Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Barrett Özofagus moleküler sürücüleri geliştirilmiş bilgi için fark edilebilir bir ihtiyaç vardır. Immunofluorescent boyama hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerini anlamak için yararlı bir tekniktir. Biz, Barrett yemek borusu hücrelerinde terapötik tedavi değerlendirmek için immünofloresan boyama kullanımı için basit ve etkin bir protokol sunmaktır.

Özofagus adenokarsinom (EAC) genel sağkalım az% 17 oranı ve EAC sıklığı son iki yılda önemli ölçüde arttı vardır. EAC primer risk faktörlerinin biri Barrett yemek borusu (BE), kronik mide ekşimesi tepki olarak normal yemek borusunun skuamoz bir metaplastik değişimdir. EAC arasındaki köklü bağlantı rağmen, moleküler olayların ilerlemesini içeren özellikle değiştirilmiş sinyal yollarının sorgulama EAC anlaşılamamıştır BE. Bu büyük ölçüde bu hastalıkların incelemek için uygun in vitro modellerde uygun eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri BE arasında, in vitro çalışmalar için izin ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir. Burada, tedavi edici bileşiklere maruz kaldıktan sonra hücre sinyal ve yapısının in vitro karakterizasyonu sağlayan, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin immünofloresan boyama için bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklerin uygulanması hel doyurmayap EAC ilerlemesine BE katılan mekanizmalar içgörü geliştirmek ve tedavi ve EAC önlenmesi için potansiyel yollar sağlamaktadır.

Barrett yemek borusu (BE) özofagus yassı epitel, normal ve gastroözofageal reflü hastalığı (GERD) ¹ kaynaklanan mide içeriklerine kronik maruz kalmanın bir sonucu olarak bir metaplastik değişimdir. BE GÖRH karşılık olarak bir koruyucu mekanizma olduğu düşünülmektedir, bununla birlikte BE varlığı özofagus adenokarsinomu (EAC), belirgin bir şekilde düşük hayatta kalma ¹ taşıyan bir hastalığın artan riski verir. Şu anki tahminler Amerikan nüfusunun kadar 5.6% BE olduğunu göstermektedir BE genellikle asemptomatik olduğu gibi, ancak BE çoğunluğu ² tanı konulmamış düşünülmektedir. GÖRH ve EAC hem de görülme oranları sürekli büyüme ³ Görüldüğü gibi, bu bilgilerin potansiyel EAC BE ilerlemesini önlemeye yönelik tedavi yaklaşımları sağlayabilir özellikle, EAC BE ilerlemesinde rol oynayan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir hale gelmiştir.

Hasta yönelik çalışmalar, BE-EAC patogenezi ¹ mevcut paradigması ile sonuçlanmıştır. Kronik inflamasyon, yaralanma ve mide içeriğinin uzun süre maruz kalma sonucu genotoksik hasar EAC neoplastik ilerlemesini teşvik BE lezyon seçici baskı. Genetik değişikliklerin bir dizi sırasında EAC ilerlemesi ile, BE tespit edilmiştir. Ancak, buna rağmen hücre sinyal kesin değişiklikler ve hücre yapısı ve işlevi üzerine daha sonraki etkileri konusunda anlayış farklı olmaması.

Özellikle hedeflenen terapötik bileşiklerin etkisini araştıran, hücre sinyal etkilerini incelemek için yararlı araçlar vitro hücre çizgileri bulunmaktadır ölümsüzleştirilmiş. Immortalized hücre çizgilerinin son ticari durumuna bu gibi çalışmalar için izin verir. Gibi yaygın olarak kullanılan canlılığı tahlilleri gibi yüksek verimlilik gösteren deneyler, hücre çoğalması ve su üzerine hedefli tedavilerin etkisini değerlendirmek değerli olmasına rağmenrvival ^4-6, bu deneyler, hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerinin araştırılması için yararlı değildir. Immünofloresan boyama (IF) hücrelerin morfolojik, büyüme ve hayatta kalma özellikleri ve söz konusu proteinler üzerine hedefli tedavilerin etkilerinin araştırılması için bir yararlı bir tekniktir. Bizim laboratuvar ilaç tedavisi ⁷ için olası bir kemopreventif tedavi ve biyogöstergesini çizen umuduyla BE hücre hatları üzerine bir klinik mevcut ilacın etkilerini değerlendirmek için EĞER kullanarak, ölümsüzleştirdi BE hücre hatlarına doğru bu yöntemleri benimsemiştir. Benzer şekilde, EAC bu tekniklerin uygulanması, BE ve ölümsüzleştirdi özofagus hücre hatları EAC ilerlemesi ^8-10 BE ile ilgili kritik bulgular tanımlamıştır. Hedeflenmiş tedaviler ile tedavi edilebilir hücrelerin analizi hücre yapısı ve protein yerelleştirme değişiklikleri karakterizasyonu için izin değeri vardır IF buluruz. Burada, bizim yöntemler sunmak IF c ölümsüzleştirilmemiş BE hücrelerinilaç tedavisi haracterize.

1.. Hücre Hattı Bakım

1. Ölümsüzleştirilmiş insan transkriptaz (TERT) proteini ¹¹ ters İnsan telomeraz kararlı transfeksiyonu ile yüksek dereceli displazi (CP-B, CP-C, CP-D) ve metaplastik (CP-A) hücre çizgileri BE.
2. Bakım hücre sığır hipofiz özütü (BPE), epidermal büyüme faktörü (EGF),% 5 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), penisilin-streptomisin-neomycin (PSN) ile takviye edilmiş ortam içinde keratinosit hatları, standart BE Doku kültürü koşulları (37 ° C,% 5 _CO2,% 98 nem).

2.. Hücre Kaplama BE

1. 12 çukurlu levha / lamelleri hazırlanması. Cam bir Petri tabağına ve otoklav içine 18 mm lamelleri yerleştirin. Transfer vakum tüpüne bağlanmış bir steril cam pipet kullanılarak 12 çukurlu doku kültürü kabına 18 mm cam lamelleri otoklavda muamele edildi. Steril PBS ve medya ile lamel yıkayın.
2. Trypsinize ve ölümsüzleştirdi BE hücreleri saymak. Hücreleri USI saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da bir hemasitometre ng. 20,000-40,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar kültür ortamı hücreleri seyreltin.
3. Her bir 20,000-40,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam hücre sayımı için bir lamel içeren içine hücre 1 ml yerleştirin.
4. Yavaşça hücreler lamel takmak sağlamak için kuyunun dibine lamel itmek için steril bir pipet kullanın.

BE Hücreler 3. İlaç Tedavisi

1. Istenen konsantrasyona ılık (37 ° C) ortam maddesi içinde seçilmiş ilaç seyreltin ve tekrar tekrar tüp tersine çevrilmesi ya da bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak iyice karıştırın. Ampirik olarak belirlenir ilaç konsantrasyonları. Lamel üzerine hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere, BE hücrelerin ilk tohumlama aşağıdaki tedavi 24 saat başlayın
2. Karşılaştırma ve kontrolü için, kültür ortamı içinde seyreltilmiş,% 0.1 araç (dimetil sülfoksit [DMSO] veya bileşik madde çözündürülmesi için kullanılır) ile BE hücrelerinin ek bir lamel tedavi. Ilacı tanımlamak ve A.Ş. için bir laboratuar kalem ile etiket plakasıbulunulması örnekleri tedavi. 37 ° C,% 5 _CO2,% 98 neme ayarlanmış bir hücre kültür inkübatörü içine koyun hücreleri ve istenen zaman noktaları için inkübe edilir.

