Лазерная захвата микродиссекция человеческого эпителия простаты для анализа РНК

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

Предстательная железа является гетерогенным ткани состоят из секреторного эпителия расположены в железистой ацинусов окружении фиброзно-мышечной стромы, состоящей в основном из гладких мышц ^1. Эпителиальный отсек состоит из пяти разных, но организованных типов клеток: базальных клеток, клеток, секреции нейроэндокринных клеток, транзитные делящиеся клетки и стволовые клетки ^2. При раке предстательной железы (РПЖ), который возникает из просвета эпителиальных клеток, рост аденокарциномы вызывает очевидный прогрессирующее снижение стромальных купе ^3. По этим причинам, образцы ткани будет четкие различия в соотношении стромальных и эпителиальных клеток типа на основе степени РПЖ. Эти различия могут привести к необъективным предположений данных экспрессии генов, полученных из целых тканей без учета микродиссекции нужного типа клеток. Таким образом, чтобы удалить это смещение очень важно, чтобы отделить клеточные типы до экстракции РНК иАнализ экспрессии генов.

Macrodissection или микродиссекции могут быть использованы для физического отделения хорошо охарактеризованных эпителиальные области от окружающей стромы ^{4 -6.} Macrodissection обычно делается с лезвием под микроскопом рассекает и работает хорошо для разделения большого РПЖ узелки из стромы, но не способен удалять доброкачественные эпителий от окружающих стромы (см пример доброкачественной гистологии простаты на рисунке 1). Микродиссекция с помощью лазера (LCM) является значительно более трудоемким, чем macrodissection, но может очень точно анализировать доброкачественной эпителия ^4.

Последние публикации из нашей лаборатории показали, что РНК может быть успешно извлечены из LCM либо фиксированных формалином парафин (FFPE) биопсии или замороженной ткани ^4,7-9. Основные проблемы в добыче LCM-РНК являются: 1) точно анализировать нужные участки ткани, и 2), чтобы сохранить RЦелостность Н.А. во время LCM и изоляция технологического ^4,10. РНК, выделенной из клеток чистых популяций могут быть использованы для анализа экспрессии генов несколькими способами, включая обратной транскрипции количественной ПЦР ^{(RT-КПЦР)} 7,8, ^11, микрочипов и глубокой характерны чередования ^12-14.

Цель этого протокола заключается в изоляции общей РНК из LCM железы эпителия из замороженной ткани для выражения ниже по течению гена анализов.

Все ткани человека, используемые для этих экспериментов были приобретены через утвержденным протоколом Экспертный совет и / или освобождения в Университете штата Иллинойс в Чикаго.

