Method Article
The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
La prostate est un tissu hétérogène composée d'épithélium sécrétoire disposé dans acini glandulaires entouré par stroma fibromusculaire composée principalement de muscle lisse 1. Le compartiment épithélial est composé de cinq différents types de cellules, mais organisés: cellules basales, les cellules sécrétoires, les cellules neuroendocrines, cellules amplificatrices de transit et les cellules souches 2. Dans cancer de la prostate (CaP), qui provient des cellules épithéliales luminales, la croissance de l'adénocarcinome provoque une baisse progressive évidente du compartiment stromal 3. Pour ces raisons, les échantillons de tissus auront des différences distinctes dans la proportion et le type de stroma des cellules épithéliales en fonction de l'étendue de la PCa. Ces différences peuvent conduire à des hypothèses biaisées des données d'expression génique acquis à partir de tissus entiers sans égard à la microdissection du type de cellule souhaité. Par conséquent, pour éliminer ce biais, il est essentiel de séparer les types de cellules avant l'extraction de l'ARN etanalyse de l'expression génique.
Macrodissection microdissection ou peuvent être utilisés pour séparer physiquement les régions epitheliales bien caractérisés du stroma entourant 4 -6. Macrodissection est généralement fait avec une lame de rasoir sous un microscope de dissection et fonctionne bien pour séparer grande CaP nodules de stroma, mais ne sont pas capables d'éliminer l'épithélium bénin du stroma entourant (voir l'exemple de bénigne de la prostate histologie à la figure 1). Microdissection avec un laser (LCM) est nettement plus de travail que macrodissection, mais peut disséquer de façon très précise l'épithélium bénigne 4.
Publications récentes de notre laboratoire ont montré que l'ARN peut être extrait avec succès par LCM soit de paraffine (FFPE) biopsies fixés au formol ou tissu congelé 4,7-9. Les principaux défis dans l'extraction LCM-ARN sont 1) de disséquer avec précision les zones souhaitées du tissu, et 2) de préserver RL'intégrité NA 4,10 au cours de la processus de LCM et l'isolement. ARN isolé à partir des populations de cellules pures peut être utilisé pour l'analyse de l'expression génique par plusieurs méthodes comprenant la transcription inverse-PCR quantitative (RT-qPCR) 7,8, microarray 11, et 12 à 14 -sequencing profond.
L'objectif de ce protocole est d'isoler l'ARN total de LCM prostate épithélium du tissu congelé pour analyse l'expression des gènes en aval.
Tous les tissus humains utilisés pour ces expériences ont été acquises via un protocole et / ou exemption Institutional Review Board a approuvé à l'Université de l'Illinois à Chicago.
1. L'article frais congelé prostate sur PEN-toboggan et sur Charged Glisser verre
2. hématoxyline et l'éosine-Y (H & E) pour les taches histologique Mark-up
Note: Cette si pour le tissu sur la lame de verre armé, pas la diapositive PEN-cadre pour LCM.
3. Bleu de Toluidine Coloration des diapositives PEN-cadre
Remarque: Thest se fait le même jour que le LCM. Utilisez depcH 2 O de l'eau pour toutes les solutions. Terminez toutes les étapes de zone de libre-RNase. Tous coplins doivent être nettoyés avec une solution RNase-décontamination.
4. laser capture microdissection (LCM)
5. ARN isolement total avec un FilKit base-ter et de l'analyse de la qualité
6. Gene Expression Analysis
Note: L'expression des gènes d'espèces d'ARN longs (comme ARNm et lncRNAs) est affiché à l'étape 6.1 et espèces d'ARN courts (comme microARN) est représenté dans l'étape 6.2. Différents kits sont disponibles pour la RT-qPCR et la quantité d'ARN nécessaire varie selon le kit (aussi peu que 10 ng). Analyse de séquençage de l'ARN est décrit dans le 6.3.
Dans une étude précédente, nous avons démontré l'utilisation de LCM pour recueillir des tissus épithéliaux et stromales de comparer le profil d'expression par RT-PCR quantitative de l'ARNm et microARN de tissus de la prostate et FFPE congelés provenant du même patient 4. LCM est chronophage, en particulier si grande quantité d'ARN doivent être collectées pour l'analyse de séquençage de nouvelle génération. Par conséquent, il est essentiel de garder à l'espace de travail et des outils RNase. Il est recommandé d'examiner les contrôles de qualité et de spécificité cellulaire de l'ARN collecté (discuté plus en détail dans le paragraphe suivant). La figure 1 montre une section de la prostate taché sur une lame PEN-cadre, sous le microscope avant et après laser capture épithélium bénigne .
Une fois que l'échantillon est prélevé et l'ARN est extrait avec soin, il est important d'évaluer la qualité de l'ARN et de la quantité indiquée dans le tableau 1. Il est pas rare d'observer faibles ratios 260/280 nm. Concentrant l'ARN seraaméliorer les ratios 260/280 nm, mais il peut aussi causer la perte de petites espèces d'ARN. En plus des contrôles de qualité, il est crucial d'examiner les contrôles spécifiques au type de cellules pour confirmer la spécificité de la zone de laser capturé du tissu (figure 1B - C). Par exemple, sur la figure 1B l'expression du gène AMACR a été mesurée pour confirmer cancer de la prostate par rapport à un tissu épithélial tissu épithélial normale ,. Sur la figure 1C l'expression de NKX3.1 confirmé l'absence de stroma dans l'échantillon LCM-perçu. La qualité de l'ARN dans l'échantillon peut également être à l'ARN de compareed connu, une bonne qualité de l'ARN. RT-qPCR valeurs Ct pour les ARN isolés à partir de tissu de LCM-collected- sont dans la même plage que l'ARN collecté à partir de cellules épithéliales primaires en culture, ce qui confirme la qualité de long et petit ARN extrait (Tableau 2). Enfin, le tableau 3 montre que cet ARN est de qualité suffisante pour la prochaine génération ARN sequencing.
