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The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.
The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.
Die Prostata ist eine heterogene Gewebe des sekretorischen Epithels in Drüsenacini durch fibromuskuläre Stroma in erster Linie aus der glatten Muskulatur 1 komponiert umgeben angeordnet sind. Basalzellen, sekretorischen Zellen, neuroendokrinen Zellen, Transit Verstärken und Stammzellen 2: Die Epithelzellen Fach besteht aus fünf verschiedenen, aber organisierter Zelltypen besteht. Bei Prostatakrebs (PCa), die sich von den luminalen Epithelzellen entsteht, das Wachstum des Adenokarzinoms bewirkt eine evident allmählichen Rückgang des Stroma 3. Aus diesen Gründen werden Gewebeproben deutliche Unterschiede im Verhältnis von stromalen und epithelialen Zelltyp auf der Basis des Ausmaß der PCa haben. Diese Unterschiede können zu Verzerrungen der Annahmen der Genexpressionsdaten von ganzen Geweben ungeachtet Mikrodissektion der gewünschten Zelltyp gewonnen führen. Daher ist es wichtig, diese Vorspannung zu entfernen, um Zelltypen vor der RNA-Extraktion und TrennungGenexpressionsanalyse.
Macrodissection oder Mikrodissektion verwendet werden, um physisch zu trennen gut charakterisierten epithelialen Bereichen von der umgebenden Stroma 4 -6 werden. Macrodissection wird typischerweise mit einer Rasierklinge unter einem Präpariermikroskop gemacht und funktioniert gut zum Trennen großer PCa Knötchen vom Stroma, aber ist nicht fähig zur Entfernung von gutartigen Epithel von umgebenden Stroma (siehe Beispiel benigner Prostata Histologie in Abbildung 1). Mikrodissektion mit einem Laser (LCM) wesentlich arbeitsintensiver als macrodissection, aber sehr genau sezieren gutartige Epithel 4.
Aktuelle Veröffentlichungen aus unserem Labor haben gezeigt, dass RNA erfolgreich durch LCM entweder aus Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsien oder gefrorenen Gewebe 4,7-9 extrahiert werden. Die großen Herausforderungen in LCM-RNA-Extraktion sind 1), genau zu sezieren die gewünschten Bereiche des Gewebes, und 2) zur Erhaltung RNA Integrität während des LCM und Isolierungsverfahren 4,10. RNA aus reinen Zellpopulationen isoliert können zur Genexpressionsanalyse durch mehrere Verfahren einschließlich Reverse-Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) 7,8 Microarray 11 und tiefe -sequencing 12-14 verwendet werden.
Ziel dieses Protokolls ist es, Gesamt-RNA aus LCM Prostataepithel aus gefrorenem Gewebe zu isolieren, für nachgeschaltete Genexpressionsanalysen.
Alle menschlichen Geweben für diese Experimente verwendet wurden, über ein Institutional Review Board genehmigten Protokoll und / oder Freistellung an der Universität von Illinois in Chicago erworben.
1. § frisch gefroren Prostate auf PEN-Rutsche und auf Geladene Glass Slide
2. Hämatoxylin und Eosin-Y (H & E) Stain zur histologischen Mark-up
Hinweis: Diese, wenn für das Gewebe auf der geladenen Objektträger und den Stift nicht Rahmen Rutsche für LCM.
3. Toluidinblaufärbung des PEN-Frame-Slides
Hinweis: Thwird am selben Tag wie der LCM durchgeführt. Verwenden depcH 2 O Wasser für alle Lösungen. Füllen Sie alle Schritte in RNase-free-Bereich. Alle coplins muss mit RNase-Dekontaminationslösung gereinigt werden.
4. Laser-Capture-Micro-Dissektion (LCM)
5. Gesamt RNA-Isolierung mit einem Filter-basierten Kit und Qualitätsanalyse
6. Genexpressionsanalyse
Hinweis: Gene Expression lange RNA-Spezies (wie mRNAs und lncRNAs) im Schritt 6.1 und kurze RNA-Spezies (wie miRNAs) gezeigt in Schritt 6.2. Verschiedene Kits sind für die RT-qPCR zur Verfügung und die Menge der RNA erforderlich variiert je nach Kit (so wenig wie 10 ng). RNA-Sequenzierung Analyse ist in 6.3 beschrieben.