1. Раздел Свежезамороженная простаты на ПЕН-слайд и на заряженных стекло

1. Накануне или за несколько часов до секционирования образца, чистые инструменты (например, кисти, пинцеты, coplins, лезвия, ручка-слайдов в (если уже не РНКазы), А.Н. этанола безопасно маркер и карандаш) и внутри RT криостат с РНКазы обеззараживания раствор, используя распылитель и лабораторного салфетки.
   1. Разрешить РНКазы обеззараживания решение сидеть в течение 5 мин, затем вытирая, промыть depcH ₂ 0, чтобы удалить оставшиеся РНКазы обеззараживания решение и окончательный промыть с 70% этанола (приготовленные depcH ₂ 0).
      Примечание: Очень важно, чтобы поддерживать РНКазы рабочее пространство. Все coplins, инструменты, замороженные монтажа средние, лезвия и горки, используемые должны быть использованы только для свободного работы РНКазыи никогда не используется в стандартной без РНКазы свободной среде. Все инструменты должны быть обработаны с дезактивации решения РНКазы перед каждым экспериментом.
2. Холодный криостата до -24 ° С.
3. Место следующие очищенные РНКазы инструментов внутри криостата для охлаждения, по меньшей мере за 30 мин до секционирования: слайд-Коплин заполнены 100% этанола, инструмент, небольших кассет замороженной ткани и монтажной патрона.
4. Получить замороженные ткани простаты от cryostorage и места в сухой лед-заполненные пеной ведро для транспортировки. Поместите ткань в криостат, чтобы уравновесить в КРИОСТАТ температуру, по крайней мере 30 мин.
   Примечание: Ткани человека простаты для лазерной захвата микро-рассечение может быть свежезамороженной или формалином фиксированной в парафин (FFPE). Временные ограничения и подготовка слайд немного отличаются между источниками ткани. Здесь мы опишем шаги, необходимые для замороженных срезов.
5. Работа с одной ткани, в то время, и наглец замороженные монтажную среду в Bottoм кассеты и быстро монтировать замороженные ткани простаты в замороженном монтажа среде с использованием охлажденной щипцы.
6. Поместите кассету с тканью на чиллер в криостат в течение 5 мин, чтобы установить замороженные монтажную среду.
7. Шприц небольшое количество замороженной монтажной среды на патрон и осторожно нажать установлен ткани нижнюю сторону вверх на замороженных монтажной среды. Пусть установлен в криостате в течение 5 мин, чтобы позволить замороженный монтажа от среднего до полного затвердевания.
8. Поместите патрон в держатель и затяните.
9. Блокировка ручку в запертом положении и поместите новое лезвие на криостата. Для последующих молекулярных конечных точек, которые включают стадии амплификации (т.е. КПЦР) целесообразно использовать новое лезвие для каждого пациента, чтобы предотвратить загрязнение (или переместить лезвие над использовать площадь лопасти для следующего образца).
10. Разблокировать ручку и осторожно продвигать ткань вручную или с помощью педали, чтобы выровнять и выставить ткани с 50 цм разделы нужной экспозиции ткани достигается.
11. Отрегулируйте криостат до 5 мкм, вырезать одну или две секции и разместить их на заряженной стекло для гематоксилином и эозином (Н & Е) окрашивания (см шаг 2).
12. Сразу же место скольжение в холодную 100% этаноле в течение 2 мин.
13. Извлеките заряженный предметное стекло из этанола и дайте ему высохнуть при комнатной температуре, прежде чем приступить к Н & Е окрашивания (шаг 2).
14. Поместите RT ПЕН-кадра слайд на раме кормильца.
15. Отрегулируйте криостат до 10 мкм разделов и место на раме слайдов РТ PEN. От одного до четырех разделов может быть места на каждом слайде в зависимости от размера ткани.
16. Сразу погрузить слайд в холодную 100% этаноле в течение 2 мин.
17. Снимите PEN-кадров слайды из этанола и не хранить слайд в слайд-поле в эксикаторе поле в -80 ° C морозильнике до готовности для LCM. Три дня это максимальное время хранения для оптимального восстановления РНК.
18. Перейдите на Шаг 2 для ТОЛЬКО взимается стекло скользнуле. Перейдите на Шаг 3 для PEN-кадра слайда.

2. гематоксилином и эозином-Y (Н & Е) для гистологического пятно наценка

Примечание: если для этой ткани на заряженную стекло и НЕ ПЕН-кадр слайд для LCM.

1. Гидрат секции на заряженном стекло погружением слайдов через градуированного этанола следующим образом: окунуть слайде два раза в 100% этаноле в течение 3 мин, два раза в 95% этаноле в течение 3 мин, один раз в 70% этаноле в течение 3 мин и два раз в дистиллированной _H 2 O в течение 3 мин.
   1. Подготовьте кислоты спиртовой раствор: 99 мл 70% этанола + 1 мл 1% HCl и 0,1% раствором бикарбоната натрия: 0,1 г бикарбоната натрия в 100 мл дистиллированной _H 2 O
2. Погрузите слайд в гематоксилин Gill II (0,4%) в течение 5 мин.
3. Смыть лишнюю пятно в устойчивом струей _H 2 O в течение 3 мин.
4. Погрузите слайд 10 раз в кислой алкоголя
5. Вымойте слайд в проточной _H 2 O в течение 3 мин.
6. Погрузите слайдв 0,1% раствором бикарбоната натрия в течение 30-60 сек, чтобы включить пурпурно синий цвет.
7. Вымойте слайд в проточной _H 2 O в течение 3 мин.
8. Промыть слайд в 95% этаноле с 10 провалов.
9. Погрузите слайд в эозином-Y 2-3 раза для общей 15 сек.
10. Дегидрировать слайд через этанола градуированной следующим образом: Погрузите слайд два раза в 95% этаноле, два раза в 100% этанола, и два раза в ксилоле (убедитесь, что ткань становится ясно, что указывает на полное обезвоживание).
11. Установите слайд с неводной постоянного жесткого монтажа среднего и крышкой скольжения.
12. Пусть слайд высохнуть в течение 30 мин.
13. Сканирование слайдов с любым всей слайд сканера и печати большого, изображения с высоким разрешением на 8 "х 11" бумаги.
14. Габаритные зон (как правило, осуществляется с помощью сертифицированных патологоанатом борту) с маркером. Эта разметка является руководство для процедуры LCM.

