Insanlaşmış Fare Modelinde HIV enfeksiyonuna karşı kök hücre Tabanlı Engineered Bağışıklık

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

HIV'e karşı kök hücreye dayalı gen terapisi hızlı gelişimi ile, genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin hematopoietik farklılaşmasını ve bağışıklık fonksiyonu incelemek için bir hayvan modeli için gereksinimi basarak vardır. İnsanlaştırılmış kemik iliği / Karaciğer / Timus (BLT) fare modeli T hücreleri, B hücreleri, NK hücreleri ve monositler dahil çevrede, bir insan bağışıklık sistemi tam sulandırma sağlar. insan timus implant, aynı zamanda, otolog timik dokuda T hücrelerinin timus seçimine izin verir. HIV enfeksiyonu çalışma ek olarak, model, hematopoietik kök hücreler (HSC), elde edilen hücrelerin farklılaşması, geliştirme ve özelliğe araştırmak için güçlü bir araç konumundadır. Kalıt HSCler ile -Bone iliği / Karaciğer / Timus (NTG-BLT) fareler ile Burada kombine bağışıklık eksikliği olan (SCID) -Ortak gama zinciri nakavt ^{- (- /} C _γ) -severe insanlaştırılmış obez olmayan diyabetik (NOD) yapımına özetlemektedir CD4 kimerik antijen reseptörü ile (CD4CAR)lentivirüs vektör. Bu CD4CAR HSC başarıyla birden fazla soy dönüştürmek ve anti-HIV etkinliğe sahip olduğunu göstermektedir. Çalışmanın amacı, HIV'e karşı tasarlanmış bağışıklık için bir in vivo modeli olarak NTG-blt fare modelinde kullanımını göstermektir. Bu lentivirüs ve insan dokusu kullanıldığı için, deneyler ve ameliyatlar özel önlemler (BSL2 +) tesisi ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL2) bir Sınıf II biyogüvenlik kabini yapılmalıdır, dikkati çekiyor.

Kombine antiretroviral tedavinin başarısına rağmen, HIV enfeksiyonu hala hayat boyu bir hastalıktır. HIV'e karşı hücresel immün yanıt HIV çoğalmasını kontrol etmede oldukça önemli bir rol oynamaktadır. Kök hücre manipülasyonu son gelişmeler HIV tedavisi ^1-3 yaklaşımlar gen tedavisinin hızlı gelişimi için izin vermektedir. Bunun bir sonucu olarak, HIV'e karşı hücre bazlı terapilerin etkinliğinin in vivo çalışmada sağlayan bir uygun hayvan modeli olması önemlidir.

hayvan modellerinde HIV ile çalışan virüs sadece insan hücreleri enfekte olduğu gerçeği ile karmaşık. Bu sınırlama aşmak için, bilim adamları Rhesus makak ^4,5 yılında Simian İmmün Yetmezlik Virüsü (SIV) gibi hastalık modelleri kullanarak başvurdular. Ne yazık ki, türler arasında doğal farklılıklar ve SIV ve HIV arasındaki farklılıklar, bu modelde temel sınırlamalar vardır. Buna ek olarak, sadece son derece uzmanlaşmış tesisleri c vardırinsan olmayan primatlar ve her makak ile çalışmalarını destekleme apable büyük bir yatırım gerektirir. Böylece, HIV enfeksiyonu / patogenezi duyarlı insan bağışıklık sistemini kullanır ve daha az mali yasaklayıcı bir model için acil bir ihtiyaç vardır.

(Ya da NTG) Kan / Karaciğer / Thymus (BLT) insanlaştırılmış fare modeli giderek olduğu kanıtlanmıştır önemli bir araç obez olmayan diyabetik (NOD) kombine immün yetmezliği olan (SCID) -ortak gama zinciri nakavt ^{- (- /} c _γ) -severe HIV enfeksiyonunu incelemek için. Hematopoetik kök hücreleri (HKH'lerin) ve fetal timus implante ederek, fareler geliştirmek ve insan bağışıklık sistemini ^1-3 recapitulate edebiliyoruz. kök hücre bazlı gen terapisinin bir tipi, antijene özel T hücreleri ayırt etmek Hematopoietik kök hücreler (HSC), yeniden programlayarak HIV hedef periferik T hücrelerinin yönlendirme 'içerir. Daha önce göstermiştir ki, bir molekül klonlanmış bir anti-HIV spesifik T hücresi yeniden mühendislik HSCSL9 epitopa (amino asit 77-85; SLYNTVATL) karşı reseptör (TCR), HIV-1 Gag hümanize NTG-blt fare modelinde ⁶ HIV kopyalanmasını bastırdığı Olgun T hücreleri oluşturan kök hücre yeniden yönlendirebilir. molekül klonlanmış TCR kullanılarak ikaz bu tedavinin uygulanmasını sınırlar, belirli bir insan lökosit antijeni (HLA) alt tipi ile sınırlı olmasıdır. Kimerik antijen reseptörleri (CAR), diğer taraftan, evrensel olarak tüm HLA alt tiplerinin uygulanabilir. İlk çalışmalar CD3 alan sinyal hücre içi ζ birleştirilmiş insan CD4, hücre dışı ve transmembran ile inşa bir araba kullanılarak yapıldı (CD4ζCAR olarak da adlandırılır). CD4ζCAR HIV zarf tanır ve bir T hücresi reseptörü tarafından aracılık edilen ⁷ edilene benzer bir sitotoksik T hücre yanıtını tetikleyen CD8 T hücreleri üzerinde ifade edilmiştir. Biz son zamanlarda insan HKH'lerin sonra birden hematopoetik li içine ayırt edebilirsiniz CD4ζCAR ile modifiye edilebilir olduğunu göstermiştirinsanlaştırılmış fare modelinde ⁸ HIV replikasyonunu bastırma yeteneğine sahip fonksiyonel T hücreleri de dahil olmak üzere neages. Kanser ⁹ kimerik antijen reseptör terapileri hızlı ilerlemesi ve güçlü geniş nötralize antikorları tek zincirli antikor SYR'lerinden inşaatına izin HIV'e karşı ^10-12 sürekli karakterizasyonu ile, algılanabilir CD4ζCAR yanı sıra pek çok yeni aday yapıları olduğunu oluşturulan ve HIV hastalıklar ve diğer hastalıkların kök hücre bazlı gen terapisi için test edilecektir. Buna ek olarak, bu antijene özgü kabinli insanlaştırılmış NTG-blt fare modeli de yakından in vivo olarak insan T hücresi yanıtlarını incelemek için yararlı bir araç sağlayabilir. Önemli olarak, protokol BLT fareler, HSC jelatinimsi protein karışımı fetal karaciğer gövdeleri ¹⁶ yerine kullanılır ^13-15 hümanize yapımı için bir önceki açıklanan yöntemlere farklıdır. Bu protokol açıklar: humani 1) inşaatıCD4ζCAR ile mühendislik zed BLT fareler; ve 2) genetiği değiştirilmiş hücrelerin farklılaşma karakterizasyonu; genetik olarak tadil edilmiş hücrelerin işlevselliği ve 3) karakterizasyonu.