In einer früheren Studie haben wir gezeigt, die Verwendung von LCM zu epithelialen und stromalen Gewebe zu sammeln, um Expression Profiling durch RT-qPCR von mRNA und microRNA aus gefrorenen und FFPE Prostatagewebe des gleichen Patienten 4 zu vergleichen. LCM ist zeitaufwendig, vor allem, wenn große Menge an RNA ist für die nächste Generation Sequenzierungsanalyse gesammelt werden. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um den Arbeitsraum zu halten und Tools kostenlos RNase. Es wird empfohlen, um die Qualität und Zellspezifität Kontrollen in der gesammelten (detaillierter diskutiert im nächsten Absatz) RNA zu untersuchen. 1 zeigt eine angefärbt Prostataabschnitt auf einer PEN-Rahmenträger unter dem Mikroskop vor und nach der Laseraufnahme gutartige Epithel .
Sobald die Probe gesammelt, und die RNA wird sorgfältig extrahiert, ist es wichtig, RNA qualitativ und quantitativ zu bewerten, wie in Tabelle 1 gezeigt. Es ist nicht ungewöhnlich niedrige 260/280 nm Verhältnisse zu beachten. Konzentration der RNA wirdVerbesserung der 260/280 nm Verhältnisse, aber es kann auch den Verlust von kleinen RNA-Spezies zu verursachen. Zusätzlich zur Qualitätskontrolle ist es wichtig, um Zelltyp-spezifische Kontrollen zu untersuchen, um die Spezifität des Laser-Aufnahmebereich des Gewebes (1B - C) zu bestätigen. Beispielsweise in Figur 1B die Expression AMACR Gen wurde gemessen, um Prostatakrebs Epithelgewebe Vergleich zu normalen Epithelgewebe bestätigen ,. In 1C die Expression NKX3.1 bestätigte die Abwesenheit von Stromazellen in dem LCM-Probe gesammelt. Die Qualität der RNA in der Probe kann auch auf RNA bekannter, guter Qualität RNA compareed werden. RT-qPCR Ct-Werte für die RNAs von LCM-collected- Gewebe isoliert sind in der gleichen Größenordnung wie RNA aus kultivierten primären Epithelzellen gesammelt und bestätigte Qualität der langen und kleinen RNA extrahiert (Tabelle 2). Schließlich zeigt die Tabelle 3, daß diese RNA von ausreichender Qualität für die nächste Generation RNA sequencing.
Abbildung 1: Sammlung von gutartigen Epithel, Prostatakrebs Epithel und Stroma von menschlichen Prostata durch Laser-Capture-Mikrodissektion (A) Prostatabiopsie mit Toluidinblau gefärbt vor und nach der LCM-Sammlung des gutartige Epithel.. (B - C) Gewebe durch LCM von 45 Patienten gesammelt auszudrücken entsprechende Gen-Marker von Zellidentität 7. (B) AMACR ist ein Marker für Prostata-Krebs und ist nur in Krebsgewebe nachweisbar. (C) NKX3.1 ist ein Marker für Epithel und ist nicht in Stromagewebe nachweisbar. Diese Zahl wird von Giangreco et al., 2015 JSBMB 7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1: RNA Qualität und Quantität von LCM-gesammelt Prostatagewebe.
Tabelle 2: RT-qPCR von LCM gesammelt Prostate gutartige Epithel.
Tabelle 3: RNAseq von LCM-gesammelt Prostatagewebe.
Genexpressionsprofile von Humanproben kann eine Herausforderung sein, nicht nur für die Qualität oder Quantität von Gewebe zur Verfügung, sondern auch für die verschiedenen histologischen in einem bestimmten Gewebeprobe vorhanden Entitäten. Dies ist eine besondere Herausforderung in der Prostata, in der gutartigen Gewebe sind weitgehend stromalen Geweben und Bereichen Krebs frei von Stroma. LCM ermöglicht physikalische Trennung Prostatastroma und Epithel-RNA für eine genauere Signatur der zwei verschiedenen Zelltypen (1A). Im Vergleich zu macrodissection oder ganze Gewebeverarbeitung kann LCM Zellkompartimente bei gutartigen Gewebe zu trennen, ist aber deutlich teurer und arbeitsintensiv.
Wie in jeder Technik gibt es mögliche Fallstricke. Zum Beispiel kann RNA-Qualität während der anfänglichen Probenbeschaffung oder bei der LCM und Extraktionsverfahren teilweise abgebaut werden. Im ersten Fall kann die Genexpression erzielt Messung verschiedener Kurz ampl werdenIkonen von qPCR. Im zweiten Fall sollte gewissenhaft RNase freie Behandlung aller Tools und Unterlagen getroffen werden, um RNA-Abbau sowie eine sorgfältige Handhabung und Verarbeitung der Gewebeschnitte zu verhindern. Darüber hinaus die Begrenzung der Zeit auf einer Folie ausgegeben, um weniger als 90 min hält RNA-Qualität während des Sammelprozesses. Die größte Einschränkung des LCM-Technik ist der Zugriff auf ein LCM Norm und die Arbeit, die die LCM zu tun.