3. Толуидин Голубой Окрашивание ПЕН-каркасных Слайды

Примечание: Thявляется делается в тот же день в LCM. Используйте depcH _{2 O} воду для всех решений. Заполните все шаги в РНКазы свободной площади. Все coplins должны быть очищены от РНКазы очищающего раствора.

1. День LCM удалить ПЕН-кадров слайды из -80 ° C морозильника и гидрата по пологой горки в 90% этанола в течение 2 мин, затем 75% этанола в течение 2 мин.
   1. Подготовьте 0,5% толуидинового синий растворением в воде молекулярного биологии класса, то фильтр стерилизовать через фильтр и хранят 0,2 мкм при комнатной температуре. Этот раствор может быть повторно использован в течение 6 месяцев. Примечание: Настоятельно рекомендуется подготовить решение до, как фильтрация может занять несколько ч.
2. Пятно ткани простаты пологие горки в 0,5% толуидиновым синим в течение 5-30 сек. Destain ткани путем промывки слайды 2 раза в depcH _{2 O} в течение 15 сек с последующим 75% этанола в течение 30 сек до 3 мин. Примечание: пятно и destain раз можно регулировать, чтобы обеспечить хорошую окрашивание. Простаты, как правило, в течение пятно.
Перевести ПЕН-кадров слайды РНКазы свободной сухой контейнер на льду.

4. Лазерная захвата микро-рассечение (LCM)

1. Непосредственно перед LCM, сухой слайд на слайде теплее при 42 ° С в течение 15 мин. Сухая только слайд, который будет обработан и не храните отдых на льду, пока к ним готовы.
2. Включите компьютер и LCM в указанном порядке, силового микроскопа, ключ лазерного, лазерной переключателя, а затем компьютер. Запустите программу Лазерная микродиссекции.
3. Используйте программное обеспечение для управления микроскопом, чтобы загрузить слайды и сбора трубы. Нажмите на "держатель образца выгрузки", загрузите слайд с секциях на держатель слайдов микроскопа с тканью вниз и вставьте держатель слайдов в соответствующий слот в микроскоп, то нажмите кнопку "Продолжить".
   1. Нажмите на кнопку "пробирок выгрузки", этикетки и нагрузка 0,5 мл трубки на держатель трубки и вставьте его в соответствующее гнездо в приборе. однаждыколпачки закреплены, добавить 35 мкл буфера для лизиса на шапки сбора и попытаться избежать пузырей. Затем нажмите кнопку "OK".
      Примечание: Если испарение вопрос, разбавить буфер следующим образом: 25 мкл буфера для лизиса с 10 мкл depcH2O.
4. В программном обеспечении, выберите позицию, где слайд был помещен в держатель слайдов. Выберите сбора крышку, чтобы собирать LCM образца.
5. Визуализировать и сосредоточиться слайд через компьютер на 10X. Используйте программное обеспечение для калибровки лазера, выбрав "Laser", а затем "калибровки". Отрегулируйте мощность, диафрагму и лазера, выбрав "лазерный", а затем "Управление", чтобы лазерный луч, чтобы сократить площадь выбранного полностью и эффективно. Повторите регулировку до тех пор, лазерных сокращений полностью через ткань.
6. Использование 8 "х 11" патологоанатома наценка в качестве руководства, используйте "нарисовать форму" инструмент для ограничить желаемых областей epitheлиево в целях сбора и избежать любой стромы.
   Примечание: Несколько районов могут быть выбраны в течение одного зрения, но не перейти к другой точке зрения, не первый резки, нажав кнопку "вырезать форму" инструмент.
   1. Если область не получает полностью отрезаны лазером использовать "двигаться и сократить" инструмент, чтобы пойти на него вручную. Продолжать движение цели к новым видом и повторить лазерную резку, пока слайд не будет полностью рассеченные или желаемое количество ткани была собрана (типично 100 доброкачественные желез дают 150-500 нг РНК). (см пример на рисунке 1А).
7. Осторожно снимите трубки из держателя сбора и закрыть крышки, памятуя о буфере для лизиса и ткани в шапках. Кратко центрифуги в течение 30 сек, чтобы собрать жидкость и ткани в нижней части трубы. Инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 30 мин и хранят при -80 ° С до готовности для выделения РНК.

