Method Article
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Prostat bezi, öncelikle düz kas 1 oluşan Fibromusküler stroma ile çevrili glandüler asinüs düzenlenmiş salgı epitel oluşan heterojen bir dokudur. Bazal hücreler, salgı hücreleri, nöroendokrin hücre transit yükselterek hücre ve kök hücre 2: epitelial bölmesi, beş farklı ama organize hücre tiplerinin oluşur. Luminal epithelial hücrelerde ortaya çıkar, prostat kanseri (PCa) 'de, adenokarsinom büyüme stromal bölmesinde 3 arasında belirgin bir aşamalı bir düşüş olur. Bu nedenlerden dolayı, doku örnekleri PCa ölçüde göre stromal ve epitelyal hücre tipinin orantılı olarak belirgin farklılıklar vardır. Bu farklılıklar, istenen hücre tipi mikrodiseksiyon bakılmaksızın tüm dokulardan elde edilen gen ekspresyon verileri yanlı varsayımlar yol açabilir. Bu nedenle, bu önyargı kaldırmak için onu önce RNA ekstraksiyon ve hücre tiplerini ayırmak için esastırgen ekspresyon analizi.
Macrodissection ya mikrodiseksiyon fiziksel çevredeki stroma 4 -6 den iyi karakterize edilmiş epitelyal alanları ayırmak için kullanılabilir. Macrodissection tipik bir mikroskop altında bir jilet ile yapılan ve büyük PCa stromadan nodüller ayırmak için iyi çalışır, ancak stroma çevreleyen benign epitel kaldırma yeteneğine sahip değildir (Şekil 1'de huylu prostat histoloji örneğe bakın). Bir lazer (LCM) ile Mikrodisseksiyonla macrodissection önemli ölçüde daha fazla emek yoğun, ama çok doğru bir iyi huylu epitel 4 incelemek olabilir.
Bizim laboratuardan Son yayınlar RNA başarıyla formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) biyopsi veya dondurulmuş doku 4,7-9 birinden LCM tarafından elde edilebilir olduğunu göstermiştir. LCM-RNA ekstraksiyonu büyük zorluklar R 1) doğru dokuda istenilen alanlarını incelemek için, ve 2) korumak için vardırLCM ve izolasyon işlemi 4.10 sırasında NA bütünlüğü. Saf hücre popülasyonlarının izole RNA ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR) 7,8, mikrodizi 11 ve derin -sequencing 12-14 dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle gen ekspresyon analizi için kullanılabilir.
Bu protokolün amacı, aşağı doğru gen ekspresyon analizleri donmuş dokudan LCM prostatik epitel toplam RNA'nın izole edilmesi için.
Bu deneyler için kullanılan tüm insan dokuları Chicago'daki Illinois Üniversitesi'nde Kurumsal Değerlendirme Kurulu onaylı protokol ve / veya muafiyet yoluyla elde edildi.
1. Bölüm Taze Donmuş Prostat PEN-slayt üzerine ve Ücretli Cam Slide üzerine
2. Hematoksilen Eozin ve-Y (H & E) histolojik Mark-up için Leke
Not: Bu yüklü cam slayt doku ve DEĞİL LCM PEN-çerçeve slayt için eğer.
PEN-frame Slaytlar 3. Toluidine Mavi Boyama
Not: ThLCM olarak AYNI GÜN yapılır edilir. Tüm çözümler için depcH 2 O su kullanın. RNaz ücretsiz alan tüm adımları tamamlayın. Tüm coplins RNaz dekontaminasyon çözeltisi ile temizlenmelidir.
4. Lazer yakalama Mikro diseksiyon (LCM)
Bir Fil ile 5. Toplam RNA izolasyonuter bazlı Takımı ve Kalite Analizleri
6. Gen İfadesi Analizi
Not: (mRNA ve lncRNAs gibi) uzun bir RNA türünün gen ekspresyonunu Aşama 6.1 ve kısa RNA türünün (mikroRNA gibi) gösterilir aşama 6.2'de gösterilmiştir. Farklı kitleri RT-qPCR için kullanılabilir ve gerekli RNA miktarı (10 ng kadar az) kiti göre değişir. RNA sekans analizi, 6.3 tarif edilmektedir.
