Serum- toplanması ve Besleyici serbest Fare Embriyonik Hücre içermeyen Yaklaşım Hücre klimalı Orta Kök

Bu protokol, serumdan türetilmiş fare embriyonik kök hücrelerin içinde (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) için bir yöntem sağlar (fetal inek serumu, FBS) - ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) bir hücrenin içermeyen koşullar -ücretsiz yaklaşım. Bu yaşlanma ve yaşlanma ile ilişkili hastalıkların tedavisi için uygun olabilir.

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Bu protokolün amacı, serum- ve besleyici içermeyen kültür koşullarından fareye embriyonik kök hücre (Mesc) -conditioned ortamı (Mesc-CM) toplamak ve biyolojik fonksiyonları karakterize etmektir.

Genel olarak, embriyonik kök hücreler (EKH) nedeniyle kendini yenileme ^1-3 onların pluripotensin ve kapasite rejeneratif tıp ve hücre tedavisinde büyük bir potansiyele sahiptir. Ancak, kök hücrelerin doğrudan nakli gibi bağışıklık reddi ve tümör oluşumu ^4,5 gibi çeşitli sınırlamalar vardır. Bu nedenle, bir hücre barındırmayan bir yaklaşım rejeneratif tıpta ve yaşlanma müdahaleler ^6,7 için alternatif bir tedavi stratejisini sağlayabilir.

Yaşlılık büyüme durması, değişmiş hücre fizyolojisi ve davranışları sürekli devlet tarafından karakterize doku ve organların yaşlanması, bir hücresel meslektaşı olarak görülüyor. kanser dahil yaygın hastalıklar, kardiyovasküler hastalık, t ana risk faktörüdür Yaşlanma2 diyabet ype ve nörodejenerasyon ^8. Yaşlanmanın bariz özelliklerinden biri kök hücre yaşlanması ve bitkinlik ⁹ kaynaklanan dokuların rejeneratif potansiyelinin, düşüş olduğunu. Birçok önemli çalışmalar, sürekli yaşlanmayı geciktirmek ve ömrünü uzatmak için yeteneği var rapamisin ^9, resveratrol ^10, ve metformin ¹¹ ve kan yoluyla bulaşan sistemik faktörler, yani GDF11 ¹² gibi farmakolojik molekülleri göstermiştir.

Bu çalışmada, Mesc-CM, serum faktörleri ve MEF'lerden salgısal faktör kontaminasyonu ortadan kaldırır serumsuz (fetal inek serumu, FBS) ve besleyici (fare embriyonik fibroblastlar, MEF'ler) katmanları hasat edilmiştir. dolayısıyla Mesc özgü salgı faktörlerin doğru tespit etkin bir serum- ve besleyici içermeyen CM izin Bu koşullar.

Bu önerilen protokol nispeten yüksek verimli, etkin maliyet ve kolayçalıştırmak için. Bu teknik, yaşlanma ile ilişkili hastalıklar ve diğer yenileme için girişimler karşı güvenli ve potansiyel olarak avantajlı bir hücresiz terapötik bir yaklaşım geliştirilmesi için kullanılabilecek bir anti-yaşlılık etkisi aracılık edebilen Mesc türetilen çözünür faktörlerin tanımlanması, kavranmasını sağlar tedaviler.

Not: serum- ve besleyici-CM toplama protokolün bir şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Malzemeler (MEFS Hazırlanması, Orta, Tabaklar, ve Çözümler)

1. Kültür MEF'ler orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS (ESC kalitesi), 50 birim / ml penisilin ve 50 mg / ml streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) Supplement.
2. Kurulmuş bir rutin protokolü ¹³ aşağıdaki embriyolar MEFS ayırmak ve MEF ortamda onları korumak.
3. kültüre mESCs ortamının 500 ml hazırlayın. DMEM% 15 FBS ve 2 mM L-glutamin, 100 uM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100 uM β-mersaptoetanol, 100 birim / ml, lösemi önleyici faktörü (LİF), 50 birim / ml penisilin ve 50 ile desteklenir mg / ml streptomisin.
4. % 0.1 jelatin çözeltisinin 5 ml'si ile 10 cm hücre kültür kaplarına kaplanarak jelatinleştirilmiş plakaları (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) hazırlayın. En az 10 dakika süreyle inkübe edin oda sıcaklığında.
5. mESCs bir serumsuz durum için azaltılmış serum ortamı 500 ml hazırlayın. sodyum bikarbonat, 1.2 g (pH 7.0) serum ortamında Azaltılmış ek. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre.
6. yaşlanmayla ilişkili β-galaktosidaz (SA β-gal) yaşlanmış hücrelerin saptanması için boyama çözeltisi hazırlayın: 1 mg / ml X-gal, 40 mM sitrik asit / sodyum fosfat tamponu (pH 6.0) (dimetilformamid, DMF içinde çözülmüş), , 5 mM potasyum ferrisiyanür, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 150 mM NaCI ve 2 mM _MgCl2 ^14.
   DİKKAT: (Tehlikeli) DMF toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin. Bir davlumbaz kullanın.
7. Kültür insan dermal fibroblastları (HDF'ler, NHDF-Ad-Der fibroblast) orta 500 ml hazırlayın. % 10 FBS ve 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin ile DMEM Supplement.

NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın.

1. 15 cm'lik bir hücre kültür kabı mitomisin C, 10 ug / ml ihtiva eden MEF ortam 20 ml MEFS tedavi edin. 37 ° C de 2 saat ve% 5 _CO2 inkübe edin.
2. MEF'lerden orta aspire. PBS ile üç kez hücreleri yıkayın. Tripsin-EDTA (TE, 1 x) 3 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 _CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, 300 x g, 3 dakika boyunca MEF orta ve santrifüj 6 ml TE nötralize.
3. MEF ortam 5 ml içinde süspanse. tripan mavisi boyama ve hemasitometre kullanarak elde edilen hücre süspansiyonu hücre sayısını belirlemek. MEF ortam içinde 10 cm'lik bir hücre kültür kabı başına 2 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda Plaka etkisizleştirilmiş MEF'ler (besleyici). 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 inkübe edin.
4. üzerinde (besleyici kaplama sonrası Mesc orta MEF ORTA 24 saat değiştirinErtesi gün).
5. Mesc ortamı ile besleyici 2 x 10 ⁶ hücre yoğunluğunda levhaya mESCs (G4 F1 hibrit ES hücre). 37 ° C'de 48 saat% 5 _CO2 inkübe edin.
   NOT: Mesc-CM anti-aging etkisi alt geçit sayısı mESCs ^15-17 kullanıldığında olasılıkla güçlüdür. Biz Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü, Mount Sinai Hastanesi, 25 Orde Street, Toronto, ON, M5T 3H7, Kanada Dr. Andras Nagy bir G4 Mesc hattı satın aldı.
6. Bir% 70-80 alt konfluent durumda nispeten daha yüksek bir yoğunluğa ve geçiş hücreleri tutun. günlük taze Mesc orta orta değiştirin.

3. Serum- ve toplama besleyici içermeyen, koşullu ortam (Şekil 1B ve 2B)

NOT: Bir hücre kültürü biyolojik güvenlik kabini tüm adımları uygulayın.

1. 5 ml PBS ile Mesc plaka durulayın. TE (2.5 x) 1 ml ilave edilir ve 37 ° C de 3 dakika karıştırıldı ve% 5 _CO2 inkübe edilir. 3 dakika sonra, Mesc Mediu'nun 2 ml TE nötralizem ve 300 x g 'de 3 dakika süre ile santrifüj.
2. Mesc ortamı her jelatin kaplı kültür kabı (5 jelatinleştirilmiş levhalar / 1 Mesc plaka) içine Mesc orta ve plakanın 1 mi, 5 ml içinde süspanse. 37 ° C 'de kültür ve% 5 _CO2 80-85 kadar,% konflüansa ulaşılır.
3. Üç yıkama, toplam yıkama başına 10 dakika için hücreler (10 cm plaka başına 8 mi) karşılamak için yeterli PBS ile mESCs yıkayın. 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 için azaltılmış serum Ortamda inkübe edin.
   NOT: yıkama aşaması FBS bulaşmasını önlemek için önemlidir. Kuluçka süresi ^18,19 takip etmek önemlidir.
4. 2,500 x g'de 20 dakika boyunca 50 ml'lik konik bir tüp ve santrifüj içine Mesc-CM toplayın. santrifüj sonra süpernatant solüsyonu (CM) toplayın. 0.2 mikron şişe üstü filtre ile filtre.