5. Общая Выделение РНК с Filтер на основе набора и анализа качества

1. Оттаять пробирки на лед, и довести объем раствора до 100 мкл.
2. Предварительно смочите микро фильтр комплекта изоляции РНК, применяя 30 мкл ofLysis решение к центру фильтра и дайте ему впитаться whileperforming следующие два шага (по крайней мере, 5 мин).
3. Добавить 3 мкл раствора LCM добавки (входящую в комплект поставки) к лизата и смешать встряхиванием в течение 5 сек. Центрифуга в течение 30 сек, чтобы собрать жидкость на дне пробирки.
4. Центрифуга предварительно смачивают фильтр для ~ 30 сек при максимальной скорости, чтобы удалить жидкость.
5. Добавить 1,25 объемов (в данном случае 129 мкл) 100% этанола в смеси лизата, осторожно вихрь или пипетки вверх и вниз. ** Этот метод восстановления больших и малых видов РНК.
6. Загрузить образец на предварительно смоченный микрофильтр и центрифуге при 10000 х г в течение 1 мин, чтобы связать РНК к фильтру. Затем промыть фильтр микро 180 мкл "промывочного раствора 1, R21; центрифуги при 10000 мкг в течение 1 мин.
   Примечание: С этого момента все центрифугирования должно быть сделано при 13000 мкг, или максимальной скорости.
7. Вымойте фильтр дважды 180 мкл "решений мытья 2 и 3", соответственно, как указано в протоколе набора. Центрифуга в течение 30 сек, затем выбросить поток через, и спин фильтр в течение 1 мин для удаления остатков жидкости и высушить фильтр.
8. Передача фильтр к новой пробирку.
9. Теплый элюирование решение до -95 ° С (входит в комплект).
10. Применение 10 мкл предварительно нагретую элюции раствора к центру фильтра, закрыть крышку и хранить в течение 5 мин при комнатной температуре. Тогда центрифуги в течение 1 мин, чтобы элюировать РНК, и повторить этот шаг один раз, чтобы получить ~ 20 мкл РНК.
11. Выполнение обработки ДНКазой I в течение 15 мин при 37 ° С.
12. Количественная РНК спектрофотометр с оптической плотности при 260 нм. Отношение оптической плотности при длине волны 260 нм и 280 нм используется для оценки чистотыРНК (табл 1) ^15.

6. Анализ экспрессии генов

Примечание: экспрессии генов длинных видов РНК (мРНК и, как lncRNAs) показано в шаге 6.1 и коротких видов РНК (как микроРНК) показано в шаге 6.2. Различные наборы для RT-количественной ПЦР и количество РНК, необходимой варьируется в зависимости от комплекта (всего 10 нг). Анализ РНК последовательности описан в 6.3.