Bir önceki çalışmada aynı hastadan 4 dondurulmuş ve FFPE prostat dokularından mRNA ve microRNA RT-qPCR ifade profilleme karşılaştırmak epitel ve stromal doku toplamak için LCM kullanımını gösterdi. LCM RNA büyük miktarda nesil sekans analizi için toplanacak olan, özellikle de zaman alıcıdır. Bu nedenle, çalışma alanı tutmak için çok önemlidir ve araçları ücretsiz RNaz. (Bir sonraki paragrafta daha ayrıntılı olarak ele) toplandı RNA kaliteli ve hücre-özgüllük kontrolleri incelemek için tavsiye edilir. Şekil 1 önceki ve lazer yakalama huylu epitelyum sonra bir mikroskop altında PEN-frame sürgü üzerinde bir lekeli prostat kesiti göstermektedir .
Örnek toplanır ve RNA dikkatli bir şekilde ekstrakte edilir sonra, Tablo 1 'de gösterildiği gibi, RNA kalitesini ve miktarını değerlendirmek için önemlidir. Düşük 260/280 nm oranlarını gözlemlemek için nadir değildir. RNA olacak Yoğunlaştırıcı260/280 nm oranlarını geliştirmek, ancak aynı zamanda, küçük RNA türünün kaybına neden olabilir. Kalite kontrol ek olarak, dokunun (- Cı Şekil 1B) lazer ele alan özgüllüğünün doğrulanması için hücre tipine özgü kontrol incelemek için çok önemlidir. Örneğin, Şekil 1 B 'de AMACR geninin ifadesi normal epitel doku ile karşılaştırıldığında prostat kanseri epitel doku teyit etmek için ölçülmüştür ,. Şekil 1c'de NKX3.1 ekspresyonu LCM-toplanan numune içinde stroma olmadığını göstermektedir. Örnekteki RNA kalitesini de bilinmektedir, kaliteli RNA RNA compareed edilebilir. RNA ekstre edildi, uzun ve küçük RNA (Tablo 2) kalitesini teyit kültürlenmiş birincil epitel hücrelerinden toplanan olarak LCM-collected- dokusundan izole RNA'lar için RT-qPCR Ct değerleri, aynı aralığındadır. Son olarak, Tablo 3 bu RNA nesil RNA sequenci için yeterli kalitede olduğunu gösterirng.
Şekil 1: lazer yakalama mikro diseksiyon ile insan prostat benign epitel, prostat kanseri epitel ve stroma toplanması öncesinde ve iyi huylu epitel LCM-toplandıktan sonra toluidin mavisi ile boyandı (A) prostat biyopsisi.. (B - C) 45 hastadan LCM tarafından toplanan dokular hücresel kimlik 7 uygun gen işaretleri ifade. (B) AMACR prostat kanseri bir göstergesi olan ve kanser dokularında sadece tespit edilebilir. (C) NKX3.1 epitel bir göstergesi olan ve stromal dokularda tespit değildir. Bu rakam Giangreco ve diğ., 2015 JSBMB 7 modifiye edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1: LCM-Toplanan prostat dokusundan RNA kalitesi ve miktarı.
Tablo 2: RT-qPCR LCM toplanan Prostat huylu epitelden.
Tablo 3: LCM-Toplanan prostat dokusundan RNAseq.
İnsan örneklerden gen ekspresyonu kalitesi veya uygun bir doku miktarı için değil, aynı zamanda, belirli bir doku numunesinde mevcut olan çeşitli histolojik kişiler için değil, sadece zor olabilir. Bu iyi huylu dokular büyük ölçüde stromal doku ve kanser alanlardır stroma yoksun olduğu prostat özellikle zordur. LCM, iki farklı hücre tipleri (Şekil 1A) daha doğru bir imza prostat stroma ve epitel RNA fiziksel olarak ayrılmasını kolaylaştırır. Macrodissection veya bütün doku işleme kıyasla, LCM huylu dokularda hücre bölmelerini ayırmak, ancak önemli ölçüde daha pahalı ve emek yoğundur olabilir.