Fare Embriyonik 4. Etkileri Kök Hücre klimalı Orta (Mesc-CM)

Not: Mesc-CM etkileri gibi çeşitli yöntemler ile doğrulanmıştırSA β-gal tahlil, hücre döngüsü analizi ve QRT-PCR.

1. SA β-gal testi (Şekil 3A)
   1. HDF ortamında 6 kuyulu levhalarda kuyu başına 2 x 10 ⁴ hücre yoğunluğunda tohum HDF'ler. 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 _CO2.
   2. bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C'de 72 saat% 5 _CO2 inkübe edin. Kontrol ortamı mESCs yokluğunda bir jelatin kaplı tabak (serum ortamında azalır), serumsuz ortamda elde edilir.
   3. İki yıkama, toplam yıkama başına 30 saniye için hücreler (6-çukurlu plaka başına 2 mi) karşılamak için yeterli hücrelerin PBS ile yıkayın. fiksasyonu için% 3.7 paraformaldehid (PFA) ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
      DİKKAT: (Tehlikeli) Paraformaldehyde toksik ve korozif bir çözümdür. Çözüm işlerken kişisel koruyucu giysiler (örneğin, nitril veya lateks eldiven, bir laboratuvar önlüğü, gözlük ve) giyin.Bir davlumbaz kullanın.
   4. sabitleme çözüm aspire. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile sabitlenmiş hücreler yıkanır.
   5. (1-2 mi göz başına 6 çukurlu bir tablanın bir çukuru) SA β-gal ile boyama solüsyonu ekleyin. 37 ° C'de 17.5 saat süreyle inkübe edin.
      NOT: Bu bir _CO2 inkübatörde inkübe edilmesi değildir.
   6. SA β-gal ile boyama çözeltisi aspire ve aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri.
   7. Karşı boyama Eosin solüsyonu eklenir. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. Aşama 4.1.3 de tarif edildiği gibi, iki kez PBS ile yıkayın hücreleri.
   8. sonraki analiz için bağlı bir dijital kamerayı kullanarak ışık mikroskobu ile yakalama görüntüleri kullanarak 100X büyütmede görüntü hücreleri.
      NOT: hücrelerin toplam sayısı kör bir şekilde sayılabilir ve SA β-gal pozitif mavi hücrelerin yüzdesi hesaplanabilir.
2. Hücre Döngüsü Analizi (Şekil 3B)
   1. bir yoğunlukta tohum HDF'lerHDF ortamında 6 cm hücre kültür kaplarına oyuk başına 8 x 10 ⁴ hücre. 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 _CO2.
   2. bir gecede inkübasyonu takiben, ıskarta HDF orta yarısı ve Mesc-CM ve kontrol ortamı ekleyin. 37 ° C'de 24 saat% 5 _CO2 inkübe edin.
   3. 300 x g, 5 dakika için tarif 3.1 adım ve santrifüj gibi, hücreler tripsinize. Gibi soğuk PBS çözeltisi ile yıkanır hücreler 2500 x g'de 3 dakika boyunca iki kez ve santrifüj (PBS, 0.5 mM _CaCl2 ve% 2 FBS, 1.5 mi tüp başına 1 mi) ile. gibi soğuk PBS çözeltisi 100 ul süspanse edin.
   4. vorteks ederken soğuk etanol 200 ul bırakarak hücreleri sabitleyin. en az 1 saat boyunca 4 ° C'de depolayın.
   5. Aşama 4.2.3 de tarif edildiği gibi, iki kez soğuk PBS çözeltisi ile hücreleri yıkayın.
   6. 50 ug / ml RNase içeren sodyum sitrat tamponunda 250 ul (1.12%, pH 8.5) 'de tekrar süspansiyon hücreleri. 37 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
   7. sodyum sitrat 250 ul ekleyinTampon 50 ug / ml propidyum iyodür içeren. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
   8. ²⁰ akış sitometrisi kullanılarak her numune 10.000 hücre ölçün.
3. QRT-PCR (Şekil 3C)
   1. adımlar 4.1.1 ve 4.1.2 de açıklandığı gibi tohum HDF'ler ve Mesc-CM ekleyin.
   2. üreticinin protokolüne uygun olarak bir RNA özütleme kiti kullanılarak HDF'ler toplam RNA izole edin. Bir spektrofotometre ²¹ kullanılarak çıkarılan toplam RNA sayısal olarak.
   3. Üreticinin protokolüne ²⁰ göre oligo (dT) primerleri ve M-MLV ters transkriptaz ihtiva eden reaksiyon karışımı, 20 ul toplam RNA'nın 1 ug ekleyerek cDNA sentez.
   4. Yeşil PCR ana karışımı ve özel gen primerler (Ek Tablo 1) kullanarak, gerçek zamanlı PCR makinesi ile cDNA amplifikasyon ölçün. GAPDH ifade ile veri normalleştirmek. Aşağıdaki PCR protokolü kullanın: İlk de95 ° C'de 10 dakika boyunca doğma; 95 ° C'de 15 saniye boyunca 45 devir, 55 ° C'de 20 saniye ve 72 ° C'de 35 saniye; ve 95 ° C, 60 ° C de 1 dakika, 95 ° C'de 30 saniye ve 60 ° C'de ¹⁵ C'de 5 saniye, 15 saniye için erime eğrisi aşaması.