1. Обратный Расшифруйте (RT) РНК в кДНК смешивания 5 мкл 20 нг / мкл образца РНК с 5 мкл смеси мастер-RT (RT буфера, дНТФ случайных праймеров, RT фермента, ингибитора РНКазы). Инкубируют реакционную смесь в течение 25 мин при 25 ° С, затем 120 мин при 37 ° С и 5 минут при 85 ° С.
2. Развести реакции RT 1:10 РНКазы свободной воды и использовать 2,5 мкл за 10 мкл реакции КПЦР с праймерами или праймер / зонд наборы для интересующих генов.
   Примечание: Для облегчения анализа частично деградированных РНК Желательно использовать праймеры FOR короче ампликонов (менее 100 п.о.) ^16. (Таблица 2B)
   1. Для анализа экспрессии микроРНК проведение реакции RT путем смешивания 5 мкл 2-10 нг / мкл образца РНК с 5 мкл смеси мастер-RT.
      Примечание: каждый коммерчески доступный ПЦР-технологии обнаружения микроРНК требует использования собственных и специфических праймеров RT.
3. В качестве альтернативы или в дополнение к RT-PCR, используют следующего поколения последовательности (РНК-SEQ или малые РНК-SEQ) количественно различных видов РНК. Как правило, используют 500 нг РНК для этой процедуры (Таблица 3) и осуществления способа, как указано изготовителем и обнаружения инструмента.

В предыдущем исследовании мы показали, использование LCM собирать эпителиальные и стромальные ткани, чтобы сравнить выражение профилирования РТ-КПЦР мРНК и микроРНК из замороженных тканей и FFPE простаты от того же пациента ^4. LCM является трудоемким, особенно если большое количество РНК должны быть собраны для анализа секвенирования следующего поколения. Поэтому, очень важно, чтобы рабочее пространство и инструменты РНКазы. Рекомендуется изучить качества и клеточно-специфичности управления в РНК, собранных (более подробно в следующем параграфе). На рисунке 1 показана окрашенных раздел простаты на PEN-кадра слайда под микроскопом до и после лазерного захвата доброкачественной эпителия ,

После того, как образец собирали и РНК экстрагировали тщательно, важно, чтобы оценить качество и количество РНК, как показано в таблице 1. Это не редкость, чтобы наблюдать низкие коэффициенты 260/280 нм. Концентрация РНК будетулучшить отношения нм 260/280, но он также может привести к потере мелких видов РНК. В дополнение к контролю качества, важно, чтобы изучить управления типоспецифические клеток для подтверждения специфичности лазерного захватили области ткани (рис 1B - С). Например, на фиг.1В выражение гена AMACR измеряли для подтверждения рака простаты эпителиальной ткани по сравнению с нормальным эпителиальной ткани ,. На рисунке 1С выражение NKX3.1 подтвердили отсутствие стромы в LCM-собраны пробы. Качество РНК в образце может быть также compareed РНК известного, хорошего качества РНК. Значения РТ-КПЦР Ct для РНК, выделенных из LCM-collected- ткани находятся в том же диапазоне, что и РНК, собирали из культуры первичных эпителиальных клеток, что подтверждает качество длинной и малой РНК, выделенной (таблица 2). Наконец, Таблица 3 показывает, что эта РНК обладает достаточным качеством для следующего поколения РНК sequenciнг.

Рисунок 1: Сбор доброкачественной эпителия, рака предстательной железы эпителия и стромы с человека простаты с помощью лазера захвата микро-рассечение биопсия (А) предстательной железы окрашивали толуидиновым синим до и после LCM-коллекции доброкачественной эпителия.. (В - С) Ткани, собранные LCM от 45 пациентов выразить соответствующие генных маркеров клеточной идентичности ^7. (Б) AMACR является маркером рака предстательной железы и только обнаружен в раковых тканей. (С) NKX3.1 является маркером эпителия и не обнаруживается в стромальных клеток. Эта цифра изменяется от Giangreco и др., 2015 JSBMB ^7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1: качество и количество РНК из LCM собранные ткани предстательной железы.

Таблица 2: RT-КПЦР из LCM собраны доброкачественной эпителия.

Таблица 3: RNAseq из LCM-собирали ткани простаты.