Etik Açıklama: İnsan fetal doku Gelişmiş Biosciences Kaynaklarından veya Novogenix elde edilmiştir ve tanımlayıcı bilgiler ve kullanımı için IRB onayını gerektiren vermedi olmadan elde edilmiştir. Bu yazıda anlatılan hayvan araştırmaları, tüm federal, eyalet uygun ve yerel kurallar University of California, Los Angeles, ve (UCLA) Hayvancılık Araştırma Komitesi (ARC) yazılı onayı altında gerçekleştirildi. Özellikle, bu çalışmalar Uluslararası Bakım ve Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanları Kullanımı ve akreditasyon ve Laboratuar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon (AALAC) Derneği kılavuzlar için Kılavuzu'nda yönergelere sıkı sıkıya bağlı altında gerçekleştirilmiştir UCLA ARC Protokol Numarası 2010-038-02B altında. Tüm ameliyatlar ketamin / xylazine ve izofluran anestezi altında yapılan ve tüm çabaları hayvan ağrı ve rahatsızlığı en aza indirmek için yapılmıştır.

CD4 Kimerik Antijen Reseptör ile tasarlandı Insanlaşmış 1. Farelerin İnşaat

1. Fetal Timüsü İşleme ve Fetal Karaciğer gelen CD34 + HKH'lerin Ayırma
   1. Thymus İşleme
      1. Yavaşça, 15 ml konik bir tüp içinde fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), pH 7.4 içinde timus yıkayın. Tekrarlayın yıkama adımı 3-4 kez.
      2. 7 ml RPMI ortamı +% 10 FBS + Pen / Strep ekleyin. steril bir 100 mm Petri kabı içine her şeyi süzün.
      3. Yaklaşık 1 ila ² mm arasında, küçük parçalar halinde kesmek için timus neşter kullanarak. 96 oyuklu bir plaka üzerinde tek bir oyuk her bir timus parçası yerleştirin. 96-plaka için timus parçaları aktarırken Kullanım künt forseps kavisli.
         1. Doku, kuru engellemek için, bütün gözlere - (200 ul, 100), küçük bir ortam miktarda ekleyin. mikroskop altında gözünüzde canlandırın (Thymi lobları ve hücrelerin çuval gibi görünmelidir).
            NOT: Herhangi bir şekilde şüpheli bakmak herhangi parçaları atın;Orada bağ dokusu genellikle bu implante edilmemelidir.
      4. teyit-timüs parçalarını çıkarın ve bir T25 hücre kültürü balona hepsini koyun. % 10 FBS ile takviye edilmiş 7 ml RPMI ortamı ile karıştırmak için piperasilin / tazobaktam ve amfoterisin B yavaşça kaya şişenin 450 ug / ml ilave edilir. Kültür 37 ° C /% 5 CO ₂ de şişesi gecede.
         NOT: Bu adım dokusunun bakteri bulaşmasını önlemek için gereklidir.
      5. (İsteğe bağlı adım) ileride kullanılmak üzere timus dondurun. 10 dakika süre ile,% 10 dimetil sülfoksit (DMSO),% 90 insan AB serumu içinde parçaları dengelenmesi. -50 ºC 1 ° C / dakika hızında, -150 ºC sonra hızlı soğutma onları dondurun. Çözülme ne zaman hazır, hızla 37 ºC su banyosunda çözülme ve yavaşça DMSO olmadan RPMI tam medya 3x yıkayın.
   2. karaciğer İşleme
      1. Yavaşça 50 ml konik tüp içinde PBS içinde karaciğer yıkayın. Tekrarlayın yıkama adımı 3-4 kez.
      2. 10 ml 50 ml konik tüp (Iscove Modifiye Dulbecco Ortam) IMDM ortam ekleyin. 100 mm steril Petri kabı içine her şeyi süzün.
      3. İki neşter kullanarak ciğer dokusu homojenize edilir. 3 mm ² küçük parçalar halinde karaciğer kesilir. kesip herhangi bir beyaz bağ dokusu atın.
      4. Karaciğer parçaları ve medya almak için bir 16 gauge künt iğne ile donatılmış 10 ml şırınga kullanın. Daha sonra, 50 ml konik tüp aktarın.
      5. Yavaşça medya ve doku süspansiyonu tekrar süspansiyon ve tamamen doku homojenize 5-7 kez daha sınırdışı.
      6. 10 ml IMDM ortam enzim ile takviye hazırlayın: 500 U / mL kolajenaz, 2400 U / ml hyluronidase ve 300 U / ml DNase ve 450 ug / ml piperasilin / tazobaktam ve amfoterisin B daha sonra bir 0.22 mikron filtre aracılığıyla ortamı filtre karaciğer süspansiyon ortam ekleyin.
      7. Karaciğer süspansiyonu içeren 50 ml konik tüp kap ve Parafilm t olarak kendinden sızdırmaz filmle sıkıca kapatıno sızıntıları önlemek. 90 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde tüp rotator döndürün.
      8. taze bir 50 ml tüp içine 100 mikron hücre süzgecinden sindirilmiş hücre süspansiyonu Filtre.
         Not: 50 ml toplam hacmi getirmek için süspansiyona PBS ekleyin. 50 ml tüpler hücre süspansiyonu 25 ml içeren her iki tüp içine bu Böl.
      9. Yavaş yavaş ve hafifçe (örneğin, Ficoll), 10 ml yoğunluk santrifüj ortamı her bir tüp içinde hücrelerin altında yatan. Frensiz 20 dakika boyunca 1.200 xg'de Spin. Not: Bu protokolde belirtilen tüm santrifüj oda sıcaklığında (25 ºC) yapılır.
      10. Dikkatle iki ayrı 50 ml tüpler her tüp ve transfer arabirimi (yani., Ince beyaz tabaka) çıkarın. PBS ile 50 ml'ye arayüzü her borunun hacmi getirin. 10 dakika - 7 300 xg'de Spin. dikkatle Süpernatant aspire.
      11. İki pelet birleştirin. 50 ml PBS,% 2 FBS içeren üç kez yıkayın. 10 m - 7 300 xg'de SpinHer zaman dikkatli süpernatant aspire ederken.