Herhangi bir tekniği mümkün tuzaklar vardır. Örneğin, RNA kalitesi ilk numune alımı sırasında ya da LCM ve çıkarma işlemi sırasında kısmen bozulmuş olabilir. İlk durumda, gen ifadesi farklı kısa AMPL ölçüm elde edilebilirqPCR simgeler. İkinci durumda, tüm araç ve malzemenin vicdanlı RNaz ücretsiz tedavi RNA bozulmasını yanı sıra doku kesitlerinin dikkatli taşıma ve işleme önlemek için alınmalıdır. Ayrıca, en az 90 dakika bir slayttan harcanan zaman sınırlayıcı toplama işlemi sırasında RNA kalitesini korur. LCM tekniğinin en büyük sınırlama, bir LCM enstrüman erişim ve LCM yapmak için gerekli emektir.
Lazer yakalama mikrodiseksiyon mikroskoplar çeşitli türleri vardır. Bu protokol daha sonra aşağıda koleksiyonu kapağa düşer alanları sınırlayan için lazer kullanan bir LCM kullanımını tarif eder. LCM Bu tür toplamak için ayrı ayrı çok-hücreli alanlar içeren, prostat dokusu içinde epitel ve stroma ayrılması için idealdir, ama LCM bu tip dokudan izole tek tek tek hücreler için uygun değildir. Örneğin, bu protokol, yerleşik makrofajlar toplamak için kullanılmamalıdırs, nöroendokrin hücre ya da genellikle tek bir hücre olarak mevcut olan, İnfiltrasyon yapan lenfositler,. Bu hücre tiplerinin izolasyonu kolaylaştıran bir zara kapak üzerine doku tek hücreler "ateş" bir lazer kullanan diğer LCM alet ve yöntem mevcuttur.
Kapsamlı kalite kontrol ve RNA karakterizasyonu göz ardı edilemez. 260 nm'de abzorbans, RT-qPCR çalışmalar (Tablo 1) için RNA miktarını belirlemek için uygundur, fakat RNA-sequencing daha doğru bir boya dayalı bir yöntem için RNA miktarını belirler. RT-qPCR analizinde diğer önemli konu artık DNA kontaminasyonu potansiyel önyargı kaçınmaktır. Bu intron kapsayan primerler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Orada kahya gen ekspresyonu, yüksek hasta heterojenlik nedenle, birden çok kahya genlerinin kullanımı, aynı zamanda ileri sürülmektedir ve tipik olarak üç 4,7-9 beş kullanımı (Şekil 1B - C ve Tablo 2).
gen profil yönteminin seçimi, sadece değil, aynı zamanda, alınan ve karşılaştırma istediği verilerin türü toplanan RNA miktarına dayalı değildir. Normal RT-qPCR nesil derin dizileme daha duyarlıdır ve böylece LCM işlem süresini 4 azaltılması RNA göreceli olarak küçük bir miktar gerektirir. Yeni nesil dizileme RNA hem kısa hem de uzun RNA türlerinin ifadesini ölçmek için etkili bir tekniktir. Yeni nesil dizileme ayrıca yeni RNA türlerinin 13 keşif verir. Neyse ki, yeni nesil dizileme maliyet azalmaktadır.
Özetle, bu protokol, dondurulmuş prostat dokusu epitel ya da stromal hücrelerin homojen popülasyonları RNA izolasyonu sağlar. RNA selim ve hastalıklı prostat doğru hücre tipine spesifik gen ifadesi için bir araç sağlamak için çok sayıda alt-analiz teknikleri kullanılabilir. Bu tip veriler bilgi An katkıdaRNA ifade hastalığı patoloji nasıl farklı d anlayışı.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır