Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett

Il est nécessaire d'améliorer l'information visible sur les moteurs moléculaires de l'oesophage de Barrett. Immunofluorescence est une technique utile pour comprendre les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie cellulaire. Nous présentons un protocole simple et efficace pour l'utilisation de la coloration par immunofluorescence pour évaluer le traitement thérapeutique dans les cellules oesophage de Barrett.

Adénocarcinome oesophagien (EAC) a un taux de survie global de moins de 17% et l'incidence de la CAE a augmenté de façon spectaculaire au cours des deux dernières décennies. L'un des principaux facteurs de risque de la CAE est l'oesophage de Barrett (BE), un changement de métaplasie épidermoïde de l'œsophage normale en réponse à des brûlures d'estomac chroniques. Malgré la connexion bien établie entre CAE et BE, interrogation des événements moléculaires, en particulier les voies de signalisation altérées impliquant progression de BE à EAC, sont mal compris. Beaucoup de ceci est dû à l'absence d'convenable dans des modèles in vitro disponibles pour étudier ces maladies. Récemment, les lignes BE cellulaires immortalisées sont devenus disponibles dans le commerce permettant des études in vitro de BE. Ici, nous présentons une méthode de coloration par immunofluorescence de lignes BE cellulaires immortalisées, permettant la caractérisation in vitro de la signalisation cellulaire et de la structure après exposition à des composés thérapeutiques. L'application de ces techniques se help développer comprendre les mécanismes impliqués dans la progression BE EAC et de fournir des pistes potentielles pour le traitement et la prévention de l'EAC.

L'oesophage de Barrett (BE) est un changement de métaplasie de l'épithélium malpighien normal de l'œsophage et une conséquence de l'exposition chronique à du contenu gastrique résultant de la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO) ^1. BE est pensé pour être un mécanisme de protection en réponse à la DIRD, mais la présence de BE confère un risque accru d'adénocarcinome de l'œsophage (EAC), une maladie qui porte un faible taux de survie significativement ^1. Les estimations actuelles indiquent que jusqu'à 5,6% de la population américaine ont BE, mais comme BE est souvent asymptomatique, on pense que la majorité des BE reste non diagnostiquée ^2. Comme les taux des deux RGO et EAC incidence ont connu une croissance continue ^3, il est devenu important de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de BE à EAC, surtout en ce qui pourrait fournir des approches thérapeutiques vers la prévention de la progression de la BE à l'EAC.

Patient dirigés ont entraîné le paradigme actuel de BE-EAC pathogenèse ^1. L'inflammation chronique, des blessures et des dommages génotoxiques résultant d'une exposition prolongée à contenu gastrique exercent une pression sélective sur la lésion BE promouvoir la progression néoplasique à CAE. Un certain nombre de modifications génétiques ont été identifiées pendant BE à la progression de la CAE. Cependant, malgré cela, il ya un manque de compréhension des changements exacts dans la signalisation cellulaire et les effets subséquents sur la structure et la fonction des cellules.

Immortalisées dans des lignées cellulaires in vitro sont des outils utiles pour étudier les effets de la signalisation cellulaire, en particulier dans l'étude des effets des composés thérapeutiques ciblés. La récente disponibilité commerciale de BE lignées cellulaires immortalisées permet à de telles études. Bien tests à haut débit, tels que les tests de viabilité largement utilisés, peuvent être utiles pour évaluer les effets des thérapies ciblées sur la prolifération cellulaire et survival ^4-6, ces dosages ne sont pas utiles pour interroger les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie des cellules. Immunofluorescence (IF) est une technique utile pour étudier les effets des thérapies ciblées sur les caractéristiques morphologiques, la croissance et la survie des cellules et des protéines qui sont impliquées. Notre laboratoire a adapté ces méthodes vers des lignes BE cellulaires immortalisées, en utilisant SI pour évaluer les effets d'un médicament cliniquement disponibles sur des lignées cellulaires de BE dans l'espoir de délimiter un éventuel traitement chimiopréventifs et biomarqueur pour le traitement de la drogue ^7. De même, l'application de ces techniques dans la CAE, BE et les lignées cellulaires immortalisées de l'œsophage a délimité conclusions critiques concernant BE à la progression de la CAE ^8-10. Nous trouver si l'analyse de cellules être traités avec des thérapies ciblées a de la valeur, ce qui permet pour la caractérisation des changements dans la structure de la cellule et la localisation des protéines. Ici, nous présentons nos méthodes de SI de immortalisées être des cellules à characterize traitement de la toxicomanie.

1. Entretien Cell ligne

1. Humaine immortalisée BE dysplasiques de haut grade (CP-B, CP-C, CP-D) et métaplasique (CP-A) des lignées de cellules par transfection stable de la télomérase humaine transcriptase inverse (TERT) protéine ^11.
2. Maintenir BE lignées cellulaires dans un milieu de kératinocytes supplémenté avec de l'extrait de bovin pituitaire (BPE), le facteur de croissance épidermique (EGF), 5% de sérum bovin fœtal (FBS), acides aminés non essentiels (NEAA), de la pénicilline-streptomycine-néomycine (PSN), et la norme conditions de culture de tissus (37 ° C, 5% CO _2, 98% d'humidité).

2. ÊTRE cellulaire Plaquage

1. Préparation de 12 puits plaque / lamelles. Placez les lamelles 18 mm dans un plat et autoclave Petri verre. Transfert autoclavé 18 lamelles de verre mm dans une boîte de culture tissulaire à 12 puits en utilisant une pipette en verre stérile fixée à un tube à vide. Laver la lamelle avec du PBS stérile et médias.
2. Trypsiniser et compter les cellules d'être immortalisé. Compter les cellules using un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre. Diluer les cellules dans un milieu de culture à une concentration de 20.000-40.000 cellules / ml.
3. Placer 1 ml de cellules dans chaque puits contenant une lamelle couvre-objet pour un nombre total de cellules de 20.000-40.000 cellules / puits.
4. Utilisation d'une pointe de pipette stérile pour pousser doucement la lamelle au fond du puits afin d'assurer que les cellules se fixent à la lamelle couvre-objet.

3. Traitement de la toxicomanie de cellules soient

1. Diluer médicament sélectionné dans (37 ° C) médias chauds à la concentration souhaitée et bien mélanger en inversant le tube à plusieurs reprises ou en utilisant un mélangeur vortex. Concentrations de médicament déterminée empiriquement. Commencer le traitement 24 heures après l'ensemencement initial des cellules BE pour permettre aux cellules de fixation sur la lamelle
2. A titre de comparaison et de contrôle, traiter une lamelle supplémentaire de cellules de BE avec 0,1% de véhicule (diméthylsulfoxyde [DMSO] ou agent utilisé pour solubiliser composé) dilué dans un milieu de culture. plaque d'étiquettes avec un stylo de laboratoire pour identifier le médicament et vecule échantillons traités. Placez les cellules dans un incubateur de culture cellulaire mis à 37 ° C, 5% de CO _2, 98% d'humidité et incuber pendant des moments souhaités.

4. Immunofluorescence

1. Fixation
   1. A la suite du temps d'incubation désirée du traitement médicamenteux, aspirer le support et laver les lamelles rapidement avec 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) à température ambiante (TA, 25 ° C).
   2. Aspirer le PBS et ajouter 1 ml de PBS contenant 4% de PFA [PFA à 4% / PBS] à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 30 min.
   3. Aspirer le PFA 4% / PBS et laver le couvre-3x, 5 min chacun avec PBS à température ambiante. lamelles de magasins pour une semaine en PBS contenant 0,1% de PFA à 4 ° C si vous le souhaitez.
2. Perméabilisation / blocage
   Perméabiliser les cellules PFA fixes pour permettre à l'anticorps pour accéder aux cibles intracellulaires. Pour extracellulaire surface des protéines, effectuer toutes les étapes ultérieures sans saponine ajouté à la solution de BSA 1x PBS/0.5 de%.
   1. Réduire le fond par incubation avec 50 mM de NH ₄ Cl dilué dans du PBS pendant 10 min à température ambiante et laver avec du PBS une fois que la température ambiante pendant 5 min.
   2. Incuber être des cellules pendant 30 min à 100 à 300 pi de PBS contenant 0,1% de saponine et 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA). Diluer la saponine de filtre stérilisé 10% stock, préparé dans l'eau et conservé à 4 ° C.
   NOTE: Ceci empêche la liaison non spécifique des anticorps dirigés contre des protéines cellulaires par des lamelles de blocage dus à l'addition de 0,5% de BSA. En variante, substituer BSA avec du sérum de chèvre dilué à 5% pour réduire la liaison non spécifique d'anticorps.
3. Préparation de la Chambre humain
   1. Préparer un plat carré d'essai biologique en superposant le fond de la chambre avec des serviettes en papier humide et placez une couche de Parafilm sur le dessus.
   2. Transférer délicatement les lamelles, les cellules orientées vers le haut, sur le Parafilm aide d'une pince et une aiguille de seringue.
   3. Marquer le Parafilm avec un stylo de laboratoire pour identifier les lamelles.
4. Anticorps primaire incubation
   1. Diluer l'anticorps primaire dans du PBS contenant à la fois 0,5% de BSA et 0,1% de saponine.
   2. Épongez délicatement la solution de blocage à l'aide d'un tissu de laboratoire et ajouter 100 ul de la solution d'anticorps primaire. Incuber l'anticorps primaire sur les cellules de BE pendant une nuit à 4 ° C.
5. Incubation de l'anticorps secondaire
   1. Laver les lames 3x avec PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine pour 5 min chacune à la température ambiante.
   2. Diluer l'anticorps secondaire conjugué à un marqueur fluorescent dans PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine que l'anticorps secondaire reconnaît l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été soulevée.
   3. Ajouter 100 ul d'anticorps dilué à chaque lamelle. Incuber l'anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante.
6. Laver et montage de lamelles couvre-
   1. Laver le couvre-3x, 5 min chacun dans PBS/0.5% BSA/0.1% de saponine. Éliminer le tampon de lavage et ajouter 100 à 300 pi de PBS aux lamelles couvre-objet.
      REMARQUE: Pour une double lutte contrecoloration du corps, répétez les étapes 4.4 à 4.5 avec l'anticorps primaire et secondaire supplémentaire souhaitée selon les modalités détaillées dans la discussion.
   2. En utilisant des pinces, soulever délicatement la lamelle et éponger la PBS en utilisant un tissu de laboratoire ou une serviette en papier.
   3. Ajouter 15 ul d'un milieu de montage anti-décoloration approprié contenant 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour inverser la lamelle couvre-objet et la lamelle couvre-objet, des cellules vers le bas, sur une lame de microscope en verre.
   4. Placer les lames dans un dossier de la lame et incuber abri de la lumière directe du jour au lendemain à la température ambiante pour permettre le support anti-décoloration dur mis à guérir, selon les instructions du fabricant. Une fois le support anti-décoloration a mis, diapositives peuvent être conservées à 4 ° C ou -20 ° C jusqu'à ce que la visualisation microscopique.

5. Visualisation microscopique des lamelles couvre-

Les cellules colorées peuvent être visualisés par l'intermédiaire soit microscopie confocale ou un SI microscop verticale capablee. Bien que la microscopie confocale fournit des images haute résolution à des profondeurs discrètes, un microscopique verticale est capable de produire des images utiles plus rapidement. Par souci de concision, un procédé d'imagerie souillé BE cellules par microscopie norme est présentée. En général, à l'image de l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou similaires fluorophores (par exemple la protéine verte fluorescente), le rouge Texas et DAPI, nécessite un microscope avec des filtres capables de discriminer ces fluorophores. Vérifiez le microscope avant de commencer le protocole pour déterminer fluorophores compatibles.

1. Imagerie sur un microscope standard IF
   1. Retirer stockées diapositives / lamelles couvre-objet à partir de -20 ° C ou à 4 ° C et leur permettre de se réchauffer jusqu'à la température ambiante. Mise sous tension et microscope lampe à arc au mercure.
   2. Placez lame de microscope avec lamelle orientée vers l'objectif sur la platine du microscope. Pour l'utilisation d'un objectif à immersion d'huile, ajouter une goutte d'huile d'immersion sur la lamelle.
   3. Sélectionnez le filtre DAPI et ouvrir l'obturateur.
   4. Concentrer l'objectif tout en regardant à travers les oculaires jusqu'à ce que l'image apparaît. Comme toutes les cellules se colorent au DAPI, les noyaux doivent être facilement observable.
   5. Recueillir des images en utilisant un logiciel de traitement d'image respective.