Başlangıçta, mESCs FBS ve diğer ek (Şekil 1 A ve 2A) ile Mesc ortam içinde bir MEF besleyici tutulur. CM besleyici tabaka FBS ya da diğer ek (Şekil 1B ve 2B) olmadan düşük serum ortamında mESCs toplanmıştır. Bu kültür durum bize besleyici, FBS veya diğer takviyeleri faktörler tarafından potansiyel kirlenme olmadan klimalı ortam Mesc-özgü toplamak için izin verir. Kontrol ortamı mESCs olmadan aynı kültür koşullarında toplandı.

i) normalden Mesc kültür koşulları (Şekil 2A), ve ii) serum- ve besleyici içermeyen kültür koşulları (Şekil 2B): mESCs iki farklı kültür ortamı arasındaki morfolojileri gösterir. Mesc kolonileri bir MEF katmanda büyüdü ve normal Mesc kültür c oval ve parlak bir görünüm göstermiştirşartlarından (Şekil 2A). Aksine, serum- ve besleyici içermeyen kültür koşullarında mESCs düzleştirilmiş ve düzensiz bir yapıya (Şekil 2B) göstermektedir.

Mesc-CM fonksiyonel karakterizasyon SA β-gal tahlilinde (Şekil 3A), hücre döngüsü analizi (Şekil 3B) ve qPCR (Şekil 3C) ve yaşlanmayla bağlantılı yöntemler ile elde edilmiştir. Mesc-CM ile yaşlanmış HDF'ler tedavisi hücre yaşlanması (Şekil 3A) bir göstergesi olan pozitif SA β-Gal-pozitif hücrelerin sayısını, azalmıştır. Hücre devri analizi, G ₀ / _G1 fazında (Şekil 3B) hücrelerin sayısı azaltılmış ise Mesc-CM tedavisi büyük ölçüde, S hücrelerinin sayısı arttı _ve G2 / M fazında ortaya koymuştur. Buna ek olarak, Mesc-CM tedavisi N (yaşlanmayla ilişkili gen ekspresyon düzeyleri azalmıştırAmely, p53, p21 ve p16) ve yaşlanmayla ilişkili salgılama fenotipi (SASP) ekspresyon seviyeleri (IL-6).

Şekil 1: Hazırlık ve Mesc-CM optimizasyonu. serumsuz ve besleyici-CM hazırlanması ve optimizasyonu için deneysel strateji. (A) Normal Mesc kültür durumu ve (B) serum- ve besleyici içermeyen Mesc-CM kültür koşulu. C: FBS ve MEF olmadan kontrol ortamı; CM: FBS ve MEF olmadan klimalı ortam. Bae ve ark izni ile değiştirilmiş. ^15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: Aydınlık alan immESCs yaşları. (A) Normal şartlarda (B) serum- ve besleyici içermeyen koşullar altında mESCs. Sarı oklar, normal Mesc kültür koşullarında besleyici hücre (MEF'ler) işaret etmektedir. Ölçek çubukları 100 mikron =. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: Mesc-CM yaşlanma karşıtı etki karakterizasyonu. (A), SA β-gal etkinliğini boyanması ve SA β-gal pozitif hücrelerin yüzdesi. Flow sitometri (B) Hücre döngüsü analizi. (C) QRT-PCR ile yaşlanmayla ilişkili gen ekspresyon seviyeleri (p53, p21 ve p16) ve yaşlanmayla ilişkili salgılama fenotipi (SASP) ifade seviyeleri (IL-6) ekspresyonu seviyeleri. Değerler ortalama ± SD vardır. Şekil, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark-tek-yönlü ANOVA ve Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tespit edilmiştir. * P <0.05, ** p <0.01. Y = olmayan yaşlanmış hücreler; S: yaşlanmış hücreleri; C: FBS ve MEF olmadan kontrol ortamı; CM: FBS ve MEF olmadan klimalı ortam. Ölçek çubukları 10 mikron =. Bae ve ark izni ile değiştirilmiş. ^15. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

