אוסף של Serum- ומזין ללא עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell לגישה Cell-חינם

פרוטוקול זה מספק שיטה לאיסוף תאי גזע עוברי בעכבר (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) נגזר סרום (נסיוב שור עוברי, FBS) - ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) תנאים -חינם עבור תא גישת -חינם. זה עשוי להיות רלוונטי לטיפול הזדקנות ומחלות הקשורות להזדקנות.

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

מטרת פרוטוקול זה היא לאסוף עכבר בתאי גזע עובריים (המסקלין) בינוני -conditioned (המסקלין-CM) מן התנאים תרבות serum- ומזין ללא ולאפיין תפקודים ביולוגיים שלה.

באופן כללי, תאי גזע עובריים (ESCs) יש פוטנציאל גדול עבור רפואה רגנרטיבית וטיפול התא עקב מגוונת" ויכולתן עבור התחדשות עצמית ^1-3. עם זאת, ההשתלה הישירה של תאי גזע יש מספר מגבלות, כגון דחייה חיסונית גידול היווצרות ^4,5. לכן, גישת תא ללא עשויה לספק אסטרטגיה טיפולית חלופית עבור רפואת רגנרטיבית והתערבויות הזדקנות ^6,7.

ההזדקנות נתפסת עמיתו הסלולר הזדקנות רקמות ואיברים, המאופיינת במצב מתמיד של מעצר צמיחה, פיזיולוגית תא שהשתנתה ולאחר התנהגויות. הזדקנות היא גרם הסיכון העיקרי למחלות נפוצות כולל הסרטן, מחלות לב וכלי דם, type 2 סוכרת, ניוון מוחיים ^8. אחד המאפיינים הברורים של הזדקנות היא ירידת פוטנציאל ההתחדשות של רקמות, אשר נגרם על ידי הזדקנות תאי גזע ותשישות ^9. מחקרים רבים הראו משמעותי מולקולות תרופתיות, כגון rapamycin ^9, רזברטרול ^10, ומטפורמין ^11, וגורמים מערכתיים שמקורן בדם, כלומר GDF11 ^12, שיש להם את היכולת לעכב הזדקנות בעקביות להאריך את תוחלת חיים.

במחקר הנוכחי, המסקלין-CM נקצר ללא בסרום (בסרום שור עוברי, FBS) ומזין (פיברובלסטים עובריים בעכבר, MEFs) שכבות כדי לשלול את הזיהום של גורמים בסרום וגורם הפרשה מן MEFs. תנאים אלה אפשרו CM serum- והמזין ללא ושכתוצאה מכך אפשר זיהוי המדויק של גורמי פרשת המסקלין ספציפיים.

פרוטוקול מוצע זה יעיל ביותר, יחסית חסכוני, וקללהפעיל. טכניקה זו מספקת תובנה על האפיון של גורמים מסיסים הנגזרות המסקלין שיכול לתווך אפקט אנטי-הזדקנות, אשר עשוי לשמש לפיתוח גישה טיפולית בטוחה יתרון פוטנציאלי ללא תא כלפי התערבויות למחל הזדקנות קשורה ומבריא אחר טיפולים.

הערה: סכמטי של serum- ופרוטוקול אוסף מזין ללא CM מוצג באיור 1.

1. חומרים (הכנת MEFs, בינוני, צלחות, ופתרונות)

1. הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את MEFs. מוסף בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS (איכות ESC), 50 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -50 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
2. לבודד MEFs מעובר בעקבות פרוטוקול שגרתי הוקם ¹³ ולתחזק אותם במדיום MEF.
3. הכן 500 מ"ל של מדיום לתרבת את mESCs. DMEM הוא השלים עם FBS 15% ו -2 מ"מ L- גלוטמין, 100 מיקרומטר חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA), 100 מיקרומטר β-mercaptoethanol, 100 יחידות / גורם מעכבות לוקמיה מ"ל (LIF), 50 יחידות / פניצילין מ"ל, ו -50 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.
4. הכן את צלחות gelatinized (5 צלחות gelatinized / 1 צלחת המסקלין) על ידי ציפוי צלחות תרבית תאים 10 ס"מ עם 5 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1%. דגירה של 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
5. כן 500 מיליליטר של מופחתת סרום בינוני עבור מצב סרום ללא mESCs. תוספת מופחתת סרום מדיה עם 1.2 גרם של סודיום ביקרבונט (pH 7.0). סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון.
6. הכן את β-galactosidase הקשורים-הזדקנות (SA β-gal) פתרון מכתים עבור זיהוי של תאים מזדקנים: 1 מ"ג / מ"ל ​​X-gal (מומס dimethylformamide, DMF), 40 מ"מ חומצת לימון / חיץ פוספט נתרן (pH 6.0) , 5 ferricyanide אשלגן מ"מ, 5 פרוציאני אשלגן מ"מ, 150 מ"מ NaCl, ו -2 מ"מ MgCl ₂ ^14.
   זהירות: (המסוכן) DMF הוא פתרון רעיל מאכל. ללבוש ביגוד מגן אישי (למשל, כפפות ניטריל או לטקס, חלוק מעבדה, ומשקפי) בעת טיפול פתרון. השתמש במנדף.
7. הכן 500 מ"ל של מדיום כדי fibroblasts עורי האנושי תרבות (HDFs, NHDF-אד-דר-פיברובלסטים). מוסף DMEM עם 10 FBS% ו -100 יחידות / פניצילין מ"ל ו 100 מ"ג / מ"ל ​​סטרפטומיצין.

הערה: ביצוע כל הצעדים במנדף בטיחות ביולוגית תרבית תאים.

1. פנקו את MEFs עם 20 מ"ל של מדיום MEF המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של mitomycin C בצלחת תרבית תאים 15 ס"מ. דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. לשאוב את המדיום MEFs. שוטפים את התאים עם שלוש פעמים PBS. הוסף 3 מ"ל של טריפסין EDTA (TE, 1x) דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר 3 דקות, לנטרל את TE עם 6 מ"ל של מדיום צנטריפוגות MEF 3 דקות ב 300 x ז.
3. Resuspend ב 5 מ"ל של מדיום MEF. לקבוע את מספר הסלולרי ההשעיה התא וכתוצאה מכך באמצעות מכתים trypan כחול ו hemocytometer. פלייט MEFs מומת (מזין) בצפיפות של 2 x 10 ⁶ תאים לכל צלחת תרבית תאים של 10 ס"מ במדיום MEF. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
4. החלף את המדיום MEF עם המדיום המסקלין 24 שעות לאחר ציפוי מזין (עלהיום למחרת).
5. פלייט mESCs (בתאי גזע עובריים היברידית F1 G4) בצפיפות של 2 x 10 ⁶ תאים על מזין עם המדיום המסקלין. דגירה של 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   הערה: אפקט אנטי אייג'ינג של המסקלין-CM הוא חזק סביר כאשר mESCs מספר מעבר נמוך משמשים ^15-17. רכשנו קו G4 המסקלין מד"ר אנדרש Nagy ב לוננפלד-טננבאום מכון המחקר, בי"ח הר סיני, 25 אורד רחוב, טורונטו, ON, M5T 3H7, קנדה.
6. שמור את התאים בצפיפות ומעבר יחסית גבוהים בכל מדינת 70-80% משנה ומחוברת. חלף בינוני עם בינוני המסקלין טרי מדי יום.

אוסף 3. Serum- ומזין ללא בינוני אלף (איור 1B ו -2)

הערה: ביצוע כל הצעדים במנדף בטיחות ביולוגית תרבית תאים.

1. יש לשטוף את צלחת המסקלין עם 5 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של TE (2.5x) דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. לאחר 3 דקות, לנטרל את TE עם 2 מ"ל של המסקלין mediuמ 'ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
2. Resuspend ב 5 מ"ל של המסקלין בינוניים צלחת 1 מ"ל לתוך כל מנה תרבות ג'לטין מצופה (5 צלחות gelatinized / 1 צלחת המסקלין) במדיום המסקלין. תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד 80-85% confluency הוא הגיע.
3. לשטוף mESCs עם PBS מספיק כדי לכסות את התאים (8 מ"ל לכל צלחת 10 ס"מ) למשך 10 דקות לכל לשטוף, עבור סכום כולל של שלושה שוטף. מדגירים סרום בינוני מופחת עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   הערה: שלב הכביסה חשוב על מנת למנוע זיהום FBS. חשוב לבצע את זמן הדגירה ^18,19.
4. אסוף המסקלין-CM לתוך צינור צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל במשך 20 דקות ב 2500 x ז. לאסוף את הפתרון supernatant (CM) לאחר צנטריפוגה. סינון דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בקבוק עליון.