Un exemple des résultats obtenus à partir de l'application des procédures décrites, est illustrée sur les figures 1A-D. Lamelles couvre avec CP-D et cellules BE CP-C ont été traités pendant 24 heures avec 1 uM de l'inhibiteur de Src de la famille, SKI-606, ou d'un véhicule (DMSO) et colorées en utilisant les procédures ci-dessus pour la jonctions adhérentes et signalisation Wnt protéine, β -caténine. Visualisation de β-caténine a été obtenue par marquage avec un anticorps anti-IgG de lapin couplé à un fluorochrome vert, tandis que l'étiquetage du noyau de la cellule a été réalisée par un marquage au DAPI (bleu). Lamelles ont été montées sur des lames de microscope en utilisant dur kit de montage et les cellules ont été imagées par microscope à balayage laser confocal utilisant un objectif 63X/1.4N le plan-apochromatiques. Le fluorophore vert choisi était excité à 488 nm et visualisée en utilisant un filtre d'émission à 505-525 nm. De même, DAPI est excité à 405 nm et une émission recueillies à l'aide d'un filtre à 410-460 nm. Activité de la tyrosine kinase, Src is ont augmenté en BE, en particulier dans dysplasie de haut grade ^12. En concordance avec les observations in colorectal et de la prostate ^{de 13 à 15} cellules cancéreuses, l'inhibition de Src en résulte relocalisation de la β-caténine dans le cytoplasme / noyau (flèches, les figures 1A, 1C, 1E et) à la membrane cellulaire (pointes de flèches, les figures 1B, 1D, et 1F). Grâce à ces techniques, et d'autres que nous avons précédemment montré que l'inhibition de Src modifie également l'expression et la localisation du gène suppresseur de tumeur, p27 ^{Kip1 7,16} et ces méthodes sont couramment utilisées dans notre laboratoire.

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Figure 1. SI de cellules immortalisées après un traitement par un inhibiteur de la kinase Src. CP-C (AD) et CP-D (E, F) Ont été traités avec le véhicule (DMSO, panneaux de gauche) ou 1 uM de l'inhibiteur de Src, SKI-606, pendant 24 heures (panneaux de droite). BE cellules ont été fixées et colorées selon le protocole décrit. β-caténine (vert) a été visualisé en utilisant un anticorps spécifique et un anticorps secondaire couplé à l'Alexa Fluro 488, tandis que le noyau a été coloré avec du DAPI (bleu). Notez le changement dans la localisation de β-caténine dans le noyau (flèches) à la membrane cellulaire (têtes de flèche) après un traitement par SKI-606. C, D) des images agrandies de cases blanches en A et B, mettre davantage en évidence les changements de β- caténine localisation. Ces images représentent coloration idéale avec un fond minimal et coloration distincte pour la cible choisie. Bars, 7 pm (A, B, D, F), 0,5 pm (C, D).

Nous avons décrit une méthode pour l'application de l'IF de cellules de BE à élucider les effets physiologiques des thérapies ciblées sur ces cellules. Alors que nous avons décrit l'utilisation de ces procédures à l'égard des cellules de BE, nous avons constaté que ces procédés sont également applicables à une variété de types cellulaires différents ^13,17,18. En outre, ces procédures peuvent être modifiées de plusieurs façons d'optimiser coloration pour des objectifs spécifiques.

Nous trouvons un paramètre qui a un effet direct sur bon SI est le choix de la fixation. Nous avons décrit l'utilisation de 4% PFA / PBS pour la fixation dans les procédures ci-dessus mais fixateurs alternatifs sont également applicables. Fixation avec du méthanol froid (-20 ° C) pendant 20 minutes après lavage avec du PBS est approprié pour certaines protéines / anticorps ^13. L'utilisation de méthanol froid pour la fixation nie la nécessité de perméabiliser les cellules. Cependant, le choix du fixateur (PFA à 4% / PBS ou du methanol froid) doit être déterminée de manière empirique.

Les procédures décrites ci-dessus décrivent la visualisation d'une protéine unique; Mais cette méthode est facilement adaptable à l'identification d'une cible supplémentaire ^13. Pour optimiser la SI de deux protéines, les anticorps primaires soulevées dans deux espèces différentes (par exemple, celle soulevée dans lapin et un chez la souris), et des anticorps reconnaissant spécifiquement secondaires chaque espèce, couplés à des fluorophores différents, sont nécessaires. Des anticorps secondaires couplés à des fluorophores verts et rouges, combinées avec du DAPI fournissent un excellent contraste entre les cibles, en plus d'éviter les interférences généralement de multiples fluorophores. Car si deux cibles dans les cellules de BE, effectuer une incubation séquentielle de deux anticorps primaires et secondaires de leur respectives après la fixation. Étapes de lavage et de montage de diapositives restent les mêmes.

En résumé, nous proposons un protocole simple et utile pour SI de cellules BE. L'application de ces procédures peut donner information en ce qui concerne les effets d'un traitement médicamenteux, l'introduction de gènes d'intérêt ectopiques, ou la régulation négative de l'ARNi des gènes d'intérêt dans des cellules de BE.

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Ce travail a été soutenu par des subventions du St, la Fondation Joseph (AJF, LJI) et l'American Lung Association, RG-224607-N (LJI).