Экспрессия генов профилирования из человеческих образцов может быть сложным, не только для качества или количества ткани доступной, но и для различных гистологических лиц, присутствующих в данной ткани образца. Это особенно сложно в простате, в котором доброкачественные ткани в значительной степени из жировой ткани и области рака лишены стромы. LCM облегчает физическое разделение железы стромы и эпителия РНК для более точного подписью двух различных типов клеток (Фигура 1А). По сравнению с macrodissection или всей обработки ткани, LCM можно разделить сотовых отсеков доброкачественных тканей, но является значительно более дорогостоящим и трудоемким.

Как и в любой технике есть возможные подводные камни. Например, качество РНК может быть частично деградировали во время первоначальной закупки образца или во время процедуры LCM и экстракции. В первом случае, экспрессия гена может быть достигнуто измерением другой короткий Amplиконы кПЦР. Во втором случае, скрупулезно РНКазы лечение всех инструментов и материалов должны быть приняты меры для предотвращения деградации РНК, а также осторожного обращения и обработку срезов. Кроме того, сокращения времени, затрачиваемого на одном слайде менее 90 мин поддерживает качество РНК в процессе сбора. Самое большое ограничение техники LCM является доступ к LCM инструмент и трудоемкость сделать НОК.

Есть несколько типов лазерного захвата микродиссекции микроскопов доступны. Этот протокол описывает использование LCM, который использует лазер для ограничить области, которые затем падает и коллекции крышкой ниже. Этот тип LCM идеально подходит для разделения эпителия и стромы в ткани предстательной железы, который содержит дискретные области многоклеточные собирать, но этот тип LCM не подходит для изоляции отдельных индивидуальных клеток из ткани. Например, этот протокол не должны быть использованы для сбора резидента макрофаговс, нейроэндокринные клетки или проникают лимфоциты, которые часто присутствуют в виде отдельных клеток. Есть другие LCM инструменты и методы, которые используют лазер для "стрелять" отдельные клетки из ткани на мембранный колпачок, который облегчает выделение этих других типов клеток.

Тщательный контроль качества и характеристика РНК не могут быть пропущены. Поглощение при 260 нм подходит для количественного РНК для исследований РТ-КПЦР (таблица 1), но для РНК-секвенирование методом красителя на основе более точно количественно РНК. Еще один важный вопрос при анализе RT-КПЦР, чтобы избежать потенциального смещения из остаточного загрязнения ДНК. Это может быть достигнуто с использованием праймеров, которые охватывают интроны. Существует также высокой гетерогенности пациента в экспрессии генов уборка, поэтому использование нескольких генов КЛЮЧНИЦА Предложена и мы обычно используем 4:57 ^4,7-9 (Фигура 1В - С и Таблица 2).

Выбор метода профилирования экспрессии генов не только на основе количества РНК, собранных, но и от вида данных, что один желает приобрести и сравнить. Регулярное RT-КПЦР более чувствителен, чем следующего поколения глубокого секвенирования, и требует относительно небольшого количества РНК таким образом уменьшая время процедуры LCM ^4. Следующее поколение РНК последовательности является эффективным методом для количественного выражения как для коротких и длинных видов РНК. Следующее поколение Секвенирование также позволяет открытие новых видов РНК ^13. К счастью, стоимость следующего поколения секвенирования снижается.

В целом, этот протокол позволяет изоляции РНК однородных популяций эпителиальных или стромальных клеток из замороженной ткани предстательной железы. РНК может быть использован для многочисленных методов анализа вниз по течению, чтобы предоставить инструмент для конкретного типа экспрессии гена точен клеток в больной доброкачественной и простаты. Этот тип данных способствует знанийд понимание того, как выражение РНК отличается патологии болезни.

The authors have nothing to disclose.

We thank Dr. Vicky Macias, Angeline Giangreco and Avani Vaishnav for assistance with optimizing this methodology over the years and Yang Zhang and Dr. Jian Ma at the University of Illinois at Urbana-Champaign for the RNA seq analysis. This work was supported by NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) and a Prevent Cancer Foundation grant (Zhou).