      12. 50 ml RPMI ortamı +% 10 FBS içinde pelletini. hücre sıralama geçmeden önce şu anda hemasitometre kullanarak hücre sayımı.
      13. Hemen CD34 Kit sıralama (örn., CD34 mikro boncuklar), üreticinin protokolüne uygun olarak kullanılarak Sıralama CD34 + hücreleri.
          Not: Alternatif olarak, hücreler bir gece boyunca / 1 milyon RPMI ortamı +% 10 FBS içinde ml kültürlenebilir.
      14. CD34 + ve CD34 fraksiyonu hem kaydedin.
          NOT: Bu aşamada, CD34 + ve CD34 hücreleri Bambanker donma medya veya diğer donma medias kullanılarak dondurulabilir. 4 1 ml dondurma - tüp başına 6 x 10 ^6, CD34 + hücreleri, 1 ml 40 dondurma - tüp başına 60 x 10 ⁶ CD34 hücre.
2. CD34 + hücrelerinin transdüksiyonu
   1. 6 gözlü bir doku kültürü plakasının gerekli iletim kuyu sayısını hesaplayın. 1 de 8 x 10 ⁶ hücre kadar transdüksiyonu için kullanılabilir. İçinHer blt, fare, 0.5 x 10 ⁶ CD34 + CD34-hücreleri ve böbrek kapsülü altından timüs ve 0.5 x 10 ⁶ CD34 + hücreleri ile birlikte implante edilecek venöz içinden enjekte edilecektir. kullanmak için CD34 + hücrelerinin sayısı farelerde (sıçan başına 1 milyon hücre) sayısına göre belirlenir.
   2. Kat olmayan bir doku kültürü kuyu gerekli sayıda yeniden birleşen insandaki fibronektin çözeltisi 1.25 ml (örn., Retronectin) (PBS içinde 20 ug / ml) her birinin içine de 6-plaka işlemden geçirildi. plaka örtün ve temiz bir biyo-güvenlik kabini, oda sıcaklığında 2 saat boyunca bekletilir.
   3. Aspire fibronektin kuyulardan çözeltisi ve bloke edilmesi için her bir oyuğa FACS tamponu (% 4 FBS ile PBS), 1.25 ilave edin. Plaka 30 dakika oda sıcaklığında (25 ºC) bekletin.
   4. PBS ile bir kez aspirat FACS Tampon ve yıkama kuyuları.
   5. plaka kullanıma hazır olana kadar kaplanmış kuyularda PBS tutun. hemen kullanılmadığı takdirde bir gecede 4 ° C'de plaka saklayın.
   6. Fibronektin çözeltisi ile kaplı çukurlara (Yssel en serumsuz T hücre ortamı içinde% 2 insan serumu albümini) Enfeksiyon Orta levha CD34 + hücreleri (yaklaşık 2 x 10 ⁶ hücre / mL) ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   7. arasında bir enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) kuyulara lentiviral vektör eklemek için bir pipet kullanın 2 - 10. yavaşça karıştırın ve 37 ºC de gece inkübe edin.
      NOT: Kullanılan lentivirüs vektör titresi önceden tespit edilmelidir.
   8. yavaşça bir hücre kazıyıcı ile kuyu diplerinde kazıyarak ertesi sabah hücreler hasat. hücreleri toplamak ve şu anda hemasitometre ile saymak.
   9. , Implant için hücreleri hazırlamak ml 1.5 steril vida kapaklı tüplere fare, kısım başına 4,5 x 10 ⁶ CD34 hücreleri ile 0,5 x 10 ⁶ transduced CD34 + hücreler birleştirmek için. , Aspirat süpernatant onları pelet 300 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 300 xg'de tekrar Spin ve bir P10 pipet kullanarak herhangi bir kalan süpernatant aspire ve aspire çok carefully. Çalışma boyunca buz üzerinde kuru taneler halinde saklayın. Not: Hücreler pelet hücreleri kullanmak ve 2-3 saat içinde ameliyat, canlı olduğundan emin olmak için.
   10. , Aspirat süpernatant onları pelet fare başına 0.5 x 10 ⁶ transduced CD34 + hücreler spin enjeksiyon için hücreleri hazırlamak için. fare başına 100 ul RPMI medya hücreleri tekrar süspansiyon ve buz üzerinde tutmak.
   11. Transdüksiyon verimliliği kontrol etmek için, kısım yaklaşık 1 X 10 ⁵ transdüksiyona ile takviye edilmiş ve 200 ul sitokin ortamında (% 10 FBS ile RPMI ortamı içinde her bir durum ve kültürden CD34 + hücreleri transdüse 100 ng / ml insan IL-3, IL-6, 37 ° C 'de 7 gün 5 - 96-oyuklu bir plaka içerisinde, SCF).
       Not: bu transdüksiyon sağlamak için, fakat bu basamakta kullanılan hücreler cerrahi kullanılmaz başarılı olduğu ve vektör kök hücre hayatta kalma ve yenilenmesi için toksik değildir. İletimi verimliliği (GFP ve CD4 örn.) Vektörün gen ifadesi bakarak kontrol ve flow sitometri ile analiz edilebilir.
3. Doku nakli Genetiği Fare Construct
   1. Aynı gün, ameliyat öncesi bir sezyum-137 irradiator 2.7 Gy (270Rad) dozunda NOD.Cg- Prkdc ^SCID Il2rg t ^m1Wjl / szj (NTG) bağışıklığı farelerin toplam vücut ışınlama yapar.
      NOT: NTG fareler ağır bağışıklık yetersizliği bulunmaktadır. Bu nedenle konut ve bakım yüksek sağlık standardına uygun ve yüksek eğitimli personel tarafından ele gerekir.
   2. 60 mm çanak içine şişesi timus parçaları ve orta dökün. trokar temizlemek ve ıslak böbrek tutmak için kullanılacak bir 60 mm çanak içine PBS dökün.
   3. Buz üzerinde açık 1.5 ml steril vida kapaklı tüplere koyarak pozitif deplasmanlı pipet uçları Chill. Böyle Matrigel olarak kurutulmuş hücre pelet ve jelatinli protein karışımı ile buz üzerinde tutun.
