsiye: 3 1: 4. Bireysel küçük kuyu daha iyi yönetilmesi potansiyel kirlenme için izin verir. Wells tek tek beslenebilir ve pipetler kuyular arasında değiştirilmelidir.

Biz başarılı bir şekilde po ile 9 postmortem örneklerinden Meningeal fibroblastlar elde var10-24 saat arasındaki süreyi stmortem. donörler yaşı 70 ila 88 yaş ve 8-31 yaş arası, Parkinson hastalığının hastalık süreleri vardır. Biz ilk hücreleri (9 güne kadar) büyür önce uzun bir otopsi aralıklarla dokuların uzun sürer dikkat edin. kısa otopsi aralıklarla numuneler, biz en kısa sürede 3 gün hazırlandıktan sonra da büyümesini gözlemlemek. Biz donör yaşına göre büyümede fark fark değil, ama biz sadece bağışçılar> 70 yıl vardı.

Yöntemin önemi yalnızca o anda otopsi ^12'de teyit edilebilir Parkinson ^{hastalığı, 13,} gibi sporadik nörodejeneratif hastalık için bir birincil hücre kültürü türetme ¹⁴ hayır tam klinik özelliklerini, görüntüleme teknikleri ya da can biyobelirteçlerini orada tanımlayan beri hayat ¹⁵ boyunca kesin tanı sağlar. Biz deve önceden varhastalık mekanizmalarını ^{17, 18} uyarılmış pluripotent kök hücreleri oluşturmak ve okumak için bize izin hangi öncelikle Parkinson hastalığı ¹⁶ genetik teyit durumlarda deri biyopsisi gelen fibroblast derivasyon için bir protokol loped, ama bu yeni protokol doğrudan nöropatolojik değişiklikleri karşılaştırmak için çok önemli olacak sporadik Parkinson hastalığı için in vitro bulgular. Bildiğimiz kadarıyla, bu ölüm sonrası insan leptomeninks gelen Meningeal fibroblastlar kaynaklanan ilk protokoldür.

Meningeal fibroblast kültürleri, hastalığın ya da yaralanma ya da uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ya da düzensiz Parkinson hastalığı ya da diğer nörodejeneratif hastalıkların ¹⁹ için gelişmiş klinik öncesi modellerde nöronal kültürler direkt dönüşüm nükleer yeniden programlama için bir kaynak olarak ilgili moleküler mekanizmalarının incelenmesi için de kullanılabilir. Bu huAdam hasta türevi modeller temel sağlamak ve kişiselleştirilmiş ve rejeneratif tıpta gelişmeler hızlandırmak.

The authors have nothing to disclose.

Development of this protocol was funded by private donations directed to the Parkinson's Institute Brain Donation Program.