serum- ve besleyici içermeyen Mesc-CM başarıyla toplanması için aşağıdaki öneriler dikkate alınmalıdır. En önemli faktör Mesc-CM toplanması için erken geçiş mESCs kullanıyor. Daha önce, bu erken geçiş Mesc-CM geç geçişli mESCs göre daha iyi bir anti-yaşlanma etkileri olduğu gösterilmiştir. MESCs geçiş sayısı gelişim potansiyeli ¹⁶ ve pluripotensini ¹⁷ etkilediği bildirilmiştir.

Ek araştırmalar, anti-yaşlılık etkilere neden Mesc secretome, belirli faktörleri incelemek için gerekli olsa da, şu anda Mesc-CM hücresel seviyede yaşlanmayı azaltmak için yeterli olduğu sonucuna varabiliriz.

Genç hücrelere geri yaşlanan hücreleri geri Mesc özgü salgı faktörlerin belirlenmesi, gelecekteki çalışmalar için önemli olacaktır. Yüksek kaliteli bu tür antikor dizisi ¹⁵ bir şekilde salgı moleküller, analizler için,D secretome analiz ortamı toplama işlemi sırasında yıkama aşaması (aşama 3) önemlidir. Yıkama aşaması düzgün yürütülen değilse, salgı moleküller serumu (FBS) bileşenleri ^18,19 ile kirlenmiş olacaktır.

serum- ve besleyici-inkübasyon süresi (24 saat), serum altında açlık hücre autolysis veya apoptoz olasılığını arttırabilir (24 saat boyunca) uzun kuluçka süresi olarak, orta toplama işlemi (aşama 3) çok önemlidir - ve tüketilmiş koşulları ^18,19 feeder-. Besleyici moleküllerinin ²² çok sayıda salgılar normal ESC kültürü durumu, farklılaşmamış hücrelerin uzun süreli kültür için bir besleyici tabaka gerektirir. jelatin kaplı plaka besleyici hücrelerinden bulaşma olasılığını önler.

serum- ve besleyici içermeyen kültür koşulları hasat Mesc-CM, yaşlanmış HDF'ler bir anti-yaşlılık yeteneğine sahiptir. mESC- anti-yaşlılık etkileriCM gibi SA β-gal aktivitesi olarak yaşlanmayla ilişkili birden okumalara tarafından ortaya konulmuştur; gelişmiş bir çoğalma potansiyeli (hücre döngüsü analizi); ve p53, p21, p16, ve IL-6 gen ekspresyon düzeyleri (- 3C Şekil 3A) azalttı.

İnsan birincil hücreler Mesc-CM ile tedavi edildiğinde, xeno-kirlenme klinik uygulama için kritik bir sorun olurdu. Bu nedenle, insan EKH veya iPSCs gelen salgı faktörlerin bir soruşturma insanın kökeni türetilen CM klinik uygulaması için önemli bir gelecek çalışma olacaktır. Bir kök hücre ve bir anti-yaşlılık çalışmaya dayalı bir hücre içermeyen yaklaşımın yakınsama tedavi yaklaşımlarına gelişmeler içine daha fazla anlayış ile sonuçlanan, yaşlanmayla ilişkili hastalıkların mevcut anlayışı genişletmek için bekleniyor.

The authors have nothing to disclose.

Bu araştırma Temel Bilimler Araştırma Programı (2013R1A1A2060930) ve Tıbbi Araştırma Merkezi Programı (2015R1A5A2009124) Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (UÇK), Bilim, BİT Bakanlığı tarafından finanse edilen ve Gelecek Planlama tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma aynı zamanda Hastanesi Çocuk Hastalıkları (HK Sung) bir Başlangıç ​​İşletim Grant tarafından desteklenmektedir. Biz G4 Mesc hattını sağlamak için bu el yazması ve Dr. Andras Nagy düzenleme onların mükemmel yardım için Laura Barwell ve Sarah JS Kim teşekkür etmek istiyorum.