      NOT: jelatinimsi protein karışımı ve herhangi tüpler veya ipuçları tutmak önemli olduğunuİmplant iğne yüklenene kadar her zaman soğuk dokunacaktır.
   4. fareler anestezi: bireysel fareler ve kayıt ağırlıkları tartılır; Kulak onları numaraya fareler yumruk. Ketamin 15 ul (tuzlu su içinde 2.6 mg / ml), vücut ağırlığının gramı başına / ksilazin (tuzlu su içinde 100 mg / ml)) ile karın içinden onları enjekte edilir. geri kafese fareler koyun ve tamamen anestezi olmak için bekleyin.
      NOT: Bir pençe sıkarak fare anestezi seviyesini kontrol edin. Fare refleks kaçınmaları, daha fazla fare uyutmak için Ketamin / Xylazine orijinal miktarının% 25-50 yönetmek. o refleks ameliyatı gerçekleştirmek için korkmak değil kadar bekleyin.
   5. Oster clipper (tıraş makinesi) kullanarak, sırt ve mide merkezi arasında omuz kalça her farenin sol tarafını tıraş. Deri altına hayvanın omuz veya kasık üçgen (bacak PIT) seyreltilir karprofen (6 mg / kg), 0.3 ml enjekte edilir. bir pamuklu çubuk kullanarak, Suni Gözyaşı küçük bir damla koymakHer gözün üzerine geri kafes içinde yan fare yatıyordu.
      NOT: - Bir seferde (5 fareler yaklaşık 4) bir kafes sınırı cerrahi hazırlık.
   6. PBS ile 16 ayar kanser implant iğne (trokar) kanülü yıkayın. künt kavisli bir forseps bir çift kullanarak, daha sonra kanül içine doku aspire geri trokar çekin, sadece açılıĢında trokar ile kanülün ağzına 60 mm çanak timus bir parça yerleştirin.
   7. kurutulmuş bir hücre peleti (implante hücreleri CD34 + ve CD34-karışımı) ile tüp içine soğuk jelatinimsi protein karışımı 5 ul koyun ve yavaşça hücre süspansiyonu üretmek için harekete geçirmek için bir pozitif yer değiştirme pipeti ve soğutulmuş ucu kullanın. yukarı pipet ve aşağı vermeyin. kanül ağzına jelatinimsi protein karışımı / hücre süspansiyonu Pipet ve yavaş yavaş iğne yüklemek için geri trokar çekin.
      NOT: Bu bir implant iğne manipüle ederken pipet yüklemek için bir yardımcı olması tavsiye edilir.
   8. Povidon-iyot ile fare traş alanı Swab ve daha sonra üç kez bir alkol ile bölgeyi mendil silin. deri altında karanlık nokta belirleyin. Bu dalak konumunu belirtir. Böbrek yaklaşık dalak 5 mm dorsal olduğunu. kavisli bir forseps ile cilt yukarı kaldırın ve dalak cilt paralel olarak cerrahi makas ile 15 mm uzunluğunda bir kesi yapmak. Ardından periton benzer bir kesim aşağıda katman yapmak. Erkeklerde, böbrek kolayca görünür olması ve karın basılarak haddelenebilmektedir. Bir hemostata veya kavisli künt forseps bir çift ile böbrek destekleyebilir. Kadınlarda, yumurtalık kolay çıkarma gelen böbrek engellemek için eğilimindedir. Bir hemostat kullanarak, yumurtalık pick up ve dikkatli bir şekilde böbrek dışarı maruz kalmaktadır.
   9. böbrek kapsülü arka ucunda küçük bir delik koparmak için iğne uçlu forseps kullanın.
      NOT: biohazard malzemeleri işlemek için bu iğne uçlu forseps kullanmayın.
   10. implant kaydırınkanül açılması tamamen böbrek kapsülü ile kaplıdır kadar bu deliğe ve böbrek boyunca iğne.
   11. Yavaşça böbrek kapsülü altında doku a'ya ve iğne dışarı geri çekin. timus parçaları kadar emin timus parça iğne ile dışarı gelmez yapmak için kavisli bir forseps kullanımı yapışkan olabilir.
   12. Forseps ile periton yukarı kaldırın ve yavaşça yerine geri böbrek itmek için hemostat kullanın. 4-0 vikril emilebilir sütürler kullanılarak periton bir çift düğümlü dikişi bağla. Cildi kapatmak için iki autoclips yara klipleri kullanın.
   13. Enjeksiyon için bir kenara bırakıldı transduse CD34 + hücrelerin karışımı ve bir insülin şırıngaya 100 ul (0.5x10 ⁶ hücre) alıma izin verir. retroorbital ven içine veya damara enjeksiyon başka uygulama yolları ile fare, bu hücrelerin enjekte edilir. bir pamuklu çubuk kullanarak, bir kafes içinde geri tarafında fare her gözün üzerine Yapay Tears küçük bir damla koymak ve yattı.
   14. Tüm farenin b sonraeen hayvanlar bilinç kazanmak ve onları ayrılmadan önce normal yürüyebilen teyit implante.
   15. Ameliyat sonrası bakım: ameliyattan bir gün sonra, deri altından her bir farenin steril tuzlu su, 0.3 seyreltildi karprofen (6 mg / kg) ile yıkanır ve 1.2 mL enjekte edilir. 2 ve 3 gün subkutan her fareye steril serum fizyolojik 1.5 ml enjekte ameliyat sonrası. fareler ve ameliyatı takiben 10-14 gün süreyle kesiler izleyin. Autoclips çıkarın ve 10-14 gün sonra fareler tartın. NOT: Radyasyon ve tuzlu enjeksiyon susuz hale gelen hayvanlar önler sonra Fareler halsiz.
   16. 8 Sonra - 10 hafta, farelerin kanama ve periferik kan FACS analizi gerçekleştirerek, örneğin CD45, CD3, CD4, CD8 ve vektör ifade etmelidir herhangi genler olarak belirteçleri için boyanarak engraftman kontrol edin.