Figure 1: Collection de l'épithélium bénigne, l'épithélium de cancer de la prostate et du stroma de la prostate humaine par laser capture microdissection (A) biopsie de la prostate colorées au bleu de toluidine avant et après LCM-collection de l'épithélium bénigne.. (B - C) Les tissus prélevés par LCM à partir de 45 patients expriment des marqueurs de gènes appropriés de l'identité cellulaire 7. (B) AMACR est un marqueur de cancer de la prostate et est uniquement détectable dans les tissus cancéreux. (C) NKX3.1 est un marqueur de l'épithélium et est non détectable dans les tissus du stroma. Ce chiffre est modifié à partir Giangreco et al., JSBMB 2,015 7. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: qualité de l'ARN et la quantité à partir de tissus de la prostate LCM-recueillies.
Tableau 2: RT-qPCR de LCM recueillies épithélium de la prostate bénigne.
Tableau 3: RNAseq à partir de tissus de la prostate LCM-recueillies.
Profil d'expression génique à partir de spécimens humains peut être difficile, non seulement pour la qualité ou la quantité de tissus disponibles, mais aussi pour les différentes entités histologiques présents dans un échantillon de tissu donné. Cela est particulièrement difficile dans la prostate dans laquelle tissus bénins sont en grande partie des tissus et des domaines du cancer stromales sont dépourvues de stroma. LCM facilite la séparation physique de la prostate stroma et épithélium de l'ARN pour une signature plus précise des deux différents types de cellules (Figure 1A). En comparaison macrodissection ou le traitement des tissus ensemble, LCM peut séparer des compartiments cellulaires dans les tissus bénins, mais est nettement plus coûteux et laborieux.
Comme dans toute technique il ya des pièges possibles. Par exemple, la qualité de l'ARN peut être dégradé au cours de l'approvisionnement en partie de l'échantillon initial ou au cours de la procédure d'extraction et LCM. Dans le premier cas, l'expression du gène peut être réalisée de mesure différent court amplicônes par qPCR. Dans le second cas, un traitement gratuit scrupuleuse RNase de tous les outils et le matériel doivent être prises pour prévenir la dégradation de l'ARN, ainsi que d'une manipulation prudente et le traitement des coupes de tissus. En outre, en limitant le temps passé sur une diapositive à moins de 90 min maintient la qualité de l'ARN au cours du processus de collecte. La plus grande limitation de la technique de LCM est l'accès à un instrument de LCM et le travail nécessaire pour faire le LCM.
Il existe plusieurs types de microscopes laser capture microdissection disponibles. Ce protocole décrit l'utilisation d'un LCM qui utilise le laser pour circonscrire les domaines, qui tombe alors dans un bouchon de collecte ci-dessous. Ce type de LCM est idéal pour la séparation de l'épithélium et du stroma de la prostate dans un tissu qui contient des zones discrètes de recueillir multicellulaires, mais ce type de LCM ne convient pas pour l'isolement des cellules individuelles uniques à partir d'un tissu. Par exemple, ce protocole ne doit pas être utilisé pour recueillir des macrophages résidentss, des cellules neuroendocrines ou des lymphocytes infiltrant, qui sont souvent présents sous forme de cellules uniques. Il existe d'autres instruments de LCM et des méthodes qui utilisent un laser pour «tirer» des cellules individuelles à partir de tissu sur un capuchon de la membrane, ce qui facilite l'isolement de ces autres types de cellules.
Contrôle de qualité minutieux et la caractérisation de l'ARN ne peuvent pas être négligés. L'absorbance à 260 nm est appropriée pour quantifier l'ARN pour la RT-qPCR études (Tableau 1), mais pour le séquençage de l'ARN d'une méthode à base de colorant avec plus de précision quantifie l'ARN. Une autre question importante dans l'analyse par RT-qPCR est d'éviter un biais potentiel de contamination de l'ADN résiduel. Ceci peut être accompli en utilisant des amorces qui couvrent introns. Il ya aussi une forte hétérogénéité des patients dans l'expression du gène de la femme de ménage, donc utiliser de multiples gènes de femme de ménage est proposé et nous utilisons généralement trois à cinq 4,7-9 (figure 1B - C et le tableau 2).
Le choix de l'expression génique méthode de profilage ne repose pas uniquement sur la quantité d'ARN recueillies mais aussi sur le type de données que l'on souhaite acquérir et comparer. RT-qPCR régulière est plus sensible que la prochaine génération de séquençage profond, et nécessite une quantité relativement faible de l'ARN diminuant ainsi le temps LCM procédure 4. Le séquençage de l'ARN de nouvelle génération est une technique efficace pour quantifier l'expression à la fois pour les espèces d'ARN courts et longs. Séquençage de nouvelle génération permet également la découverte de nouveaux types d'ARN 13. Heureusement, le coût du séquençage de prochaine génération est en déclin.
En résumé, ce protocole permet l'isolement de l'ARN de populations homogènes de cellules stromales ou épithéliales de prostate tissu congelé. L'ARN peut être utilisée pour de nombreuses techniques d'analyse en aval de fournir un outil pour l'expression génique spécifique d'un type cellulaire précis de la prostate bénigne et malade. Ce type de données contribue à une connaissanced compréhension de la façon expression de l'ARN diffère dans la pathologie de la maladie.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
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