4. השפעות של עכבר גזע עובריים בינוני מותנה-Cell (המסקלין-CM)

הערה: האפקטים של המסקלין-CM אומתו על ידי מספר שיטות, כגוןassay β-gal SA, ניתוח מחזור התא, qRT-PCR.

1. Β-gal SA Assay (איור 3 א)
   1. HDFs זרע בצפיפות של 2 x 10 ⁴ תאים לכל היטב צלחות 6-היטב במדיום HDF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
   2. בעקבות דגירת לילה, חצי שנזרק של מדיום HDF ולהוסיף המסקלין-CM ובינוני שליטה. דגירה של 72 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2. בינוני בקרה נגזר סרום ללא בינוני (Reduced מדיה סרום) בצלחת מצופה ג'לטין בהעדר mESCs.
   3. שוטפים את התאים עם PBS מספיק כדי לכסות את התאים (2 מ"ל לכל צלחת 6-היטב) למשך 30 שניות לכל לשטוף, עבור סכום כולל של שני שוטף. להוסיף 3.7% paraformaldehyde (PFA) עבור קיבעון. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      זהירות: (המסוכן) Paraformaldehyde הוא פתרון רעיל מאכל. ללבוש ביגוד מגן אישי (למשל, כפפות ניטריל או לטקס, חלוק מעבדה, ומשקפי) בעת טיפול הפתרון.השתמש במנדף.
   4. לשאוב את פתרון הקיבעון. לשטוף את התאים הקבועים עם PBS פעמים, כמתואר בשלב 4.1.3.
   5. מוסיפים את פתרון מכתים SA β-gal (1-2 מ"ל לכל היטב צלחת 6-היטב). דגירה של 17.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: זה לא כדי להיות מודגרות ב CO ₂ באינקובטור.
   6. לשאוב את הפתרון מכתים SA β-gal לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, כמתואר בשלב 4.1.3.
   7. מוסיפים את פתרון Eosin למדיניות נגד מכתים. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים את התאים עם PBS פעמיים, כמתואר בשלב 4.1.3.
   8. תאי תמונה בהגדלת 100X באמצעות תמונות מיקרוסקופ לכידת אור באמצעות מצלמה דיגיטלית מחוברת לניתוח שלאחר מכן.
      הערה: המספר הכולל של תאים ניתן לספור באופן עיוור באחוז התאים הכחולים חיוביים β-gal SA ניתן לחשב.
2. Cell Cycle Analysis (איור 3 ב)
   1. HDFs זרע בצפיפות של8 x 10 ⁴ תאים לכל טוב בצלחת תרבית תאים 6 ס"מ במדיום HDF. דגירה לילה בשעה 37 ° C ו 5% CO _2.
   2. בעקבות דגירת לילה, חצי שנזרק של מדיום HDF ולהוסיף המסקלין-CM ובינוני שליטה. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   3. Trypsinize את התאים, כמו צעד מתואר 3.1, ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. שוטפים את התאים עם פתרון PBS קר (PBS עם 0.5 מ"מ CaCl ₂ ו -2% FBS, 1 מ"ל לכל צינור 1.5 מ"ל) פעמיים ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב g x 2,500. Resuspend ב 100 μl של פתרון PBS קר.
   4. תקן את התאים על ידי הטלת 200 μl של אתנול קר תוך vortexing. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 1 שעה.
   5. שוטפים את התאים עם פתרון PBS קר פעמיים, כמתואר בשלב 4.2.3.
   6. Resuspend התאים 250 μl של חיץ נתרן ציטרט (1.12%, pH 8.5) המכיל RNase 50 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   7. הוסף 250 μl של נתרן ציטרטמאגר המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​propidium יודיד. דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   8. מדוד את 10,000 תאי מדגם זה באמצעות זרימת cytometry ^20.
3. qRT-PCR (איור 3 ג)
   1. HDFs זרע ולהוסיף המסקלין-CM, כמתואר בשלבים 4.1.1 ו 4.1.2.
   2. לבודד RNA סך מן HDFs באמצעות ערכת חילוץ RNA על פי הפרוטוקול של היצרן. לכמת את סך RNA חילוץ באמצעות ספקטרופוטומטר ^21.
   3. לסנתז cDNA על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של רנ"א הכל על 20 μl של תערובת התגובה המכיל אוליגו (DT) פריימרים ו transcriptase M-MLV הפוכה, על פי פרוטוקול של היצרן ^20.
   4. מדוד את הגברה של cDNA עם מכונת PCR בזמן אמת, באמצעות שילוב הורים גרין PCR ו פריימרים גן ספציפי (טבלה 1 מוסף). לנרמל את הנתונים עם ביטוי GAPDH. השתמש בפרוטוקול PCR הבא: דה הראשוניתnaturation במשך 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס; 45 מחזורים במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 20 שניות על 55 מעלות צלזיוס ו -35 שניות על 72 מעלות צלזיוס; והשלב העקום ההתכה במשך 15 שניות על 95 מעלות צלזיוס, 1 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, 30 שניות על 95 מעלות צלזיוס, ו -5 שניות על 60 מעלות צלזיוס ^15.