2. Farklılaşma Karakterizasyonu ve Gen Modifiye Hücrelerin Gelişimi

1. KarakterizasyonuPeriferik kandan gen modifiye edilmiş hücreler
   1. 8 - retro-orbital kanaması fare kanı 100 ul - 10 hafta sonra nakli, 50 edinin. EDTA 10 ul içeren mikrosantrifüj tüplerinde yerleştirin. 3 dakika boyunca 350 xg'de Santrifüj hücreleri. Plazma toplayın. Fare HIV ile enfekte olup olmadığını ELISA analizi veya plazma viral yük deneyi için -80 ° C'de dondurun.
   2. Kırmızı kan hücreleri lize etmek için 2 mi _NH4CI (% 83) solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında (25 ° C), 5 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpün doldurulması için, 10 ml RPMI% 10 FBS ekleyin. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin. dikkatle Süpernatant aspire. Hücreler, imüno-lekeleme için hazır ve analiz ve diğer deneylerde akış sitometrisi.
      NOT: Çeşitli hematopoetik hücre soylarının, aktivasyon ve naif veya bellek hücreleri için fenotipik belirteçler markerleri her 2 hafta önce ve flow sitometri ile HIV enfeksiyonu sonrasında ölçülebilir. Gates, izotop kontrolleri ile hücrelerin boyanması tarafından oluşturulur. Sağlığını leke önerilirhy insan PBMC'ler ve kullanım olarak pozitif kontrol. Seçenek olarak ise, farenin ötenazi olabilir ve periferik kan kadar 1 ml akış analizi ¹⁷ çoklu paneller için yeterli hücre sağlayacak kalp ponksiyonu elde edilebilir.
2. Dalak, timüs ve kemik iliğinden genin özelliği modifiye edilmiş hücreler
   1. Insanlaşmış BLT fareler ile hasat Dalak, timus ve Kemik İliği
      1. izofluran doz aşımı ile fareler Euthanize. İkincil servikal dislokasyon ile ötenazi onaylayın. dokulara yapışmasını kürk tutmak için% 70 etanol ile karkas yüzeyine püskürtülür. Bir mum diseksiyon tepsi üzerinde uzuvları aşağı pin.
      2. Cildi açmak kesip, cerrahi makas kullanın ve daha sonra vücut boşluğuna maruz periton katmanın kesti.
      3. forseps kullanarak dalak çıkarın. forseps ve makas kullanılarak böbrek üzerinde timik implant çıkarın. etiketli tüpler conta timik implant ve dalak koymakining 5 ml PBS.
      4. orta karın kesilmiş ve alt ekstremite kapsayan fare distalinde cilt çıkarmadan.
      5. makas kullanarak alt ekstremite kasları kesti ve dikkatle kalça ekleminden asetabulumun yerinden. femur ve tibia çıkarın ve 5 ml PBS içeren bir tüp içine yerleştirin.
   2. Splenositlerin izole edilmesi
      1. 50 ml'lik konik bir tüp üzerinde 100 | iM hücre süzgeç yerleştirin. % 10 FBS ve pen / strep (komple RPMI ortamı) ile takviye edilmiş RPMI ortam 3 ml süzgeç ıslatın.
      2. hücre süzgecinden üzerine dalak yerleştirin. 10 ml şırınga lastik pistonu kullanarak, 50 ml tüp içine süzgecinden bunu ayırmak dalak ezin.
      3. 5 ml RPMI tam ortam 4 ila 5 kat hücre süzgeç durulayın.
      4. 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri dönerler.
      5. 5 ml kırmızı kan hücre parçalama tamponu aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet. Oda sıcaklışında inkübe10 dakika süre ile Ture. 7 dakika boyunca 300 xg'de 20 ml RPMI tam medya ve spin ekleyin.
      6. Süpernatant aspire ve 10 ml RPMI tam ortam tekrar süspansiyon pelet ve 100 mikron hücre süzgecinden tekrar filtre. hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
         Not: Hücreler akış analizi ex vivo deneyleri için kullanılabilir ve viably daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir. Hücre sayımı önce, tripan mavisi yaşayan hücrelerin sayısını belirlemek için kullanılabilir.
   3. Implant İnsan timositlerin İzolasyonu
      1. 6 gözenekli bir plakada bir oyuk PBS 5 ml timus yerleştirin. Kullanarak temiz künt forseps ve makas küçük parçalar halinde timus kesti.
      2. kuyuya sterilize paslanmaz çelik hasır kare yerleştirin. 10 ml şırınga lastik pistonu kullanarak, timus bozmaya paslanmaz çelik örgü üzerine timus parçaları ezin.
      3. 100 mikron hücre süzgecinden de ve gerilme hücreleri tekrar süspansiyon. 10 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri dönerler.10 ml komple RPMI medya hücreleri Askıya. kümeleri görülebilir, tekrar bir hücre süzgecinden yeniden süspanse-hücrelere geçerler.
      4. hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
         Not: Hücreler akış analizi için kullanılmaktadır ve viably daha sonra kullanılmak üzere dondurulabilir.
   4. Kemik iliği hücrelerinin izolasyonu
      1. Temiz ve sterilize harç ve% 70 etanol ile havanda dövmek. harcın içine femur ve tibia yerleştirin. soğuk PBS 5 ml. PBS ışık pembe ve bulutlu dönene kadar kemikleri ezmek için havan kullanın.
      2. 50 ml konik tüp yerleştirilen 50 uM hücre süzgecinden harç ve filtreden sıvıyı pipetle. 5 ml PBS ile harç yıkayın ve PBS berrak hale gelinceye kadar beş kez tekrarlayın.
      3. 7 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 10 ml komple RPMI medya aspire supernatant ve tekrar süspansiyon.
      4. hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
         Not: Hücreler akış analizi ve viably Dondurulmuş ön olabilir, ex vivo deneyleri için de kullanılabilirveya daha sonra kullanın.