4. Immunofluorescent Boyama

1. Tespit
   1. İlaç tedavisinin İstenilen kuluçka süresinden sonra, ortam aspire ve oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) 'de 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın.
   2. PBS aspire ve her kuyuya% 4 PFA [% 4 PFA / PBS] ihtiva eden 1 ml PBS ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   3. % 4 PFA / PBS aspire ve oda sıcaklığında PBS ile lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkayın. Arzu edildiği takdirde, 4 ° C 'de PBS/0.1% PFA bir hafta deposu lamelleri.
2. Permeabilization / Engelleme
   Antikor, hücre içi hedefleri erişmesine izin vermek için sabit PFA permeabilize hücrelerin. Dışı proteinleri yüzüne için, 1x PBS/0.5% BSA çözeltisi ilave saponin olmadan sonraki tüm adımları uygulayın.
   1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde seyreltilmiş 50 mM _NH4CI ile inkübe edilerek arka plan azaltmak ve 5 dakika için bir kere RT PBS ile yıkayın.
   2. % 0.1 saponin ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden PBS içinde, 100-300 ul içinde 30 dakika boyunca BE hücreleri inkübe edin. , Filtre ile sterilize edilmiş% 10 stok saponin seyreltik su içinde hazırlanır ve 4 ° C'de saklandı
   Not: Bu,% 0.5 BSA ilave nedeniyle lamelleri engelleyerek hücre proteinlere antikorların spesifik olmayan bağlanma önler. Seçenek olarak ise, antikor spesifik olmayan bağlanmaların azaltmak için% 5 oranında seyreltilmiş keçi serumu ile BSA yerine.
3. İnsan Odası hazırlanması
   1. Islak kağıt havlu ile odasının alt katman tarafından bir kare biyodeney tabak hazırlayın ve üstüne Parafilm bir katman yer.
   2. Yavaşça forseps ve bir şırınga iğnesi kullanarak Parafilm üzerine yukarı bakacak lamelleri, hücreleri aktarmak.
   3. Lamelleri belirlemek için bir laboratuvar kalem ile Parafilm işaretleyin.
4. Primer antikor inkübasyon
   1. % 0.5 BSA ve% 0.1 saponin her ikisini ihtiva eden PBS birincil antikor seyreltin.
   2. Hafifçe laboratuvar doku ile bloke solüsyonu kapalı leke ve primer antikor çözeltisi 100 ul ilave edin. 4 ° C de bir gece BE hücreleri üzerinde birincil antikor inkübe
5. İkincil antikor Kuluçka
   1. Slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika her biri için PBS/0.5% BSA/0.1% saponin ile 3x yıkayın.
   2. İkincil antikor, birinci antikor, yükseltilmiş edildiği türlerin tanıdığı PBS/0.5% BSA/0.1% saponin bir floresan etiket ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile seyreltilir.
   3. Her bir lamel seyreltilmiş antikor, 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikor inkübe edin.
6. Yıkama ve Lameller arasında montajı
   1. PBS/0.5% BSA/0.1% saponin içinde lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkanır. Yıkama tamponu çıkarın ve lamelleri PBS 100-300 ul ekleyin.
      NOT: Çift karşıtı İçinVücut boyama, tekrar tartışmada belirtilen bilgilere göre istenen ek primer ve sekonder antikor ile 4,4-4,5 adımları tekrarlayın.
   2. Forseps kullanarak, hafifçe lamel yukarı kaldırın ve bir laboratuvar doku veya kağıt havlu kullanarak PBS kapalı kurulayın.
   3. Bir cam mikroskop lamı üzerine, hücreler aşağı lamel 4 içeren uygun bir anti-solmaya montaj medya ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 15 ul ekleyin ve lamel ters.
   4. Bir slayt klasörünün içine slaytlar yerleştirin ve sert ayarlanmış anti-solmaya orta tedavisi için izin oda sıcaklığında gece boyunca direkt ışıktan kuluçkaya, üreticinin talimatlarına göre. , Anti-solma ve orta set edildikten sonra, mikroskopik slaytlar kadar 4 ° C ya da -20 ° C ya da saklanabilir.

Lameller 5. Mikroskobik Görselleştirme

Lekeli hücreler konfokal mikroskopi veya ikisinden biri aracılığıyla görüntülü olabilir EĞER yetenekli dik mikroskope. Konfokal mikroskopi ayrık derinliklerde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar rağmen, dik bir mikroskobik hızlı kullanışlı görüntü üretme yeteneğine sahiptir. Kısaca ifade etmek için, bir görüntüleme yöntemi standart sundu mikroskobu kullanılarak hücreler boyandı. Genel olarak, görüntü flöresin izotiyosiyanat (FITC) veya benzeri bir florofor (yani, yeşil floresan protein) için, Texas Red ve DAPI, bu florofor ayırt edebilen filtresi olan bir mikroskop gerektirir. Uyumlu florosforlar belirlemek için protokol başlamadan önce mikroskop edin.

1. Standart IF Mikroskop üzerinde görüntüleme
   1. -20 ° C ya da 4 ° C'de saklanan slaytlar / lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Mikroskop ve cıva ark lambası güç.
   2. Lamel mikroskop sahneye amaca dönük ile mikroskop lamı yerleştirin. Bir yağ batırma objektifi kullanımıyla ilgili olarak, bir örtücü camın üzerine immersiyon bir damla ekleyin.
   3. DAPI filtreyi seçin ve kapağını açın.
   4. Görüntü görünene kadar okülerler bakarken hedefi odaklanın. Bütün hücreler DAPI ile leke olacaktır yana, çekirdekleri kolayca gözlemlenebilir olmalıdır.
   5. Ilgili görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri toplayın.

Tarif edilen prosedürlerin uygulanması ile elde edilen sonuçların bir örneği, Şekil 1A-D 'de gösterilmiştir. CP-D ve CP-C BE hücreleri ile Lameller Src ailesi inhibitörü, SKI-606, ya da araç (DMSO) içinde 1 uM ile 24 saat boyunca muamele edilir ve protein, β sinyal adherens Kavşak ve Wnt için yukarıda belirtilen prosedürler kullanılarak boyandı P-katenin. Hücre çekirdeğinin etiketleme DAPI (mavi) ile etiketleme ile gerçekleştirilir ise β-katenin görselleştirilmesi, yeşil bir flüorofor bağlanmış bir anti-tavşan IgG 'si ile etiketleme ile elde edilmiştir. Lameller sert montaj seti ve hücreler bir 63X/1.4N planı-apochromat objektif kullanarak lazer tarama konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendi kullanarak slaytları mikroskop monte edildi. Seçilen yeşil florofor 488 nm'de uyarıldı ve 505-525 nm bir emisyon filtresi kullanılarak görselleştirildi. Benzer şekilde, DAPI 405 nm ve 410-460 nm bir filtre kullanılarak toplanan emisyon de heyecanlandım. Tirozin kinaz, Src aktivitesi is özellikle yüksek dereceli displazi ^12, BE artmıştır. Kolorektal ve prostat kanser hücreleri ^13-15 gözlemler ile uyum içinde, Src inhibisyonu, sitoplazma / çekirdek (oklar, 1C Şekiller 1 ve 1E) hücre zarına (ok başları, 1B Rakamlar gelen β-katenin yeniden yerele sonuçları 1D ve 1F). Bu teknikleri kullanarak, ve diğerleri daha önce Src engellenmesinin aynı zamanda tümör baskılayıcı, p27 ^{kip1 7,16} ve bu yöntemler, şu anda kullanılan laboratuar içinde ekspresyonunu ve sınırlandırılmasını değiştirir göstermiştir.