במקור, mESCs נשמרות על מזין MEF במדיום המסקלין עם FBS ותוספי מזון אחרים (איורים 1 א ו 2 א). CM נאסף mESCs ב מופחתת מדיה סרום ללא שכבת מזין, FBS, או תוספי מזון אחרים (1B דמויות 2B). מצב התרבות זה מאפשר לנו לאסוף המסקלין ספציפי מותנה בינוני ללא אפשרות של זיהום על ידי הגורמים ממזין, FBS, או תוספי מזון אחרים. המדיום המלא נאסף באותם תנאי התרבות, בלי mESCs.

mESCs להראות מורפולוגיות שונות בין התקשורת והתרבות שני: i) תנאי תרבות נורמלים המסקלין (איור 2 א) ו- II) serum- ותנאי תרבות ללא מזין (איור 2 ב). מושבות המסקלין גדלו על שכבת MEF והפגינו מראה סגלגל ומבריק תחת ג תרבות המסקלין הנורמליonditions (איור 2 א). יהפוך הוא, את mESCs ב serum- ותנאי תרבות ללא מזין הראה מורפולוגיה שטוחה לא סדירה (איור 2 ב).

האפיון הפונקציונלי של המסקלין-CM הושג בשיטות הקשורים להזדקנות, כגון assay SA β-gal (איור 3 א), ניתוח מחזור התא (איור 3 ב), ו qPCR (איור 3 ג). טיפול HDFs מזדקן עם המסקלין-CM ירד מספר התאים החיוביים SA β-gal-חיוביים, שהוא אינדיקטור של הזדקנות התאית (איור 3 א). ניתוח מחזור התא, הראה כי טיפול המסקלין-CM עלה באופן משמעותי את מספר התאים ה- S שלב G ₂ / M, ואילו הקטין את מספר התאים בשלב G ₀ / G ₁ (איור 3). בנוסף, טיפול המסקלין-CM ירד רמות ביטוי גנים הקשורים-הזדקנות (namely, p53, p21, ו p16) ואת הפנוטיפ הפרשה קשורה-הזדקנות (רמות הביטוי SASP) (IL-6).

איור 1: הכנה ואופטימיזציה של המסקלין-CM. אסטרטגיה ניסויית לעריכה אופטימיזציה של CM סרום ללא ומזין חינם. (א) מצב התרבות רגילה המסקלין ו- (ב) serum- ומצבו תרבות המסקלין-CM מזין חינם. C: לשלוט בינוני ללא FBS ו MEF; CM: בינוני מותנה בלי FBS ו MEF. השתנה באישור ואח באי. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: im שדה המוארגילי mESCs. mESCs תחת (א) תנאים נורמליים ו (ב) serum- ותנאים ללא מזין. חצים צהובים עולים תא מזין (MEFs) בתנאי תרבות נורמלים המסקלין. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: אפיון של אפקט אנטי אייג'ינג של המסקלין-CM. (א) SA β-gal מכתים פעילות ואחוז SA β-gal חיובי תאים. (ב) ניתוח מחזור התא על ידי cytometry הזרימה. (ג) רמות הביטוי של רמות ביטוי גנים הקשורים להזדקנות (p53, p21, ו p16) לבין פנוטיפ הפרשה הקשורים להזדקנות רמות הביטוי (SASP) (IL-6) על ידי qRT-PCR. ערכים הם ממוצע ± סטיית תקן. דמויות המייצגות שלושה ניסויים בלתי תלויים. הבדלים סטטיסטיים-משמעותיים בין הקבוצות זוהו על ידי ANOVA חד כיווני ולבדוק פוסט הוק של Tukey. * P <0.05, ** p <0.01. Y = שאינם מזדקנים תאים; S: שתאים מזדקנים; C: לשלוט בינוני ללא FBS ו MEF; CM: בינוני מותנה בלי FBS ו MEF. ברי סולם = 10 מיקרומטר. השתנה באישור ואח באי. ^15. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עבור האוסף המוצלח של serum- ומזין ללא המסקלין-CM, את ההצעות הבאות צריכות להילקח בחשבון. הגורם הקריטי ביותר הוא באמצעות mESCs הפרקים המוקדמים לאיסוף המסקלין-CM. בעבר, הוכח כי מוקדם מעבר המסקלין-CM יש השפעות אנטי אייג'ינג טוב יותר לעומת mESCs מעבר מאוחר. מספר חלוף mESCs דווח להשפיע הפוטנציאל ההתפתחותי ¹⁶ ו pluripotency ^17.