Gen Modifiye Hücre 3. Fonksiyonel Karakterizasyonu

1. HIV enfeksiyonu ve viral replikasyon Zaman İçinde izlenmesi
   1. İnsan immün sistemi, tekrar yapılma onaylanmasından sonra, bir insülin şırıngası kullanılarak retroorbital ven enjeksiyon yoluyla HIV virüsü istenilen miktarda enjekte edilir. HIV enfeksiyonu sonrasında, retroorbital her 2 haftada bir kanama yoluyla 100 ul periferik kan toplamak.
   2. 2.1.2 - kısmen 2.1.1 adımları izleyerek Hasat plazma. HIV viral yükü testi için, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir RNA özütleme kiti kullanılarak viral RNA çıkarmak ve ^4,8,18,19 kullanılan HIV virüsü için uygun primer ve prob setleri ile gerçek zamanlı RT-PCR ile viral yük ölçer.
   3. hücresi ile ilişkili HIV RNA ölçmek ve aktif HIV ile enfekte olan hücreleri belirlemek için, ilk adımlar 2.1.2 aşağıdaki RBC lizis gerçekleştirmek
   4. 1 yeniden süspanse hücre süspansiyonu; Ml PBS, iki tüp içine eşit bölmek. 5 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Süpernatant aspire.
   5. hücresi ile ilişkili RNA ölçmek için, RNA üreticinin talimatlarına göre RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak ve uygun astar ve prob setleri kullanarak gerçek zamanlı RT-PCR gerçekleştirmek ayıklayın.
      NOT: primer / prob modifiye kök hücre için kullanılan lentivirüs tanımıyor olması önemlidir
   6. HIV akış ile enfekte olan hücreleri ölçmek için, 50 ul FACS Diğer bir tüp içinde tekrar süspansiyon hücreleri tampon ve anti-CD45, anti-CD4 ve anti-CD3 gibi istenen antikor yüzeyi leke gerçekleştirin. Yüzey leke sonra, düzeltmek ve anti-Gag antikoru (klon KC57) kullanarak gag ifadesi için hücre hücreleri ve leke permeabilize. Akış sitometri gerçekleştirin.
2. Genin ex vivo sitokin analizi splenositlerinden Hücreler Modifiye
   1. farelerden alınan hasat splenositlerin bölüm 2.2.2 de açıklandığı gibi.
   2. hedef hücreleri hazırla. Fonksiyonel test etmek içinCD4 kimerik antijen reseptörü tadil edilmiş T hücrelerinin lık, hedef hücreler olarak HIV ile enfekte T1 hücreleri kullanır. , Sitokin deneyi için 3 gün önce HIV T1 hücreleri enfekte anti-HIV gag antikoru (klon KC57) ile hücre hücrelerin boyanmasıyla HIV enfeksiyonunu teyit etmektedir. kontrol hedef hücre olarak enfekte edilmemiş T1 hücreleri kullanır.
   3. gece boyunca 1: 1 oranındaki bir hedef veya kontrol hücreleri ile splenositler Co-inkübe edilir. En iyi sonuç için, bir titrasyonu yürütmek (1: 1, 1: 3, 1: 9) efektör (splenositleri) hedef hücrelere karşı (enfekte T1). Örneğin, 0.25 ml RPMI tam ortam içinde yeniden süspansiyon haline 0.9, 0.3 ya da 0.100.000 enfekte T1 veya enfekte edilmemiş T1s ekleyin, 0.25 ml RPMI tam ortam içinde tekrar süspansiyon 0.900.000 splenositlerin.
   4. 6 saat protein taşınmasına inhibe eden ve hücre dışı belirteçleri ve ^8'de daha önce açıklandığı gibi sitokin hücre içi ifade için boyama yapmak için, ertesi sabah, protein taşınmasına önleyici.