μ
Şekil 1,. Bir Src kinaz inhibitörü. CP-C (AD) ve CP-D (E, K ile muamele takip immortalized hücre IFG) 24 saat (sağ panel) için, araç (DMSO, sol panel) ya da Src önleyicisinin 1 uM, ski-606 ile muamele edilmiştir. BE hücreler tarif edilen protokole göre sabit ve boyandı. çekirdek DAPI (mavi) ile boyanmış ise β-katenin (yeşil), belirli bir antikor ve Alexa floro 488 birleştirilmiş bir ikincil antikoru kullanılarak görselleştirilmiştir. SKI-606. C, D) ile muamele sonra hücre zarı (ok başları) ile çekirdeğin (oklar) β-katenin için lokalizasyonu için değişiklik not A ve B beyaz kutuları büyütülmüş görsel daha β-değişiklikleri vurgulamak katenin yerelleştirme. Bu görüntüler seçilen hedef için en az bir arka plan ve farklı boyama ile ideal bir boyanma temsil eder. Barlar, 7 um (A, B, D, F), 0.5 um (C, D).

Biz, bu hücreler üzerine hedefleyen terapilerin fizyolojik etkilerini açıklık karşı BE IF hücrelerin uygulanması için bir yöntemi ana hatlarıyla. Biz BE hücrelere karşı bu işlemlerin kullanılmasını tarif etmiş bulunmakla birlikte, bu metodlar da farklı hücre tipleri ^13,17,18 çeşitli için geçerli olduğunu bulduk. Bundan başka, bu işlemler, belirli hedefler için lekeleme optimize etmek için çeşitli yollarla değiştirilebilir.

Biz uygun IF üzerine doğrudan bir etkisi vardır bir parametre tespitin seçimdir bulmak. Biz, yukarıdaki prosedürlerde tespit için% 4 PFA / PBS kullanımını tarif ama alternatif sabitleyici de uygulanabilir. Soğuk metanol ile fiksasyonu (-20 ° C) 20 dakika boyunca PBS ile yıkandıktan sonra, belirli proteinler / ¹³ antikorları için uygundur. Tespiti için soğuk metanol kullanımı hücreleri permeabilize gereksinimini ortadan kaldırır. Ancak, sabitleyici seçimi (% 4 PFA / PBS veya soğuk metanol) deneysel olarak tespit edilmelidir.

Yukarıda özetlenen işlemler tek bir proteinin görselleştirme açıklar; Bununla birlikte, bu yöntem, ilave bir ¹³ hedef tanımlanması için de uyarlanabilir. Optimum için, iki proteinin, özellikle farklı flüoroforlar bağlanmış her bir türü, fark iki farklı türlerin (örneğin, tavşan içinde yetiştirilmiş ve bir ve bir fare) ve ikincil antikor olarak yükseltilmiş birincil antikorlar, gerekli ise. DAPI ile birlikte, yeşil ve kırmızı fluoroforlar, birleştirilmiş ikincil antikorlar, genel olarak birden fazla florofor gelen karışmazlar ek olarak hedefler arasında mükemmel bir kontrast sağlamak. BE IF hücrelerinde iki hedefleri için, aşağıdaki iki tespit birincil ve ikincil antikorlar, kendi sıralı kuluçka yerine getirir. Yıkama ve slaytlar montajı için adımları aynı kalır.

Özet olarak, BE IF hücre için basit ve yararlı bir protokol sağlamaktır. Bu prosedürlerin uygulanması informat verebilirilaç tedavisi, ilgi konusu ektopik genlerin katılmasıyla, ya da hücrelerde ilgi genlerinin RNAi baskılanması etkilerine ilişkin iyon.

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu çalışma St Joseph'in Vakfı (AJF, Lji) ve Amerikan Akciğer Derneği, RG-224607-N (Lji) hibe tarafından desteklenmiştir.