Es gibt verschiedene Arten von Laser-Mikrodissektion Mikroskope erhältlich. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines LCM, die den Laser verwendet, um die Bereiche, die dann fällt in eine Auffangkappe unten zu umschreiben. Diese Art von LCM ist ideal für die Trennung von Epithel und Stroma in Prostatagewebe, die diskrete vielzelligen Bereichen vorsieht, um zu sammeln, aber diese Art von LCM ist nicht geeignet für die Isolation einzelner Zellen aus einem einzelnen Gewebe. Zum Beispiel sollte dieses Protokoll nicht für die ansässige Makrophagen sammelns, neuroendokrinen Zellen oder infiltrierenden Lymphozyten, die oft als Einzelzellen vorliegen. Es gibt andere LCM Instrumente und Methoden, die einen Laser zu verwenden, um einzelne Zellen aus dem Gewebe "schießen" auf eine Membran Kappe, die Isolierung dieser anderen Zelltypen ermöglicht.
Gründliche Qualitätskontrolle und Charakterisierung der RNA kann nicht übersehen werden. Absorption bei 260 nm ist geeignet, um RNA für die RT-qPCR-Studien (Tabelle 1) zu quantifizieren, aber für die RNA-Sequenzieren einer farbstoffbasierten Verfahren genauer quantifiziert die RNA. Ein weiteres wichtiges Thema in RT-qPCR-Analyse ist es, potenzielle Verzerrung von restlichen DNA-Kontamination zu vermeiden. Dies kann durch Verwendung von Primern, die Introns umspannen bewerkstelligt werden. Es besteht auch eine hohe Patienten Heterogenität Wirtschafterin Genexpression daher mehrerer Wirtschafterin Gene verwenden wird vorgeschlagen, und wir verwenden typischerweise drei, um fünf 4,7-9 (1B - C und Tabelle 2).
Die Wahl des Genexpressionsverfahren ist nicht nur auf die Menge der RNA gesammelt, sondern auch von der Art der Daten, die eine zu erfassen und zu vergleichen wünscht basiert. Regelmäßige RT-qPCR ist empfindlicher als Next-Generation-deep sequencing und erfordert eine relativ geringe Menge an RNA verkleinert und damit die LCM Verfahren Zeit 4. Next-Generation-RNA-Sequenzierung ist eine effektive Technik, um den Ausdruck sowohl für kurze und lange RNA-Spezies zu quantifizieren. Next-Generation-Sequenzierung ermöglicht auch Entdeckung neuartiger RNA-Spezies 13. Glücklicherweise sind die Kosten der nächsten Generation Sequenzierung ist rückläufig.
Zusammengefasst Dieses Protokoll ermöglicht die RNA-Isolierung von homogenen Populationen von Epithel- oder Stromazellen aus gefrorenen Prostatagewebe. Die RNA kann für zahlreiche nachgeschalteten Analysetechniken verwendet werden, um ein Werkzeug für eine genaue zelltypspezifische Genexpression in der gutartigen und erkrankten Prostata bereitzustellen. Diese Art von Daten trägt, um Wissen eind Verständnis davon, wie RNA-Expression unterscheidet sich in Krankheitspathologie.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
RNase-AWAY | MBP | 7005-11 | |
PEN-membrane 4.0 mm slides | Leica | 11600289 | |
Glass slides, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
Ethanol 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
DEPC (diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D-5758 | |
Cryostat | Leica | CM3050 | |
Coplins (Staining jar) | IHCWORLD | M900-12 | |
Coplins (Staining rack) | IHCWORLD | M905-12 | |
Aperio ScanScope | Aperio(Leica) | ScanScope® CS | |
Toluidine Blue | Fluka | 89640-5G | |
Laser Microdissection System | Leica | LMD7000 | |
0.5 ml Thin-walled Tubes for LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
RNAqueous®-Micro Total RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Brand |
NanoDrop | Thermo Scientific | ND-1000 | |
Qubit 2.0 Fluorometer | Life Technologies | Q32866 | Thermo Fisher Scientific Brand |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Universal cDNA Synthesis Kit II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Brand |
Hematoxylin stain | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
Eosin-Y | Richard Allan Scientific | 7111 |
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