Şekil 1 değiştirilmiş kök hücre ile insanlaşmış BLT farelerin inşa bir taslağıdır. 10 hafta implant cerrahisi sonrası, fareler gen modifiye edilmiş hücrelerin farklılaşmasını ve gelişmesini değerlendirmek için feda edildi. Şekil 2'de gösterildiği gibi, birden fazla lenfoid dokular (kan, karaciğer, dalak, timus, kemik iliği) CD4ζCAR ile değiştirilmiş olan bir fareden hasat edilmiştir. Bu protokolde kullanılan CD4ζCAR anti-CD4 antikoru ve GFP ⁸ sentezlenmesi ile tespit edilebilir CD4 kimerik antijen reseptörü ve GFP içerir. Hücreler izole edilmiş ve, insan CD45 karşı antikor ve anti-CD4 antikoru ile boyanmış ve akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. GFP ve CD4 çift pozitif hücrelerin birden çok lenfoid dokularda CD4CAR + hücrelerinin mevcudiyetine işaret eden, tespit edilmiştir.

Gen modifiye edilmiş hücrelerin farklılaşmasını araştırmak için, Splenositler, insan CD45 (lenfosit), CD3 (T hücreleri), CD19 (B hücreleri), CD14 (monosit ve makrofajlar) ve CD337 (NK hücreleri) karşı antikorlar ile boyandı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, CD4ζCAR hematopoietik kök hücreler birden fazla soy içinde farklılık gösterir.

CD4CAR değiştirilmiş hücreler fonksiyonel olup olmadığını araştırmak için, biz CD4CAR hücreleri (HIV bulaşmış T1 hücreleri veya kontrol olarak bulaşmamış T1 hücreleri) tanıyacağını hedef hücreleri ile splenositlerin coincubated. Hücreler, gece boyunca birlikte inkübe edildi ve protein taşınma inhibitörünün ilave 6 saat boyunca ilave edildi. Daha sonra, hücreler, sabit ve IFNy ve TNFa gibi sitokinlerin hücre içi ifadesi için leke permeabilize edilmiştir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, ARAÇ ifade eden hücreler, enfekte T1 hücreleri ile IFNy ve TNFa yüksek miktarda üretilir.

yük / 54048 / 54048fig1.jpg "/>
Şekil 1:. Fetal timus: değiştirilmiş kök hücrelerle insanlaşmış BLT farelerin inşaat FT Anahat. FL:. Fetal karaciğer bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2:., CD4 kimerik antijen reseptör modifiye edilmiş hücreler çok lenfoid dokularda tespit edilebilir fare CD4CAR değiştirilmiş HSCler ile toplandı cerrahi ve birden çok lenfoid dokuların 10 hafta sonra kurban edildi ve hücreler, anti-insan CD45 ve anti-insan CD4 antikor ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3:.. CD4 kimerik antijen reseptörü değiştirilmiş hücreler birden fazla soy içine ayırt edebilirsiniz CD4CAR değiştirilmiş farelerin splenositler hasat ve insan CD45, CD3, CD19, CD14 ve CD337 karşı antikorlar ile boyandı ve akış ile analiz edilmiştir sitometri bir büyük görmek için tıklayınız Bu rakamın sürümü.

Şekil 4:. CD4 CAR + T hücrelerinin ex vivo sitokin tahlil HIV elde edilen dalak CD4CAR fareler gösterilir HIV bulaşmış veya enfekte olmayan T1 hücreleri ve sitokin onların hücre içi üretimi ya ile uyarıldı enfekte. Vie için tıklayınızBu rakamın wa daha büyük bir versiyonu.