בעוד מחקר נוסף נדרש כדי לנתח את הגורמים הספציפיים של secretome המסקלין, אשר גורם לתופעות אנטי-הזדקנות, אנו יכולים להסיק כי כרגע המסקלין-CM מספיקה כדי להקטין הזדקנות ברמה התאית.

זיהוי גורמי הפרשה ספציפי המסקלין כי לחזור שתאים מזדקנים חזרה לתאים צעירים יהיה קריטי למחקרים עתידיים. עבור באיכות גבוהה מנתח על מולקולות הפרשה, כגון מערך נוגדן ^.15ניתוח ד secretome, על שלב הכביסה בתהליך האיסוף הבינוני (שלב 3) הוא קריטי. אם שלב הכביסה אינו נעשה כראוי, מולקולות ההפרשה תהיינה מזוהמות בסרום (FBS) רכיבים ^18,19.

זמן הדגירה serum- ומזין חינם (24 ​​שעות) חשוב מאוד בתהליך איסוף בינוני (שלב 3), כמו זמן הדגירה ארוכה יותר (מעל 24 שעות) עלול להגביר את האפשרות של התא autolysis או אפופטוזיס מרעב תחת בסרום - ו feeder- תנאי מדולדל ^18,19. תנאי התרבות הנורמלי ESC דורש שכבת מזין עבור culturing לטווח הארוך של תאים שלא עברו התמיינות, כמו המזין מפריש מספר רב של מולקולות ^22. צלחת ג'לטין מצופה מונע אפשרות של זיהום מתאי מזין.

המסקלין-CM, שנקטף מן תנאי תרבות serum- ומזין ללא, יש יכולת אנטי-הזדקנות ב HDFs מזדקן. אנטי-הזדקנות השפעות mESC-CM הודגם על ידי readouts המרובה הקשורים להזדקנות, כגון פעילות-gal β SA; פוטנציאל שגשוג משופר (ניתוח מחזור תא); והקטינו p53, p21, p16, ורמות ביטוי גנים IL-6 (איור 3 א - 3C).

כאשר תאים ראשוניים אדם מטופלים עם המסקלין-CM, קסנו-זיהום יהיה נושא קריטי עבור יישומים קליניים. לכן, חקירה של גורמי הפרשה מן ESCs או iPSCs אדם תהיה מחקר עתידי חשוב עבור היישום הקליני של CM נגזר מקורות אנושיים. ההתכנסות של גישת תא ללא מבוססת על תאי גזע מחקר אנטי-הזדקנות צפויה להרחיב את ההבנה הנוכחית של מחלות הקשורות להזדקנות, וכתוצאה מכך להבין טוב יותר את השיפורים על גישות טיפוליות.

The authors have nothing to disclose.

מחקר זה מומן על ידי תכנית המחקר במדעי יסוד (2013R1A1A2060930) ותכנית המרכז למחקר הרפואית (2015R1A5A2009124) באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), הממומן על ידי משרד המדע, ICT, ותכנון לעתיד. מחקר זה נתמך גם על ידי חברת סטארט-אפ הפעלה מענק מטעם בית החולים לילדים (HK סונג). ברצוננו להודות לורה Barwell ושרה JS קים לעזרה שלהם מעולה בעריכת כתב היד הזה וד"ר אנדרס Nagy למתן הקו G4 המסקלין.