CAR ve klinik çalışmalarda doğru HSC tabanlı mühendislik bağışıklık kazanıyor ivme ile, yakından bu mühendislik hücrelerin farklılaşması ve işlevini incelemek için uygun bir hayvan modeli olması önemlidir. Bu protokolde inşa ve HIV'e karşı tasarlanmış genetiği değiştirilmiş kök hücrelerle hümanize fareler test edilmesi için yöntemler tarif. Nakli öncesinde kök hücrelerin etkin transdüksiyonunu olması önemlidir. Bununla birlikte, hedef hücrelerin tanınması üzerine çoğalma T hücresi yeteneği nedeniyle, kök hücre modifikasyonunun düşük seviyelerde, HIV replikasyonunun ^8'e karşı güçlü bir tepki elde etmek için yeterli idi.

Bununla birlikte, kök hücre değişikliğinin yüksek düzeyde sağlamak için, otolog timus yerine karaciğer ve başka bir yerde ^13-15 tarif edilmişti fareler ameliyat için timus parçaları ile jelatinimsi protein karışımı içinde transduced CD34 + hücreler kullanmanızı öneririz. Jelatinimsi Protein karışımı solubiliz olanhücre dışı matriks protein açısından zengin ed doku bazal membran. Normal fizyolojik şartlar altında, jelatinimsi bir protein karışımı, kök hücre ²⁰ etkin eki ve farklılaşmasını sağlayacak bir yeniden, biyolojik olarak aktif ve stabil matrisi üretmek üzere polimerize. İnsan hücre sulandırma retroorbital kanama kontrol ve 6 akım sitometri olabilir - 8 hafta sonrası cerrahi. Vektör kök hücre hayatta kalma ve yenilenmesi için toksik olmayan sağlamak için, 1.2.6 tarif edildiği gibi deney öncesinde CD34 + hücrelerinde vektör titre önerilir.

NTG-blt fare modeli kapasitesi, HIV enfeksiyonunu tedavi etmek için ¹ HIV bağışıklık patolojisi ve hücre bazlı terapiler incelemek için yüksek ölçüde yararlı bir model haline getirir mukoza enfeksiyonu tutarlı viremi ve hücresel bağışıklık tepkilerini desteklemek. En önemlisi, NSG-BLT farelerden elde T hücreleri kaderi incelemek için araştırmacı izin otolog timik dokusunda seçilirtimik seçimi ^8,21 sonra gen modifiye kök hücrelerin. açıklanan yöntemle, sürekli 40% -90% insan immün hücre sulandırma almak mümkün olmuştur. insan hücre sulandırma düşük seviyelerde cerrahi ve organ nakli için doku kalitesini yapan kişinin beceri dahil olmak üzere birçok faktöre kaynaklanabilir. insan hücre sulandırma yüksek seviyede elde edilmesi için, güvenli bir şekilde böbrek kapsülü altından yerleştirilen nakli sağlamak için önemlidir. Buna ek olarak, son derece hafif mikroskop altında ameliyat için hazırlanan her timik implantı incelemek ve herhangi bir şüpheli parçaları atmak için tavsiye edilir.

Insanlaştırılmış blt fare modelinde ^(1,15,22 gözden) HIV'e karşı tasarlanmış bağışıklık çalışmak için gelecek vaat eden bir araç da, kendi sınırlamaları vardır. Yani, bu model mükemmel bir insan periferal bağışıklık sistemini taklit etmez. Çalışmalar hiper-mutasyona uğramış, sınıf-anahtarlamalı IgG Antibo bozukluğu gelişme göstermiştir^1,23 dy. Ayrıca, bağışıklık eksikliği fareler kullanılarak teknik açıdan zor ve sağlıklı bu fareler tutmak önemli kaynaklar ve eğitim gerektirir. Ince fırsatçı enfeksiyonlar numuneler üzerinde olduğu gibi önemli farklılıklar tezahür ve potansiyel deney üzerinde olumsuz sonuçlar doğurabilir. Nedenle gelecekteki veri ^1,24 bütünlüğünü korumak için iyi hazırlanmış tesisleri ve uygun şekilde eğitilmiş personel olması önemlidir. Bu örneklerde ^4,8 gösterildiği gibi kafasında böyle sınırlamalar, insanlaştırılmış NSG-BLT fare modeli hala kök hücre bazlı mühendislik bağışıklığın çalışma için önemli bir araç sağlar.

Antikorlar ¹⁰ ve daha verimli CAR ²⁵ sinyal etki modifikasyonunu nötralize HIV Broad dayalı kimerik antijen reseptörleri geliştirme eğilimi ile, bu model ve protokol karakterize ve gen modifiye cel işlevselliğini araştırmak için kullanılabilirSYR'lerinden yeni nesil ls. Buna ek olarak, bu model potansiyel projelendirilmiş bağışıklık birlikte (örneğin inhibitör reseptör blokajı gibi) bağışıklık bazlı terapi çalışmaları ağırlayacak.

The authors have nothing to disclose.

We would like to thank Ms. Jessica Selander in providing artistic assistant in making our figures. This work was funded by grants from the NIAID/NIH, grant no. RO1AI078806, the UCLA Center for AIDS Research (CFAR), grant no. P30AI28697, the California Institute for Regenerative Medicine, grant no. TR4-06845, the American Federation for AIDS Research (amfAR), grant no. #108929-54-RGRL, and the UC Multi-campus Research Program and Initiatives, California Center for Antiviral Drug discovery (CCADD)